乳铁蛋白(lactoferrin)是一种来自哺乳动物先天免疫系统的非血红素糖蛋白[1],是乳清蛋白中的主要成分,具有免疫调节、抗病毒、抗菌和抗氧化等多种生物活性,有助于维护和促进人类的健康和生活质量[2-3]。乳铁蛋白广泛存在于动物的许多生物分泌物中[4],如泪液、唾液、汗液、胰液和乳液等(表1),尤其是在初乳和牛奶中特别丰富[1],其分子质量约为80 ku,由700个氨基酸残基组成,二级结构呈2枚“无柄银杏叶型”结构[5]。
表1 生物体不同来源分泌物中乳铁蛋白的浓度Table 1 Concentrations of lactoferrin in secretions from different sources of organismsmg/mL |
| 来源 Sources | 乳铁蛋白浓度 Concentrations of lactoferrin | 来源 Sources | 乳铁蛋白浓度 Concentrations of lactoferrin | |
|---|---|---|---|---|
| 骆驼乳 Camel milk | 0.59~1.42[6] | 人类精液 Human semen | 0.40~1.90[7] | |
| 人乳 Human milk | 1.00~5.00[8] | 人子宫分泌物 Human uterine secretion | 0.50~1.00[9] | |
| 马乳 Mare milk | 0.20~2.00[9] | 人鼻腔分泌物 Human nasal secretion | 约0.20[9] | |
| 牛乳 Cow milk | 0.10~0.40[10] | 人血液 Human blood | 0.01×10-3~3.5×1 [6] | |
| 山羊、绵羊乳 Goat and sheep milk | 0.02~0.20[9] | 人滑液 Human synovia | 0.01~0.08[11] | |
| 兔子、狗、老鼠乳 Rabbit, dog and mouse milk | <0.05[8] | 人羊水 Human amniotic fluid | 2×10-3~32×1 [6,9] | |
| 人初乳 Human colostrum | >7.00[6] | 成人唾液 Adult saliva | 1×10-3~5×1 [7,9] | |
| 人乳 Human milk | 1.00~3.00[6] | 人尿 Human urine | 约1.50[9] | |
| 成年人眼泪 Adult tears | 1.14~1.78[12] | 成年人支气管黏液 Adult bronchial mucus | 35.2[11] |
乳铁蛋白最显著的生物特性之一是其与铁元素的高亲和力结合[13]。乳铁蛋白能够与2个铁离子结合,而铁离子的结合位点位于其2个叶片的切入部位[14-15]。乳铁蛋白的N端和C端可各结合1个铁离子和1个碳酸氢根离子( )或碳酸根离子( ),它对铁的亲和力常数比转铁蛋白高300倍[16-17]。乳铁蛋白的铁饱和度是指乳铁蛋白中的铁与乳铁蛋白总铁结合能力的百分比[18-19]。理论上,1 mol乳铁蛋白结合2 mol铁,1 g乳铁蛋白含有1.4 mg铁被认为是100%饱和的。在牛乳中,乳铁蛋白的铁饱和度通常为20%~30%,但在某些情况下也可以高达80%以上。研究表明,不同铁饱和度的乳铁蛋白对病原微生物、氧自由基等有不同的抑制作用[20⇓-22]。因此,研究不同铁饱和度乳铁蛋白的作用机制,对于深入了解乳铁蛋白的生物学功能和开发其应用具有重要意义。本文将综述近年来乳铁蛋白铁饱和度的研究进展,包括其铁饱和度的构效作用、测定方法以及影响铁饱和度的因素,通过对现有研究的综合分析,探讨乳铁蛋白铁饱和度对于乳制品的营养价值和保健功能的影响,以及探索未来乳铁蛋白铁饱和度研究的方向和挑战。
