随着饲料行业的全面禁抗,寻求绿色、安全、高效的饲料添加剂并研发功能性、无污染、低残留的替抗产品已成为畜牧业的研究热点。植物精油因其能提高动物消化吸收功能、优化肠道菌群结构、刺激机体免疫器官发育、改善动物生长性能,且对人畜无危害、对环境无污染,而备受关注[1]。山苍子[Litsea cubeba (Lour) Pers.]又名山鸡椒、木姜子,属樟科、木姜子属植物,为落叶灌木或小型乔木,主要分布于我国南方如广西、云南等地以及东南亚各国,是珍贵的传统药材,更是重要的精油生产植物具有极为广阔的开发前景和应用价值[2⇓-4]。据统计,我国野生山苍子林面积约21.6万亩(1亩≈666.67 m2),占全国经济林总面积的0.04%[5]。近年来,随着组织培养、人工扦插等育种和育苗技术的不断突破,在福建、湖南、四川、贵州、江西等多个省份大面积培育了山苍子林,这为山苍子的开发利用提供了充足的原料[6⇓-8]。我国是世界上最大的山苍子精油生产国和出口国之一。每年生产的山苍子精油高达3 000多t,产品主要出口到美国、英国、法国、德国等国家[2,9]。山苍子精油因其抑菌、抗氧化、抗炎、抗肿瘤和杀虫等生物功能及药理作用,已广泛应用于医疗、食品和化工行业[10⇓-12],然其在动物生产中的应用研究仍非常有限。因此,本文综述了山苍子精油的主要活性成分、生理功能及其作用机制,并分析其对动物健康的影响及应用前景,以期为天然绿色饲料添加剂的研发及其在畜牧生产中的应用提供参考。
1 山苍子精油的主要活性成分
山苍子精油泛指从山苍子的果实、叶、花、枝、根等部位中提取的植物挥发油,但从不同部位分离的精油得率不尽相同(表1)[13]。其中,果实中的精油得率普遍较高,是山苍子精油的主要来源[10]。山苍子精油呈半透明、黄色,不溶于水,具有强烈的柠檬样气味,散发着清鲜香甜的果香。山苍子精油因其含量高、易制备且具有高度的芳香性,常作为化妆品和食品中的增香剂、增味剂。除此之外,山苍子精油还被用作生物杀虫剂,用于储存谷物、食品、档案、文件或衣物[14]。大量研究表明,山苍子精油主要是由含氧单萜(90%以上)、单萜烯(高达10%)和倍半萜(高达3%)等多种成分组合而成的天然混合物[15]。根据山苍子的种植产地和提取部位不同,山苍子精油的主要成分存在显著的差异性(表2)[3,12,16⇓⇓⇓⇓⇓⇓-23]。山苍子果实中的精油主要生物活性成分是柠檬醛(高达78.2%),一般而言,它是α-柠檬醛(香叶醛,高达45.9%)和β-柠檬醛(橙花醛,高达34.7%)这2种顺、反异构体的混合物[24],另外还含有较高浓度的柠檬烯(高达26.2%)。提取自印度山苍子叶片中的山苍子精油主要成分是香桧烯(高达58.5%)、1,8-桉叶素(高达16.1%)和α-蒎烯(高达12.6%),而提取自越南山苍子叶片中的山苍子精油主要由1,8-桉叶素(高达51.7%)组成。从山苍子花中获取的山苍子精油有42%是香桧烯,而从树皮中获取的山苍子精油中占比最大的成分是香茅醇。此外,山苍子的品种和种植环境如土壤、海拔、气候和灌溉等也被认为是影响山苍子精油化学组成的主要因素,而树龄、采收时期和提取工艺等因素也在一定程度上影响山苍子精油中主要活性成分的含量[16,20]。
表1 山苍子不同部位分离精油的得率Table 1 Yield of essential oils separated from different parts of Litsea cubeba% |
| 植物部位 Plant parts | 精油得率 Yield of essential oil |
|---|---|
| 花 Flower | 3.1 |
| 花蕾 Alabastrum | 2.3 |
| 果实 Fruit | 2.1 |
| 叶 Leaf | 1.3 |
| 根 Root | 0.31 |
| 茎 Stem | 0.29 |
