植物精油是从植物不同部位通过水蒸馏、超临界流体萃取等方法提取得到的次生代谢产物混合物;其主要成分有萜烯类化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物以及含氮含硫类化合物等[1]。植物精油已被证明具有抗炎、抗菌、抗氧化及驱虫等生物活性,且在动物生产中具有良好效果[2]。但植物精油的疏水性、易挥发降解性和其散发出的特殊气味使其在动物生产应用中存在一定局限性。
1 植物精油的纳米胶囊化方法
1.1 乳化法
植物精油采用乳化法得到的是植物精油纳米乳液,由于其具有稳定、透明、高表面积和可调的流变性等独特性质,在近几十年来得到了广泛研究。纳米乳液是油和水的胶体纳米分散体,通过表面活性剂或助表面活性剂的界面层增加热稳定性。纳米乳液的体系分为水包油(O/W)和油包水(W/O)等类型,因为植物精油为亲脂性物质,所以常采用O/W的形式。表面活性剂的疏水基团与植物精油结合,而亲水基团与水相结合,以增加植物精油的水溶性(图1)。植物精油纳米乳液在制备时常有低能法和高能法。低能法操作简单且无需外部能量,但对表面活性剂浓度有着较高的要求,而且需把控体系的亲水亲脂平衡(hydrophilic lipophilic balance,HLB)。高能法主要有高压均质法、超声乳化法、微流化等方法,其需要使用专用设备如高压均质机、微流控器和超声波机等。这些设备通过高能量输入将较大的液滴分解成较小的液滴,可以提高植物精油的稳定性和生物活性。纳米乳液的制备方法、粒径尺寸及作用效果见表1。纳米乳液微粒的直径一般在200 nm以内[6],但随着液滴尺寸减小,它会受到奥斯特瓦尔德熟化(Ostwald ripening)的影响而趋于不稳定[7]。因此,合理设计纳米乳液体系,以确保其在小尺寸下具有良好的物理稳定性是至关重要的。
表1 纳米乳液的制备方法、粒径尺寸及作用效果Table 1 Preparation method, particle size and action effect of nanoemulsion |
| 项目 Item | 粒径尺寸 Particle size/nm | 精油种类 Essential oil type | 作用效果 Action effect | 参考文献 Reference | |
|---|---|---|---|---|---|
| 乳化法 Emulsification method | 高压均质法 High pressure homogenization method | 62.52~127.60 | 百里香精油 | 较强的抗真菌活性 | [8] |
| 110.9 | 亚麻籽油 | 长时间储存后仍具有较好的稳定性 | [9] | ||
微流化 Microfluidization | 8 | 茴香精油 | 提高植物精油的稳定性 | [10] | |
| 192 | 柑橘精油 | 提高植物精油的稳定性 | [11] | ||
超声破碎法 Ultrasonic crushing method | <32 | 百里香 | 提高植物精油的抑菌活性 | [12] | |
| 138.9 | 姜黄素 | 在肠道中释放精油的量增加, 提高其生物利用率 | [13] | ||
自乳化 Self emulsification | 21 | 酸橙精油 | 室温下储存1个月后仍保持 良好的抑菌活性 | [14] | |
| 50 | 薄荷精油 | 提高植物精油热稳定性 | [15] | ||
相转化 Phase transformation | 137.6 | 牛至和肉桂复合精油 | 有较强的自由基 清除活性和抑菌活性 | [16] | |
| 17.9 | 黑胡椒精油 | 1个月后仍保持良好的稳定性 | [17] | ||
1.2 纳米脂质体
表2 纳米脂质体制备方法、粒径尺寸及作用效果Table 2 Preparation method, particle size and action effect of nanoliposome |