1 不同铁饱和度乳铁蛋白的功能特性
在母乳中,乳铁蛋白是一种主要的乳清蛋白,在人初乳中的浓度高达7 mg/mL,成熟乳中为2 mg/mL[23]。乳铁蛋白在牛乳中作为次要蛋白质存在,其浓度在初乳和成熟乳中约为1.5和0.2 mg/mL[23]。乳铁蛋白在山羊初乳中的浓度约为0.39 mg/mL,在成熟乳中约为0.06 mg/mL[24]。在水牛乳和骆驼乳中,乳铁蛋白浓度分别为0.03至0.81 g/kg[25]和0.59~1.42 mg/mL[26]。乳铁蛋白在乳汁中根据铁饱和度不同分为3种不同的形式,分别为:铁饱和度低于5%的无铁乳铁蛋白(apolactoferrin,apo-Lf)、自然乳铁蛋白(native-Lf,Lf)和铁饱和度高于85%的全铁乳铁蛋白(hololactoferrin,holo-Lf)[2]。乳铁蛋白是由apo-Lf和holo-Lf组成的混合物,但也可能是在N-或C-lobe饱和的单铁乳铁蛋白物种[27]。现已发现,乳铁蛋白的铁饱和度水平会影响其生理功能。
1.1 不同铁饱和度乳铁蛋白的颜色
1.2 不同铁饱和度乳铁蛋白的抗菌作用
乳铁蛋白是铁离子载体,以高亲和力地结合铁离子并将其转运到细胞中。另外,乳铁蛋白也表达特定受体,这些受体能够直接从细菌表面的乳铁蛋白中去除铁元素。这一过程剥夺了细菌所需的铁元素,降低了其铁利用率,从而抑制了细菌的生长和繁殖[30-31]。除此之外,乳铁蛋白还具有直接的杀菌活性,乳铁蛋白与细菌脂多糖的脂质A部分结合,促使细胞膜通透性的增加,破坏已形成的生物膜结构,起到抗菌效果[32](图1)。且不同铁饱和度乳铁蛋白对真菌的抑制程度存在差异,饱和度越低的乳铁蛋白抗菌效果越好。Roy等[33]研究表明,随着铁饱和度的增加,乳铁蛋白的抑菌能力下降。通过构建乳腺肿瘤模型还发现,铁饱和度对乳铁蛋白的肿瘤抑制活性有影响,其中apo-Lf肿瘤抑制活性最强。Aguila等[34]研究发现,乳铁蛋白对金黄色葡萄球菌具有很强的生长抑制作用,无论暴露于乳铁蛋白的时间长短,加铁后细菌立即恢复生长,说明乳铁蛋白的抑菌作用对铁具有依赖性。一旦开始生长,乳铁蛋白便无法抑制金黄色葡萄球菌,这表明乳铁蛋白是通过高度结合铁离子,抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长。即干扰细菌对铁的利用,可达到抑菌的效果。Fan等[35]研究发现,apo-Lf和holo-Lf都可以改善脂多糖(LPS)诱导的幼鼠肠道炎症,但apo-Lf的效果比holo-Lf强。apo-Lf通过抑制革兰氏阴性菌的生长以减少LPS的来源并与LPS结合,显著降低apo-Lf组小鼠肠道中LPS的浓度,从而表明其在缓解炎症反应中的作用。
A: gram-positive bacteria; lactoferrin binds to negatively charged molecules on cell membrane, such as binding lipoteichoic acid, neutralizing wall charge and allowing action of other antibacterial compounds, such as lysozyme. B: gram-negative bacteria; lactoferrin binds to lipid A in lipopolysaccharide and releases it, causing cell membrane damage.