表2 山苍子精油的主要成分Table 2 Main composition of Litsea cubeba essential oil |
| 植物部位 Plant parts | 产地 Growing area | 主要成分 Main composition | 参考文献 Literature |
|---|---|---|---|
| 果实 Fruit | 印度 | 柠檬醛(44.8%~78.2%)、香茅醛(10.9%~14.0%)、柠檬烯 (2.2%~6.1%),香叶醇(1.1%~4.6%)、芳樟醇(1.7%~2.0%) | [16-17] |
| 果实 Fruit | 越南 | 香叶醛(37.6%)、橙花醛(31.3%)、柠檬烯(11.3%)、 芳樟醇(1.7%) | [3] |
| 果实 Fruit | 中国广西 | 香叶醛(21.9%~35.2%)、橙花醛(26.0%~31.6%)、柠檬烯 (11.0%~26.2%)、芳樟醇(1.3%~2.9%)、α-蒎烯(1.0%~ 3.8%)、β-蒎烯(1.0%~6.2%) | [12,18] |
| 果实 Fruit | 中国广东 | 香叶醛(30.7%)、橙花醛(26.7%)、柠檬烯(8.1%)、 芳樟醇(5.2%)、α-蒎烯(1.9%)、β-蒎烯(2.7%) | [19] |
| 果实 Fruit | 中国江西 | 香叶醛(45.9%)、橙花醛(34.7%)、柠檬烯(5.3%)、 芳樟醇(1.2%) | [20] |
| 果实 Fruit | 中国台湾 | 香叶醛(36.2%)、橙花醛(28.3%)、柠檬烯(12.7%~ 22.9%)、芳樟醇(0.9%~1.4%) | [21-22] |
| 叶 Leaf | 印度 | 香桧烯(54.6%~58.5%)、1,8-桉叶素(12.6%~16.1%)、 α-蒎烯(10.8%~12.6%)、β-蒎烯(2.2%~2.6%) | [20] |
| 叶 Leaf | 越南 | 1,8-桉叶素(44.8%~51.7%)、香桧烯(12.1%~14.8%)、 α-蒎烯(3.7%~4.6%)、α-松油醇(9.8%~11.9%)、 香叶醛(1.1%~9.7%)、橙花醛(0.8%~7.4%)、β-蒎烯 (3.8%~4.3%)、柠檬烯(2.5%~4.4%) | [23] |
| 花 Flower | 印度 | 香桧烯(41.8%~42.3%)、香茅醛(14.3%~17.3%)、α-蒎烯 (6.6%~7.6%)、β-水芹烯(7.7%~9.0%)、β-蒎烯 (5.8%~6.1%)、香茅醇(2.9%~3.9%) | [16] |
| 树皮 Bark | 印度 | 香茅醇(11.9%~20.4%)、1,8-桉叶素(3.3%~5.7%)、 芳樟醇(3.0%~4.4%)、香桧烯(1.3%~3.1%) | [16] |
2 山苍子精油的生理功能
2.1 抑菌作用
肠道菌群是一个由益生菌、条件致病菌和病原菌组成的庞大且复杂的微生态系统,其中大肠杆菌属是动物肠道最为常见的致病菌,其他病原菌还包括通过外界霉变食物而进入肠道的霉菌。作为植物精油之一的山苍子精油具有广谱抗菌活性,能够杀灭多种食品腐败菌和食源性致病菌。Wang等[13]通过比较从我国山苍子的不同部位(包括果实、花、叶、根、茎等)提取精油的抗菌活性发现,受试菌株对山苍子精油表现出不同程度的敏感性,其敏感程度与不同部位精油所含的活性成分密切相关;其中,枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌对富含柠檬醛的果实精油(63.5%)和根部精油(21.5%)最为敏感,最小抑菌浓度(MIC)为100~200 μg/mL;相对而言,枯草芽孢杆菌对以桉叶素(13.97%)、γ-榄香烯(8.27%)、石竹烯(8.04%)和芳樟醇(6.94%)为主要活性成分的叶片精油较不敏感,MIC高达1 000 μg/mL;尽管大肠杆菌对叶片精油高度敏感,却对果实精油更具抵抗性。