1.3 沉淀法
沉淀法是基于马兰戈尼效应(Marangoni effect)原理开发的用来包被天然化合物的一种简单、快捷和低能耗的方法。这种方法被用于包裹亲水或疏水化合物,得到的颗粒被称为纳米球或纳米胶囊。纳米球存在内核结构,即基质,其中植物精油被包在颗粒内或吸附在其表面上;纳米胶囊是一种囊泡系统,其中植物精油被包在聚合物膜组成的空腔中(图3)。沉淀法常需要2种可混溶溶剂,其中壁材和植物精油溶于其中一种溶剂组成有机相(organic phase),另一种溶剂作为水相(aqueous phase),随后将含有植物精油的有机相加入水相并进行搅拌,在经过过饱和、成核、生长和凝固并进行蒸发和离心后得到植物精油的纳米颗粒[24]。沉淀法得到的微粒尺寸可达到200 nm以下,同时具有良好的稳定性和生物活性。沉淀法制备得到的粒径尺寸及作用效果见表3。制备过程中纳米颗粒的尺寸常受到搅拌速度、有机相的流速、有机相与水相的比例、表面活性剂和聚合物浓度的影响,通过调控这些因素可有效增加植物精油的包封效率[25]。
表3 沉淀法制备得到的粒径尺寸及作用效果Table 3 Particle size and action effect obtained by precipitation method |
2 纳米胶囊化植物精油的生物活性
2.1 抗菌活性
植物精油可以通过细胞壁、细胞膜进入到微生物细胞内,破坏细胞膜结构,导致细菌细胞壁疏松,细胞膜密度降低、溶解、破溃;并进一步干扰细胞内能量代谢,影响细菌DNA、RNA、蛋白质和肽聚糖的生物合成等发挥抗菌作用[30]。通过包被不仅可以更好地保护植物精油的活性成分,并且能增强植物精油的抗菌活性。Rashidipour等[31]制备了Satureja khuzistanica jamzad(SKJ)精油的纳米胶囊,并对比了SKJ精油及其纳米胶囊对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌等5种革兰氏阳性菌和大肠杆菌、单核增生李斯特氏菌、伤寒沙门氏菌等5种革兰氏阴性菌的抗菌活性,发现SKJ精油纳米胶囊的抑菌活性比SKJ精油提高了8~16倍。Shetta等[32]发现绿茶精油的纳米胶囊对金黄色葡萄球菌的抗菌活性比纯绿茶精油提高了约9.4倍,对大肠杆菌的抗菌活性比纯绿茶精油提高了约4.7倍。
纳米胶囊化植物精油可以通过诱导细胞壁、细胞膜和线粒体膜发生转化,改变细菌细胞膜通透性,导致细胞内容物渗漏造成细菌细胞死亡。Liang等[33]发现,使用肉桂精油纳米乳液对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌3种革兰氏阳性菌和铜绿假单胞菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌3种革兰氏阴性菌进行处理后,细菌细胞壁表面微观结构从光滑完整变得模糊,出现不规则的皱褶及不同程度的损伤,且细菌出现黏附和聚集。研究发现,用于包被植物精油的壁材表面携带的正电荷基团可与微生物带负电荷的膜成分相互作用,从而诱导破坏细菌细胞膜功能,并使细菌细胞内物质发生泄漏[34](图4-A)。纳米胶囊化植物精油表面负电荷与细菌阳离子表面相互作用有效作用于细胞膜(图4-B),是改变细菌通透性的根本原因[35];而使用包被植物精油得到的纳米微粒可以增加植物精油与微生物带负电荷的膜成分相互作用,进一步增强植物精油的抗菌活性[36]。
图4 纳米胶囊化植物精油发挥生物活性的作用机制MDA:丙二醛 malondialdehyde;ROS:活性氧 reactive oxygen species;GP-X:谷胱甘肽过氧化酶 glutathione peroxidase;SOD:超氧化物歧化酶 superoxide dismutase;Nrf2:核转录因子E2相关因子2 nuclear factor E2-related factor 2;NF-κB:核因子-κB nuclear factor kappa-B。 Fig.4 Mechanism of action of nanoencapsulated plant essential oils in exerting biological activity[34-35,40-41,44⇓⇓-47] |