1.3 不同铁饱和度乳铁蛋白的抗氧化性
因此,乳铁蛋白的抗氧化活性主要归因于其与铁的结合特性[39-40](图2)。内源性乳铁蛋白被认为通过结合促氧化铁离子而表现出亲水性抗氧化特性,机体内的铁离子会促进氧自由基反应[41],在过量的情况下,铁离子会导致自由基过量产生,从而引起脂质的过氧化,破坏生物膜结构[42]。目前还不清楚口服补充乳铁蛋白是否能够提高整体抗氧化能力。但Mulder等[43]的研究结果表明,口服补充生牛乳乳铁蛋白(bovine lactoferrin,bLf)(前7 d每天100 mg,随后每天200 mg,共持续14 d)可以增强健康男性的亲水性抗氧化状态。这可能是因为胃肠道上皮细胞调节了抗氧化剂的产生,使得乳铁蛋白只能在消化道中作为铁螯合抗氧化剂[43]。尽管抗氧化活性可能与乳铁蛋白的铁结合性质有关,但已经观察到即使在超过其结合铁能力的浓度下,乳铁蛋白仍能抑制氧化反应的发生。该研究揭示了bLf在除了2个高亲和力结合位点之外的其他位点上结合铁的能力[43]。因此,除了铁结合特性之外,bLf可能还有其他机制参与其抗氧化活性。多项研究已经报道了乳铁蛋白的潜在抗氧化作用。Maneva等[44]发现,乳铁蛋白对红细胞具有抗氧化作用,并观察到乳铁蛋白能够增加还原型谷胱甘肽的含量,抑制硫代巴比妥酸反应物质的产生并减轻溶血现象。这些研究结果暗示了乳铁蛋白的抗氧化活性可能与糖酵解刺激相关。Safaeian等[45]还证实,长期食用乳铁蛋白可以显著增强大鼠的抗氧化能力。
1.4 不同铁饱和度乳铁蛋白的热稳定性
乳铁蛋白的热稳定性与其铁饱和度有关,与apo-Lf相比,holo-Lf具有更稳定和紧凑的结构[46]。热稳定性的增加归因于乳铁蛋白具有2个裂片,当乳铁蛋白结合铁离子时,这2个裂片会随着乳铁蛋白结合铁的量逐渐闭合,从而可以将2个蛋白质裂片核心的非共价位点隐藏起来,减少分子间的相互作用和不溶性聚集体的形成[7]。随着乳铁蛋白铁饱和度的升高,其结构越紧凑[5,47],稳定性越高,变性熵变增加。不仅如此,乳铁蛋白的聚集依赖于铁饱和度,在加热过程中出现复合物的主要变化,要取决于铁的状态。apo-Lf和native-Lf对热更敏感,并形成大的不溶性聚集体。相反,铁饱和增加了holo-Lf的稳定性,导致更少的聚集和更可溶的蛋白质聚合物。holo-Lf的更紧密构象防止其在加热时聚集。乳铁蛋白聚集通过非共价相互作用和分子间硫醇/二硫化物反应(不需要游离硫醇残基)的组合进行[27,48]。在较高温度下,铁饱和也稳定了乳铁蛋白二硫键的完整性。更稳定的holo-Lf的热聚集首先涉及蛋白质分子之间的非共价相互作用。在较高温度下,分子内二硫键也发生断裂,游离巯基催化分子间巯基/二硫键反应。乳铁蛋白的结构与其稳定性密切相关。因此,holo-Lf比apo-Lf更紧密,稳定性更强,更能抵抗蛋白水解[49]。Jiang等[50]研究表明,在体外测试中,apo-Lf对隐窝细胞增殖的刺激明显大于holo-Lf。但是,holo-Lf保持了很高的稳定性,特别是在长时间加热和储存时,并且不易形成聚合物或降解。由于这些原因,全息型乳铁蛋白经常被添加到婴儿粉等奶制品中。Sreedhara等[7]对山羊乳铁蛋白(caprine lactoferrin,cLf)和bLf进行了构象和热稳定性比较,结果表明bLf具有比cLf更高的热稳定性,cLf更容易发生结构变化或失活。Sreedhara等[51]通过差式扫描量热法测定了cLf和bLf的热变性温度,结果显示,cLf的铁饱和度为5%,热变性温度为66 ℃;而bLf的铁饱和度为15%,热变性温度为70 ℃,这表明bLf的铁饱和度高于cLf,同时bLf的热变性温度也高于cLf。在Conesa等[52]对绵羊、山羊、人类、骆驼、大象和羊驼的低密度纤维热稳定性的研究中,观察到不同动物的holo-Lf的热转变温度值高于各自的其他形式。除了铁饱和度之外,乳铁蛋白的稳定性还受到其他因素的影响,如温度、pH和盐浓度等,这些因素可能会影响乳铁蛋白的构象和相互作用。
