过去几十年,抗生素对反刍动物生产做出了巨大贡献,但随着消费者健康意识的提高,与使用抗生素相关的细菌耐药性和动物产品药物残留问题备受关注。因此,我国农业农村部第194号公告提出,自2020年7月1日起,饲料中全面禁止添加抗生素[1]。全面禁抗是大势所趋,寻找天然替抗产品的需求也随之而来,理想的替抗产品应具有抗菌活性、提高营养物质消化吸收及促生长等作用[2]。
益生元是一种能被宿主微生物选择性利用,并对宿主健康产生益处的物质,具有调节肠道健康、提高免疫力、调节矿物元素吸收、调节脂质代谢、抗癌等多种生物学功能[3],在反刍动物相关研究和应用中取得了积极效果,是一种可供选择的替抗产品。根据化学结构与组成,可将益生元分为碳水化合物和非碳水化合物2类,其中以碳水化合物类益生元研究与应用最为广泛。本文聚焦碳水化合物类益生元,阐述了益生元的概念、生理功能和作用机制及其在反刍动物中研究的最新进展,以期为益生元在反刍动物中的进一步应用提供参考。
1 益生元的概述和生理作用
1.1 益生元的概念
益生元具有耐保存、耐高温制粒、耐酸碱等优点,广泛存在于洋葱、芦笋、大蒜、菊苣、菊芋、燕麦和小麦等植物中[6⇓-8],根据化学结构与组成可分为碳水化合物和非碳水化合物2类,目前研究最多的是碳水化合物类益生元,包括3类:1)多元醇:乳果糖、乳糖醇、木糖醇、甘露醇等[5]。2)功能性低聚糖:低聚果糖(FOS)、菊粉(INU)、低聚半乳糖(GOS)、甘露低聚糖(MOS)、低聚木糖(XOS)、低聚异麦芽糖(IMO)、大豆低聚糖(SOS)、低聚乳果糖(LACT)、壳聚糖(COS)、棉子糖、水苏糖等[8⇓-10]。3)膳食纤维:抗性淀粉(RS)、β-葡聚糖、糊精、果胶、木质素等[5]。非碳水化合物类益生元有矿物质、多酚类物质、脂肪酸等[5]。本文的论述集中在碳水化合物类益生元。
1.2 益生元的生理作用
1.2.1 维持肠道屏障完整性
1.2.2 调节肠道微生物群落的数量和组成
单胃动物的后肠道及反刍动物瘤胃内均存在着大量微生物群落,微生物可与动物机体建立稳定的共生关系,是宿主的重要组成部分[16]。肠道微生物生长的能量来源有2个,一是对宿主内源性分泌物(如黏蛋白)的利用,二是从饮食中获取,后者是其主要能量来源[17]。另外,研究表明,饮食中的不可消化碳水化合物可改变肠道微生物群落的数量和组成[18],因此,改变饮食,尤其是改变饮食中不可消化碳水化合物成分是改变肠道微生物组成和功能的一种有效方法[17]。益生元即是一种无法被宿主消化但能被某些肠道细菌选择性发酵的物质,可刺激包括双歧杆菌、乳酸杆菌在内的特定有益菌的生长[4],而大肠杆菌、沙门氏杆菌等有害菌则因无法利用益生元或利用效率低而死亡[10],从而使宿主肠道健康得到改善。研究表明,IMO、XOS、INU和FOS均可促进双歧杆菌的生长[17,19⇓-21]。益生元在肠道中被特定细菌利用后会产生短链脂肪酸(SCFAs)和气体,这些物质可影响消化道的运动和发酵特性,增加粪便排出量,从而改善便秘[22]。SCFAs对肠道健康至关重要,它们的活性随后还会影响肠道以外的身体部位,起到调节食欲、能量代谢、免疫功能、血脂水平和肾脏生理功能等作用[22⇓-24]。
1.2.3 免疫调节功能
此外,SCFAs还可通过以下3种途径调节肠上皮细胞(IECs)内信号通路,最终改善宿主免疫性能。1)激活G蛋白偶联受体表达,并激活下游信号通路,如丝裂原活化蛋白激酶、信号转导和转录激活因子3和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白。2)组蛋白去乙酰化酶抑制。3)形成炎症小体[12]。