同样,Saikia等[17]也在评价不同部位的山苍子精油时发现,富含柠檬醛(84%)的果实精油表现出最强的抗菌活性。与该研究结果一致,Liu等[22]检测发现,我国台湾地区山苍子果实精油主要是由柠檬醛(69.8%)和柠檬烯(12.7%)组成,其对于副溶血性弧菌、单核细胞增生性李斯特菌、植物乳杆菌等细菌有显著抑制作用。赵春丽等[25]的研究结果进一步揭示了山苍子果实精油对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念球菌的抑菌效果随精油浓度升高(从20 mg/mL增加至80 mg/mL)而大幅增加。此外,山苍子精油对白假丝酵母菌、都柏林假丝酵母菌、新生隐球菌、克柔假丝酵母菌、马拉色菌等真菌也有明显的抑菌活性,且对抗真菌药物有协同作用[26-27]。通过建立小鼠系统性白色念珠菌感染模型来考察山苍子果实精油的体内抗真菌效果,发现腹腔注射山苍子果实精油能明显延长小鼠的中位生存时间,减少肾脏中菌落形成单位数,且存在剂量相关性,高剂量的山苍子果实精油对于真菌感染的疗效更好[28]。然而,有一项研究却指出,山苍子果实精油和叶片精油对所检测的黑曲霉、白色念珠菌等真菌几乎无抗菌活性,尽管这2种精油在一定程度上有抑制枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒杆菌等细菌生长的能力[29]。
山苍子精油的化学组成对于抗菌活性有极大的影响。柠檬醛被发现是山苍子精油众多成分中最具抗菌活性的化合物,尤其是对葡萄球菌、微球菌、芽孢杆菌和肠杆菌属的抗菌活性最强;香茅醛、柠檬烯和芳樟醇的抗菌活性较弱;而高浓度(1 000 μg/mL)的α-/β-蒎烯和α-/γ-萜品烯甚至都未表现出抑菌性能[30]。目前认为,山苍子精油及其活性成分具有的抑菌、杀菌作用主要是通过以下2种途径来实现:途径一,山苍子精油及其主要成分柠檬醛、1,8-桉叶素等能够穿透细菌和真菌的磷脂膜,破坏其结构的完整性并增加其通透性,使细胞内容物外泄,同时还能阻止生物膜合成,从而达到抑菌效果[31⇓-33]:途径二,山苍子精油能够以处理浓度和接触时间依赖性的方式降低细菌和真菌胞内三羧酸循环关键酶的活性,影响电子传递链的正常功能,使胞内摄氧量降低,能量消耗殆尽,从而破坏细胞正常代谢稳态,引起细胞死亡[34⇓-36]。综上所述,山苍子精油对于大肠杆菌、沙门氏菌等肠道致病菌引起的仔猪腹泻、蛋鸡输卵管炎和葡萄球菌等引起的奶牛乳房炎等疾病有潜在的治疗效果。但其抗菌效果会因生物个体、菌株类型和检测方法等因素而存在明显差异。
2.2 抗氧化作用
在现代集约化畜禽养殖过程中,动物从出生到屠宰中的各种因素均易引起机体氧化应激。动物发生氧化应激时,体内会产生大量自由基,如超氧阴离子自由基( ·)、羟自由基(·OH)等。当自由基浓度急剧增加而清除自由基的能力不足时,便会造成机体氧化与抗氧化作用失衡,对细胞造成伤害,伴随着信号通路异常、能量代谢紊乱、蛋白质异构等一系列变化,进而影响动物生长和机体健康,甚至诱发疾病和死亡,严重影响畜牧生产[37]。植物精油中几乎都含有烯萜类、醛类等活性成分,具有较强的抗氧化作用。Hwang等[38]在一项研究简报中称山苍子树皮甲醇提取物及其组分具有强大的抗氧化活性,但该研究未对提取物及其组分的化学成分进行鉴定。李欣欣等[39]在山苍子雌花精油和雄花精油中分别鉴定到47和43种化合物,2种精油都具有抗氧化活性,且雌花精油的抗氧化活性略强于雄花精油。Gogoi等[29]研究表明,与天然抗氧化剂维生素C相比,山苍子果实精油和叶片精油均表现出优异的对1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)清除能力。