2 乳铁蛋白不同铁饱和度的检测方法
2.1 紫外-可见分光光度法
测定铁饱和度的最简单方法是使用紫外-可见分光光度法。紫外-可见分光光度法是通过检测样品在紫外和可见光波长范围内吸收或散射光线的变化来测定乳铁蛋白铁饱和度的[53]。在紫外-可见吸收光谱中,吸收峰的位置和强度与样品的化学结构和电子状态有关。对于乳铁蛋白,其铁饱和度的测定通常是基于其与铁离子的结合,因为铁离子对于乳铁蛋白的吸收光谱有很大的影响。在饱和状态下,乳铁蛋白分子中的铁离子数量达到最大限度,从而导致在特定波长范围内的光吸收峰强度增加。因此,通过测量乳铁蛋白在特定波长范围内的光吸收峰强度,可以计算出其乳铁蛋白饱和度。Volden等[54]使用此方法,通过对不同铁饱和度的乳铁蛋白在紫外线下吸收光谱的测量,研究乳铁蛋白的构象变化,结果表明,铁离子含量较高的乳铁蛋白在紫外线下的吸收峰较高,表明其构象更紧密,铁离子含量较低的乳铁蛋白则相反。
2.2 电感耦合等离子体质谱法
紫外-可见分光光度法仅能测定含有apo-Lf或holo-Lf的样本,对于复杂的样品,电感耦合等离子体质谱法被视为获得更高准确度的一种方法[54-55]。电感耦合等离子体质谱法能够测定饱和度更复杂的样品,其测定乳铁蛋白是基于质谱技术,利用了高频感应耦合等离子体的离子化作用和质谱技术的精确分析能力,从而实现对乳铁蛋白样品中铁离子含量和铁饱和度的准确测定。通常需要先将样品进行酸性水解或胰蛋白酶消化,以释放出铁离子;然后将样品引入电感耦合等离子体质谱系统,使用质谱仪进行元素的定量分析。电感耦合等离子体质谱法的测定灵敏度非常高,能够检测非常低的元素含量,因此可以准确测定乳铁蛋白中铁离子的含量和饱和度[54⇓-56],Pryshchepa等[57]使用此方法测定合成的复合物中的铁含量,使复合物的铁离子含量达到(32.97±4.41) mg/g。Majka等[56]采用该方法可以快速、准确地测量乳铁蛋白制剂的铁饱和度,并且不需要进行复杂的蛋白质预处理步骤;该方法还可以应用于高通量的生产流程中,有助于实现生产的快速安全控制,并说明该方法是一种优秀的、可行的、高通量的测量乳铁蛋白制剂铁饱和度的方法,该方法具有高精度和灵敏度,便于实际操作和质量控制。
2.3 原子吸收光谱法
原子吸收光谱法也可用于乳铁蛋白铁饱和度的测定[52,58]。在测量乳铁蛋白铁饱和度时,首先需要将乳铁蛋白样品中的铁离子分离出来,通常使用螯合剂(如乙二胺四乙酸)与铁离子形成配合物的方法实现;之后,将样品中的溶解液通过原子吸收光谱仪,光谱仪会发出一定波长的光,样品中存在的铁离子会吸收掉该波长光线的一部分能量,所以光的强度就会发生变化。通过测定样品中铁离子吸收光谱的强度变化,计算出样品中铁离子的浓度,并进而推算出乳铁蛋白的铁饱和度。吸收光谱法测定乳铁蛋白铁饱和度的优点是快速、简便、灵敏度高和重复性好,适用于大规模样品的分析,但只能测定在纯净溶液中的样品,并不适用于复杂的混合溶液[56]。Konuspayeva等[26]研究使用吸收光谱法测定了不同剂量的乳铁蛋白对大鼠肝脏铁含量的影响,结果表明,乳铁蛋白能够显著降低肝脏铁含量,减轻亚铁离子的生成,从而减轻氧化应激的程度。在Puddu等[58]的研究中,使用了原子吸收光谱法测定了不同金属离子对乳铁蛋白铁饱和度的影响,并研究了乳铁蛋白对人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)病毒的抗病毒作用,结果发现,特定金属离子(如铁、铜和镍)可以增加乳铁蛋白的抗HIV-1活性,这表明乳铁蛋白的抗病毒活性可能与其金属离子饱和度有关。而在Conesa等[52]的研究中,使用原子吸收光谱法测定了不同物种的乳铁蛋白样品的铁和锌含量,结果发现,不同物种的乳铁蛋白具有不同的铁和锌饱和度;此外,该研究还观察到乳铁蛋白可以抵制某些细菌的生长,这表明乳铁蛋白的抗菌性可能与其含有金属离子有关。乳铁蛋白不同铁饱和度的检测方法见表2。