除调控IECs内信号通路外,SCFAs还可调节肠道相关免疫细胞的功能。研究证明,SCFAs对肠道树突状细胞(DCs)、巨噬细胞和调节性T细胞(Tregs)等具有有益作用。DCs是抗原呈递细胞,在调节外来和自身抗原的免疫反应中起重要作用。研究证实,INU型果聚糖等益生元可通过Toll样受体、NOD样受体、C型凝集素受体和半乳糖凝集素靶向作用于肠道DCs,促进抗炎细胞因子释放[30]。巨噬细胞战略性定位于肠道上皮下部区域,擅长吞噬和清除潜在有害微生物、凋亡细胞和细胞碎片。研究表明,在大鼠饲粮中添加FOS和INU后,腹腔中巨噬细胞活性增加,具体表现为超氧阴离子生成增加和吞噬能力增强[31]。Tregs是T细胞的一个亚群,由初始T细胞产生,通常位于与环境交界的黏膜表面。研究表明,给非肥胖糖尿病小鼠饲喂益生元后,其体内Tregs活性增加[32]。
1.2.4 促进矿物质元素吸收
矿物质元素是七大营养素之一,在维持动物机体正常生理功能方面起重要作用。机体内矿物质吸收的主要场所在小肠近端(十二指肠下方和结肠上方),其吸收率直接受肠道细菌发酵及其他化学变化的影响[35]。研究表明,INU、FOS、GOS、SOS等对钙、镁、铜、铁、锌等的吸收和代谢具有促进作用[36]。益生元可通过产生SCFAs促进肠道内容物酸化,从而增加矿物质在肠道中的溶解度,这反过来又促进短链脂肪酸盐化合物形成,使矿物质更易被吸收[37]。益生元还有助于增加矿物质吸收的表面积[36],促进钙结合蛋白的表达[38],并分解植酸-矿物质复合物,释放出结合的矿物质[39]。此外,益生元可以释放某些食物中的植物雌激素等骨调节物质,促进骨骼发育[40]。
Maisa等[41]研究大豆饮料中添加FOS对刚断奶大鼠钙、铁吸收的影响,结果表明,FOS可以改善钙和铁的吸收过程,并对十二指肠中血红蛋白和二价金属转运蛋白1的表达具有积极影响。Weaver等[42]比较几种添加剂对断奶大鼠钙吸收的影响,发现INU、FOS混合物显著提高了钙利用率,INU及INU和FOS混合物提高了股骨钙含量。据报道,在5~6周龄仔猪饲粮中添加INU可提高其铁储存蛋白基因的表达,提高仔猪对铁的利用效率[43]。在每千克饲粮中添加100 g INU,大鼠对铁、铜的吸收量显著提高[39]。Raschka等[44]证实INU(每千克饲粮中添加100 g)对大鼠铁、锌的吸收具有促进作用。Lobo等[45]报道,在含钙饲粮(每千克饲粮含7.5 g钙)中添加50 g FOS可增加大鼠对镁的吸收量,干预3周后,股骨和胫骨中镁含量不受影响。
1.2.5 调节脂质代谢
据报道,在喂食高脂肪饲粮中补充INU可通过调节小鼠肠道微生物群来减轻脂肪积累[51],INU可选择性促进双歧杆菌和乳酸杆菌生长,这些有益菌有助于降低血液胆固醇含量,减少体重增加[52]。一项研究评估了功能性低聚糖(包括INU、LACT、GOS和水苏糖)与益生菌联合使用的降胆固醇能力,结果表明GOS降胆固醇效果最好,降低了50%,其次是水苏糖(47.19%)、LACT(44.60%)、INU(22.71%)[53]。Miao等[54]给妊娠期糖尿病小鼠喂食高糖高脂饲粮后再采用INU型果聚糖介入治疗,发现INU型果聚糖可改善高糖高脂饲粮诱导的糖和脂代谢参数紊乱,缓解机体脂肪积累和葡萄糖耐受不良。Aoe等[55]比较了高分子质量大麦β-葡聚糖(HMW-BG)和低分子质量大麦β-葡聚糖(LMW-BG)对食用中等脂肪饲粮小鼠糖和脂代谢的影响,结果表明,2组小鼠总胆固醇、低密度脂蛋白含量和胆固醇调节元件结合蛋白1c的mRNA表达水平显著降低;HMW-BG在抑制脂肪吸收、减少腹部脂肪沉积方面具有特异性作用,LMW-BG在增加双歧杆菌和拟杆菌数量及盲肠总SCFAs、醋酸盐和丙酸盐含量方面具有特异性作用。
1.2.6 抗癌作用
2 益生元在反刍动物中的应用
2.1 提高生长性能