2.2 抗氧化活性
在畜禽生产中,外界环境的改变或饮食条件的变化等不良刺激往往会诱导动物机体产生过量活性氧(reactive oxygen species,ROS),从而导致机体抗氧化系统失衡,进一步干扰DNA等生物大分子的结构和功能,引起细胞氧化损伤或死亡,即氧化应激[37]。在畜禽生产过程中,氧化应激的发生会诱导机体产生炎症,从而导致畜禽免疫力下降、生长性能降低,造成经济损失;而植物精油中的萜类、酚类、酮类等活性成分可以通过清除自由基,金属离子和抑制脂质过氧化来发挥抗氧化活性[38]。植物精油的纳米胶囊化可提高其抗氧化活性。Attallah等[39]使用果胶/壳聚糖做为壁材制备了粒径为468.5~698.3 nm的茉莉精油纳米胶囊,发现茉莉精油纳米胶囊对2,2-二苯基-1-苦基肼基(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical,DPPH)自由基的半抑制浓度(IC50)为0.01 mg/mL,与纯植物精油的IC50(0.269 mg/mL)相比,其抗氧化能力提高了96.28%。Shetta等[32]研究发现,纳米胶囊化处理后薄荷油和绿色茶油清除DPPH自由基的能力分别提高了约2.0倍和2.4倍。
纳米胶囊化植物精油可通过提高机体抗氧化酶基因表达和抑制脂质过氧化来降低机体的氧化物水平(图4-C~图4-E)。Salman等[40]研究发现,使用麦芽糖糊精为壁材制备的肉桂精油纳米胶囊,可清除机体产生的ROS,降低肝脏、肾脏2个器官中的丙二醛(malondialdehyde,MDA)和一氧化氮(nitric oxide,NO)含量,从而减轻氧化钛纳米颗粒(TiO2NP)诱导的雄性小鼠氧化应激。Shafaei等[41]研究发现,0.25和0.50 mg/L的莳萝子油纳米乳液可通过降低MDA含量、减少机体脂质过氧化和上调小鼠肝脏、肾脏和脑组织中谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GP-X)基因的表达来减轻小鼠体内由重金属镉(Cd)引起的氧化应激,并且效果呈现浓度依赖性。此外,胶囊化材料中一些多糖类聚合物,如壳聚糖、麦芽多糖、海藻多糖等本身具有清除活性氧、调节机体抗氧化系统和减轻氧化应激的功能;而这些材料会与植物精油发生协同作用,提高植物精油的抗氧化活性[42]。
2.3 抗炎活性
炎症是由组织损伤、应激或病菌感染诱导产生的一种适应性生理状态。如果不及时解决会引发炎症部位吞噬细胞大量浸润,毛细血管炎症渗出和炎症介质大量产生[43],导致动物机体肠壁增厚、肠道内容物黏稠、食欲下降、饲料利用率下降等现象。植物精油中的1,8-桉树脑、樟脑和α-蒎烯及一些酚类化合物等活性物质,可通过抑制核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)通路下游炎症细胞因子等不同路径发挥其抗炎作用[44]。植物精油包被后能够提高其抗炎活性。Pinto等[45]研究发现,200 mg/kg的苦配巴精油纳米胶囊可以显著降低小鼠的炎症水平和机体中促炎细胞因子含量,其中降低肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)分泌量的效果是纯精油的3倍。研究发现,纳米胶囊化植物精油可通过抑制炎性通路的激活来缓解机体的炎症(图4-F)。Abdelhameed等[46]研究发现,南洋杉芽精油的纳米乳液可以通过降低NF-κβ p65蛋白标志物的免疫表达水平来缓解机体炎症;另外,也有研究发现纳米胶囊化植物精油可以通过抑制花生四烯酸衍生物,如前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)的产生缓解机体炎症(图4-G)[46-47]。纳米胶囊化植物精油也可通过抑制炎性因子和减少机体活性氧的含量减少炎症的发生,但少有纳米胶囊化植物精油对分子层面影响的研究。