表2 乳铁蛋白不同铁饱和度的检测方法Table 2 Detection methods of different iron saturations of lactoferrin |
| 检测方法 Test methods | 检测结果 Test results | 参考文献 References |
|---|---|---|
| 紫外-可见分光光度法 Ultraviolet-visible spectrophotometry | 铁离子含量较高的乳铁蛋白吸收峰较高,构象更紧密 | [37] |
电感耦合等离子体质谱法 Inductively coupled plasma mass spectrometry | 使复合物的铁离子含量达到(32.97±4.41) mg/g | [40] |
| 该方法能够快速、准确地测定乳铁蛋白的铁饱和度, 并且能够在分析中同时测定乳铁蛋白和铁离子 | [41] | |
| 快速、准确地测量乳铁蛋白制剂的铁饱和度, 并且不需要进行复杂的蛋白质预处理步骤 | [39] | |
原子吸收光谱法 Atomic absorption spectrometry | 乳铁蛋白能够显著降低肝脏铁含量,减轻亚铁离 子的生成,从而减轻了氧化应激的程度 | [16] |
| 乳铁蛋白的抗病毒活性可能与其金属离子饱和度有关 | [42] | |
| 乳铁蛋白可以抵制某些细菌的生长,这表明乳铁蛋白的抗菌性 可能与其含有金属离子有关 | [36] |
3 乳铁蛋白不同铁饱和度的影响因素
3.1 饲粮对乳铁蛋白铁饱和度的影响
饲粮中铁的含量和生物利用率对乳铁蛋白铁饱和度有直接影响。饲粮中铁含量过高或过低都可能造成乳铁蛋白铁饱和度的不同。如果动物食物摄入铁较少,则机体内的铁水平可能较低,导致乳铁蛋白的铁饱和度降低。机体内的铁元素可以通过2种方式进入到乳铁蛋白中:一种方式是肠道吸收,奶牛的饲粮中会含有一定量的铁,当奶牛采食这些饲粮时,铁元素会进入到奶牛的胃肠道中。在胃酸和肠液的作用下,铁元素会转化为可溶性铁离子[62],并进入到肠道上皮细胞中。这些铁离子通过肠道细胞膜上的转运蛋白进入到血液循环中,然后被运输至各个组织中,包括乳腺组织[63]。另一种方式是机体内铁储备的转运[64]。奶牛的肝脏和脾脏等器官中会储存一定量的铁元素,当机体需要铁元素时,这些器官中的铁元素就会被转运至乳腺组织中。在乳腺组织中结合成不同铁饱和度的乳铁蛋白,然后被分泌进入乳汁中。机体内的铁元素可以通过肠道吸收和内部铁储备的转运2种方式进入到乳铁蛋白中,因此不同的吸收差异对乳铁蛋白铁饱和度的影响有直接关系。
3.2 饮用水对乳铁蛋白铁饱和度的影响
硬水中的钙和镁离子与乳中铁离子竞争性地结合到动物的的结合位点上,导致部分结合位点被占据,从而降低了动物的中铁离子的结合数量和饱和度。动物的中的铁离子是通过与特定的结合位点结合而被固定在动物的中。由于硬水中含有大量的带正电荷的金属离子,它们与动物的上的铁结合位点之间具有一定的亲和力[65],因此它们会竞争性地结合到动物的上。这种竞争关系是导致动物的铁饱和度下降的原因。
3.3 pH对乳铁蛋白铁饱和度的影响
4 小结与展望
本文综述了乳铁蛋白不同铁饱和度与其构效关系和铁饱和度的检测方法及其影响因素。目前,乳铁蛋白的分子结构已被完全确定,并且其具有多种生物活性的报道也日益增多。不同铁饱和度的乳铁蛋白存在形式与其多种生物活性之间的关系及其在医疗和食品行业中的应用引起了越来越多的关注和重视。尽管不同铁饱和度的乳铁蛋白形式在结构上高度相似,但它们在功能上存在显著差异,具有在作用机制中发挥其他关键作用的潜力。因此,未来针对不同铁饱和度乳铁蛋白的探究应集中在重组乳铁蛋白的定向开发及重组不同铁饱和度乳铁蛋白的生物学功能,及其在食品生产及加工和营养价值等方面。