Chakraborty等[40]以山苍子果实为原料,利用己烷、丙酮、甲醇、乙醇和蒸馏水等不同溶剂进行提取,结果表明,山苍子果实的乙醇和甲醇提取物表现出较高的自由基清除活性。Wang等[18]鉴定了一种主要化学成分为柠檬烯(26.25%),α-柠檬醛(25.97%)、β-柠檬醛(21.90%)和β-蒎烯(6.20%)的山苍子精油,发现其清除OH·的能力较2,6-二叔丁基羟基甲苯(BHT,合成抗氧化剂)、柠檬醛、没食子酸丙酯(PG,合成抗氧化剂)和维生素C更强。山苍子精油的抗氧化活性强于柠檬醛,这可能是由于精油混合物中萜类和烯烃等多种活性成分均具有较强的抗氧化作用。当山苍子精油和柠檬醛的浓度低于0.45 mg/mL时,其清除超氧化物的能力高于BHT、PG和维生素C;而当山苍子精油和柠檬醛的浓度高于0.8 mg/mL时,其清除超氧化物的能力反而低于维生素C和BHT[18]。类似的,山苍子精油的抗氧化活性优于另外2种香辛料精油——姜油和肉桂油,且超过丁基羟基茴香醚(合成抗氧化剂)的2倍[41]。
2.3 抗炎作用
炎症反应是由巨噬细胞、吞噬细胞和中性粒细胞等机体固有免疫系统介导的一种重要的机体自我防御机制,是血管组织应对有害刺激而发生的复杂生物反应。机体在感染过程中会过度表达一氧化氮(NO)和前列腺素E2(PGE2)这2种炎症介质,从而加速炎症进程,损伤靶组织[46]。NO和PGE2分别由诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶-2(COX-2)产生,抑制NO和PGE2的生物合成能有效控制炎症的发生和发展[47]。前期有研究报道,以山苍子为代表的樟科木姜子属植物已被用于传统的草药治疗炎症疾病,包括胃肠病、水肿和风湿性关节炎[48]。Zhao等[49]首先采用醋酸扭体法制备了经典的小鼠疼痛模型,观察到不同剂量的山苍子精油对其有不同程度的镇痛效果;进一步通过二甲苯诱导小鼠耳廓肿胀模型考察山苍子精油的抗炎作用,结果表明,小鼠耳廓水肿现象得到明显改善;最后利用Ⅱ型胶原诱导的大鼠关节炎模型,发现山苍子精油显著减少了促炎细胞因子水平,增加了抗炎细胞因子的释放,降低了关节炎、胸腺和脾脏指数,小鼠足爪肿胀程度得到有效缓解。类似的,Lin等[50]通过建立大鼠类风湿性关节炎模型,研究发现,山苍子根的醇提物和水提物能抑制COX-2和5-脂氧合酶(5-LOX)的表达,减少白细胞介素(IL)-6、IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等促炎细胞因子的产生,上调抗炎细胞因子IL-10的表达,从而降低关节炎炎症症状,这表明山苍子精油在治疗关节炎等炎症疾病有巨大的潜力。与标准抗炎药双氯芬酸钠(内标)相比,山苍子果实精油和叶片精油显示出了较强的抗炎效果[28]。钟艳梅等[51]通过体外试验进一步评价了山苍子果实精油的抗炎活性,其NO抑制率≥50%的浓度为31.25~62.50 μg/mL。从山苍子根茎中分离的化合物对脂多糖(LPS)诱导的小鼠小胶质细胞(BV-2)细胞系和巨噬细胞RAW 264.7也有明显的体外抗炎活性[52]。山苍子皮的甲醇提取物能够减少LPS诱导的巨噬细胞RAW 264.7中NO和PGE2的产生,提示山苍子含有抗炎特性的活性物质[53]。以山苍子果实精油为原料,经溶剂萃取得到了香叶醛和橙花醛,用其处理LPS诱导的巨噬细胞后发现所表达的IL-6和TNF-α等炎性细胞因子水平降低。Li等[54]研究发现,肽聚糖介导的免疫反应以及对肠道的营养物质吸收和屏障功能的不利影响能被柠檬醛显著抑制,柠檬醛是通过模式识别受体Toll样受体2(TLR2)介导的猪肠上皮细胞(IPEC-J2)核因子-κB(NF-κB)信号通路的激活,下调肽聚糖诱导的炎症反应,从而改善肠道功能和健康。由此可见,山苍子果实精油中富含的柠檬醛(香叶醛和橙花醛)具有强效的抗炎生物活性。此外,山苍子果实精油对于骨髓来源的树突状细胞也表现出明显的免疫抑制作用。特别是将山苍子果实精油处理LPS刺激的树突状细胞后,其IL-12和TNF-α的表达受到明显抑制;针对小鼠的接触性超敏反应研究也证实了山苍子果实精油具有抑制免疫反应的作用[55]。