提高动物生长性能是畜牧产业的重要目标,平均日增重(ADG)是评估生长性能的重要指标之一,ADG与采食量及营养物质消化、吸收、利用率等因素有关。众多研究表明,益生元可在一定程度上提高新生及幼龄反刍动物生长性能。一项针对断奶前犊牛的研究表明,在犊牛饲粮中添加富含MOS的酵母培养物可提高其生长性能,具体表现为试验第7~56天期间,益生元组犊牛ADG比对照组提高19 g,第42~56天期间提高85 g[65]。Jonova等[66]在犊牛饲粮中添加INU(每0.5 kg大麦粉饲粮中添加6 g INU),发现试验全期INU组犊牛ADG和总增重均极显著高于对照组。Chang等[67]将24头新生荷斯坦母犊牛随机分为饲粮中添加10 g/d GOS组和不添加GOS组,结果表明,GOS显著提高了犊牛的ADG和饲料利用效率。Liu等[68]将30只7日龄湖羊分为2组,分别饲喂添加和不添加0.2% MOS的代乳剂至28日龄,结果表明,MOS显著提高羔羊对有机物(OM)、粗蛋白质(CP)、粗脂肪(EE)、钙、磷的表观消化率。Dias等[69]探究COS对放牧阉牛采食量、营养物质总表观消化率的影响,结果表明,COS线性提高肉牛采食量及CP和EE的表观消化率。但另一项研究表明,COS对以青贮饲料为基础饲粮的肉牛CP的表观消化率有负面影响[70],这可能与肉牛采食结构和COS添加量不同有关。Cherdthong等[71]在饲喂低品质粗饲料的泰国本土肉牛饲粮中添加0、1.6、3.1和4.7 g/d的β-葡聚糖,结果表明,补充1.6~4.7 g/d β-葡聚糖对干物质(DM)、OM、CP、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的摄入量没有影响;然而,与未添加β-葡聚糖相比,添加β-葡聚糖显著提高了稻草采食量,且总采食量随着β-葡聚糖添加量的增加而增加。Estrada-Angulo等[72]发现,在育成羔羊饲粮中添加3 g/d益生元(MOS和β-葡聚糖的混合物)对ADG没有影响,但饲料利用效率和饲料净能分别提高了4.6%和5.9%。以上研究结果说明,益生元可在一定程度上改善反刍动物对饲粮中营养物质的消化、吸收效率,提高ADG,从而提高其生长性能。
2.2 提高生产性能
产奶性能和产肉性能是反刍动物生产过程中2项重要的生产性能指标。Wang等[74]将16头奶牛随机分为2组,在试验组奶牛基础饲粮中添加200 g/d INU,发现试验组奶牛产奶量、乳蛋白、乳糖率和乳中饱和脂肪酸比例显著提高,乳中不饱和脂肪酸比例显著降低。另一项针对泌乳中期荷斯坦奶牛的研究也表明,在奶牛饲粮中添加0、50、150、200、250和350 g/d INU,随着INU添加量的增加,产奶量和乳脂肪含量线性升高,乳尿素氮含量和体细胞数(SCC)线性降低,牛奶中饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸比例线性增加,然而,牛奶中单不饱和脂肪酸含量线性降低[75]。Gomes De Paiva等[76]选取体重相近的奶牛,在其饲粮中分别添加0、75、150和225 mg/kg BW的COS,结果表明,225 mg/kg BW的添加量可显著提高产奶量,此外,COS线性增加了乳脂、乳蛋白和乳糖含量。但Seankamsorn等[77]研究表明,添加COS对奶牛产奶量和乳成分没有显著影响,原因可能是2项研究中COS的来源和添加量不同。Xia等[78]探究在围产期奶牛饲粮中添加β-1,3-葡聚糖对其泌乳性能的影响,结果显示,乳糖、乳脂肪、乳蛋白等成分的产量未受影响,但产奶量线性提高,产后第21天乳中SCC显著降低,乳品质得到改善。Dong等[79]研究表明,在泽西牛饲粮中添加25 g/d XOS可显著提高乳蛋白、乳脂肪含量和产奶量。以上结果表明,益生元有助于提高产奶量,且对改善乳成分、乳品质有积极影响。
2.3 改善瘤胃健康
2.3.1 瘤胃发酵参数
瘤胃是反刍动物的特有器官,其内环境稳定密切影响反刍动物的健康、福利和生产性能。评价瘤胃发酵的主要参数有瘤胃液pH、氨态氮(NH3-N)、MCP和VFA。