山苍子精油抗炎的机制主要是通过抑制iNOS和COX-2的蛋白表达,使核因子-κB抑制蛋白α(IκBα)、核因子-κB抑制蛋白激酶(IKKβ)蛋白磷酸化来阻遏炎症信号通路,从而减少TNF-α等炎性细胞因子的产生[56]。以上研究结果为山苍子精油用于治疗炎症性疾病、自身免疫性疾病和接触性超敏反应等提供了有力的证据。
3 山苍子精油在动物生产上的应用
目前,国内外关于山苍子精油在畜禽、水产动物及其饲料利用方面的研究才刚刚起步。Yang等[57]研究发现,断奶仔猪饲粮中添加不同水平的山苍子精油能够不同程度地提高血清和肝脏的总抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性,提高血清免疫球蛋白(Ig)A、IgG和IL-10含量,降低血清TNF-α含量,增加小肠绒毛高度,改善盲肠微生物群落的丰富度和多样性,提高盲肠乙酸和结肠丙酸等短链脂肪酸含量,使断奶仔猪的生长性能和肠道健康得到改善,腹泻率明显降低,尤以400 mg/kg添加剂量效果最佳。Chen等[58]将不同水平的山苍子精油饲喂育肥桃源黑猪,结果表明,提高了育肥猪对养分的消化吸收效率,如干物质、粗蛋白质、粗脂肪、灰分、钙的表观消化率和表观消化能,以及机体抗氧化能力如血清中谷胱甘肽含量和过氧化氢酶活性均得到不同程度地提高,并且能达到甚至超过金霉素组的应用效果,因此在猪的育肥阶段推荐山苍子精油的使用剂量为250 mg/kg。刘智谋等[59]也得到一致的研究结果,发现将含山苍子精油的饲粮喂养育肥猪能改善机体抗氧化能力和血液生理生化指标,从而提高生长性能,显示出山苍子精油在生猪饲粮中替代抗生素的巨大潜力。此外,山苍子精油对肉羊体外瘤胃发酵参数、产气量和甲烷产量也有较大影响[60]。
来自越南北部的山苍子提取的精油富含芳樟醇(94.93%),对嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等多种水产动物致病菌均具有杀灭作用;用该山苍子的叶粉饲喂鲤鱼21 d后发现,其以浓度依赖性的方式提高了鲤鱼体重、饲料转化率以及非特异性免疫能力,也能以浓度依赖性的方式改善嗜水气单胞菌感染的鲤鱼存活率[61]。以大菱鲆和斑马鱼为模型,以常见水产致病菌攻毒后经0.2 μL/mL山苍子精油药浴,发现大菱鲆和斑马鱼的死亡率明显下降,这可能是由于山苍子精油能破坏致病菌的细胞膜,致使胞内蛋白酶和核酸外泄,引起细菌死亡,该研究为大菱鲆细菌性疾病的防治提供了一种有效的抗生素替代方案[62]。沈琦[63]从自然患病的鱼体中分离纯化得到2株同丝水霉菌,研究发现,山苍子精油对其表现出良好的抑菌效果,镜下观察到山苍子精油能够有效破坏同丝水霉菌丝的生物膜结构,使其质壁分离并损伤胞内细胞器;同时,还能够破坏卵孢子的细胞壁,影响孢内贮存的营养成分,使孢子失去萌发能力;进一步通过对罗非鱼和鳗鲡的急性和亚急性毒性试验发现,与二硫氰基甲烷等高效广谱的杀藻灭菌药物相比,山苍子精油对鱼体的毒性相对较低,且对鱼体的抗氧化机能损伤较小,这提示山苍子精油是一种极具开发潜力的抗水霉药物。
4 小结
综上所述,山苍子精油来源广泛,富含单萜、单萜烯和倍半萜,尤其是柠檬醛和柠檬烯,且具有良好的抑菌、抗氧化、抗炎等生物学活性,是一种极具应用潜力的抗生素替代品。然而,山苍子精油的低稳定性、易挥发性等问题限制了整个产业的发展及其在动物生产上的应用。此外,山苍子精油的化学成分复杂,其含量因植株品种、种植环境、提取部位和加工工艺等因素而有较大差异。因此,山苍子精油在不同畜禽、水产动物饲粮中的适宜添加水平、应用效果及其作用机制等有待进一步系统而深入的研究。