瘤胃液pH是反映瘤胃稳定性直观且重要的指标,健康反刍动物瘤胃液pH的正常范围是6.0~7.3,当pH低于5.0或高于7.8时,微生物生长受到抑制,营养物质消化、吸收受到负面影响[84]。体外试验证明,添加MOS对绵羊瘤胃液pH没有影响[85]。Garcia Diaz等[86]探究在绵羊高谷物饲粮中添加MOS(2 g/kg DM)对瘤胃发酵参数的影响,发现对照组瘤胃液pH平均值为5.18,MOS组瘤胃液pH显著高于对照组,平均值为5.34,但这一结果并不能证明MOS对瘤胃pH有稳定作用,因为试验组最高的瘤胃液pH(5.50)仍低于6.0。Zhao等[75]在泌乳中期荷斯坦奶牛饲粮中添加0、50、150、200、250和350 g/d INU,随着INU添加量增加,pH呈下降趋势。类似的,Wang等[87]在亚临床乳房炎奶牛饲粮中添加INU,发现瘤胃液pH显著下降。Cherdthong等[71]发现,在肉牛饲粮中添加β-葡聚糖对瘤胃液pH没有影响。Dias等[69]报道,添加COS对放牧阉牛瘤胃液pH没有影响。而Kirwan等[70]研究表明,添加COS(10 g/kg DM)可显著提高瘤胃液pH。
NH3-N和MCP是评估反刍动物对饲粮中可发酵营养物质利用率的重要指标,NH3-N是合成MCP的重要氮源。Dias等[69]研究表明,添加COS(0、400、800、1 200、1 600 mg/kg DM)对放牧阉牛MCP的合成有二次影响,可促进MCP合成,以添加量为800 mg/kg DM时影响最大。Seankamsorn等[77]则报道称,在奶牛饲粮中添加2% COS对NH3-N含量和MCP合成没有影响。Zhao等[75]发现随着奶牛饲粮中INU添加量(0、50、150、200、250、350 g/d)的增加,瘤胃中NH3-N含量显著下降,这可能与MCP合成增加有关。Cherdthong等[71]报道,肉牛饲粮中添加β-葡聚糖对瘤胃NH3-N含量没有影响。
VFA是反刍动物能量的重要来源,通过瘤胃吸收后可提供机体所需能量的60%~70%[88]。VFA包括乙酸、丙酸、丁酸和一些支链脂肪酸,前三者占总VFA的95%左右,其中,丙酸可通过糖异生作用生成单糖[89]。Dias等[69]发现,在放牧肉牛饲粮中添加COS可线性提高丙酸含量,对总SCFAs含量没有影响。Seankamsorn等[77]报道,在奶牛饲粮中添加2% COS显著降低了瘤胃中乙酸和丙酸的比值。Tian等[90]研究发现,在育肥肉牛低精料饲粮中添加2% INU可提高丙酸盐、丁酸盐和异丁酸盐含量,并改善肉牛生长性能。类似的,Zhao等[75]发现,随着奶牛饲粮中INU添加量的增加,瘤胃中乙酸、丙酸和丁酸含量呈升高趋势。
2.3.2 微生物区系
反刍动物瘤胃中定植着大量微生物,这些微生物可直接影响机体营养物质消化、代谢和免疫功能[91]。Wang等[87]给患有亚临床乳房炎奶牛饲喂0、100、200、300和400 g/d INU,发现产生丙酸和丁酸的细菌,如普雷沃氏菌和丁酸弧菌和几种有益的共生细菌如Muribaculaceae和双歧杆菌数量增加,而一些促炎细菌,如梭状芽胞杆菌UCG-014、链球菌和埃希氏菌数量减少。Chang等[67]在新生荷斯坦犊牛饲粮中添加10 g/d GOS,发现与对照组相比,长期食用GOS增加了瘤胃中普雷沃氏菌和乳酸杆菌的相对丰度。一般情况下,瘤胃液中的主要菌属为琥珀酸链球菌属,Jung等[92]在瘤胃液培养基中加入RS后,链球菌属立即成为优势菌属,随后又被乳杆菌属取代,双歧杆菌属可以被连续观察到。从以上研究结果可看出,益生元可通过促进双歧杆菌、乳酸杆菌、普雷沃氏菌等有益菌的生长改善瘤胃环境。
2.3.3 甲烷(CH4)排放
全球气候变化主要由温室气体排放引起,畜牧业是温室气体的重要来源,占温室气体总排放量的14.5%,畜禽排放的温室气体主要有CH4、一氧化二氮(N2O)和二氧化碳(CO2),其中CH4的主要来源是反刍动物。CH4是反刍动物胃肠道,特别是瘤胃内厌氧微生物发酵过程的最终产物,其排放不仅影响反刍动物生产性能还会造成环境压力加剧,是一个亟待解决的生产问题[93]。体外发酵试验表明,低碳高INU饲粮(玉米谷物41.5%、脂肪粉14.4%、INU 18.9%)可显著降低断奶山羊CH4排放量[94]。而Jonova等[93]研究表明,饲喂添加INU(每0.5 kg大麦粉中添加6 g INU)对犊牛CH4产量没有影响。Seankamsorn等[77]研究表明,在泌乳奶牛饲粮中添加2% COS可显著降低CH4产生量。另有研究结果表明,在奶牛饲粮中添加25 g/d XOS可显著降低CH4排放量[79]。Wang等[95]采集湖羊瘤胃液进行体外发酵试验,分别在基础饲粮中添加0、0.2%、0.8%、1.2%、1.8%和2.4% FOS进行发酵,发现FOS添加量与CH4产量呈二次曲线关系,且1.2% FOS处理组CH4产量显著低于其他FOS处理组。由以上研究结果可看出,益生元对CH4生成量的影响并不一致,影响机制也有待进一步研究。
2.4 改善肠道健康
肠道是营养物质消化和吸收的主要场所,肠道健康与动物生长发育和生产性能密切相关。Lucey等[65]发现,给新生犊牛饲喂富含MOS的酵母培养物可显著降低其粪便中致病性大肠杆菌数量。Yang等[96]报道,饲粮中添加0.06% BW的MOS对新生山羊回肠绒毛高度、隐窝深度和二者比值没有影响,但能显著提高回肠食糜分泌型免疫球蛋白A含量;此外,添加MOS组大肠杆菌相对丰度有降低趋势,说明添加MOS能抑制致病菌在黏膜上皮的黏附和定植。Alves Costa等[97]发现,犊牛饲粮中添加5 g/d MOS可显著提高其空肠绒毛高度。体外试验证明,饲粮中添加INU可显著提高羔羊回肠组织中免疫球蛋白及炎症因子干扰素-γ(IFN-γ)和IL-10分泌量[94]。Jonova等[98]研究发现,给犊牛补充INU(6 g/d)可显著提高其十二指肠中段黏膜厚度、空肠末端黏膜厚度、空肠末端全肠壁厚度。Luo等[99]报道,饲粮中添加β-葡聚糖可增加犊牛肠道菌群丰富度和产SCFAs菌属(如拟杆菌属)相对丰度,并通过降低厚壁菌门和拟杆菌门的比值改善肠道屏障。从以上研究结果来看,益生元可通过增加肠道屏障完整性、调节肠道菌群组成和提高肠道细胞免疫活性改善反刍动物肠道健康。
3 未研究领域
众多体外及体内试验已证明益生元对动物机体具有有益作用,但一些研究领域的欠缺仍制约着益生元在反刍动物生产乃至整个畜牧业生产的应用。第一,各类益生元在不同物种中的适宜添加量仍需进一步明确。研究表明,小鼠长期摄入INU后肝脏功能严重受损,并引发肝癌[100],说明益生元的过度使用将对机体产生副作用,同时,各类益生元对动物产生有益效应的最低剂量也需深入研究。第二,益生元改善畜禽生产性能和生理功能的作用机制还有待深入研究。以益生元对动物肠道菌群的影响为例,以后的研究应当容纳不同物种、不同生理状态、不同养殖条件、不同肠道位置的大量样本,并应用多组学技术和高通量测序等生物技术,提高机制研究的广度和深度[101]。第三,应进一步探究多种益生元同时使用的协同与拮抗作用。不同益生元聚合度、化学结构不同,所增殖的有益菌种类也不同,就肠道有益菌而言,其对益生元的利用也不同,由此,当不同益生元同时使用时就有可能发生协同或拮抗作用,这需要在具体研究中进行探究与证实。
4 小结与展望
随着我国牛羊规模化集约养殖的范围逐步普遍化,寻找反刍动物养殖中所需的新的、有益的抗生素替代品具有重要意义与紧迫性。益生元是一种具有调节肠道健康、改善免疫性能、调节糖和脂代谢、改善矿物质吸收、抗癌等多种生理功能的饲料添加剂,是一种理想的替抗产品。现有的体外及体内试验也表明,在反刍动物饲粮中添加益生元对改善其生长、生产性能及胃肠道健康具有正面效果,但是适宜添加量不明确、机制研究不深入等问题仍制约着益生元在反刍动物生产乃至整个畜牧业生产中的应用,随着相关研究的深入和多组学技术、高通量测序等生物技术的发展,益生元在反刍动物生产中更精准、高效的应用有望被进一步推进。