3 纳米胶囊化植物精油在畜禽生产中的应用
3.1 单胃动物
纳米胶囊化植物精油有更高的胞内摄取、特异性、载药能力和生物利用率等优势。将其用于动物生产中可更好地发挥植物精油对动物机体的积极作用。将纳米胶囊化植物精油应用于猪生产中,可改善肠道形态,稳定肠道微生物菌群,减少炎症的发生,从而改善机体的健康状态。研究发现,在饲粮中添加2 g/kg复合植物精油(百里酚、香草醛和丁香酚)纳米胶囊可降低育肥猪机体中TNF-α、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)等促炎因子的含量,增加平均日增重(ADG),提高生长性能[48]。Liu等[49]将复合精油纳米胶囊饲喂仔猪后可激活核转录因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid2-related factor 2,Nrf2)信号通路,升高血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和GP-X活性;并抑制NF-κB信号通路,增加血清中的IL-10、免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)含量,缓解机体氧化应激,改善机体免疫力,降低仔猪腹泻率并改善仔猪肠道健康状态。
纳米胶囊化植物精油在家禽中的研究多集中在提高生长性能以及改善肠道健康等方面。Hafeez等[50]研究发现,饲粮中添加100 mg/kg的香芹酚、百里香酚和柠檬烯混合物纳米胶囊可改善肉鸡采食量和饲料转化率(feed conversion ratio,FCR),并增加肉鸡回肠表观消化率。研究发现,饲粮中添加300 mg/kg的纳米胶囊化植物精油可维持蛋鸡肠道形态,改善肠道屏障功能,并促进消化吸收能力,明显提高蛋鸡生长性能和蛋品质[51]。此外,Meligy等[52]研究发现,饲喂400 mg/kg的牛至、肉桂和丁香精油的复合精油纳米胶囊可提高黏蛋白-2(mucoprotein-2,MUC-2)、连接黏附分子-2(junctional adhesion molecule-2,JAM-2)和闭锁蛋白(Occludin)等肠道屏障基因的表达,改善肠道屏障功能,并通过提高胰蛋白酶、淀粉酶等消化酶活性来提高FCR,增加肉鸡终末体重。Moharreri等[53]研究发现,饲粮中添加100 mg/kg的百里香、夏味、薄荷和黑胡椒籽的混合精油纳米胶囊能够调节回肠组织中抗氧化基因和炎症基因的表达,上调Occludin和SOD基因的表达,改善机体抗氧化状态、回肠形态结构、肠道微生物数量,从而提高肉鸡的总采食量、FCR和终末体重。
3.2 反刍动物
植物精油经纳米胶囊化处理,可通过传递植物精油和壁材的生物活性来提高动物的生长性能。纳米胶囊化植物精油应用于肉牛生产中,可提高其生长性能,改善氧化状态、肠道菌群结构和肉品质。有研究发现,在饲粮中添加150 mg/kg的混合精油纳米胶囊可提高肉牛ADG和FCR[54]。Asghari等[55]研究发现,4种药用植物(麝香草、薰衣草、鼠尾草和毛羊藿)复合精油的纳米乳液不仅可增加犊牛的ADG,降低丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)活性和MDA含量,还可以减少粪便中大肠杆菌数量,改善犊牛健康状况。此外,饲喂纳米胶囊化植物精油还可改善屠宰后牛肉品质。De Oliveira Monteschio等[56]在73日龄母牛的饲粮中添加4 g/d的纳米胶囊化植物精油混合物(丁香酚、麝香草酚以及香草醛),可减少胸最长肌(longissimus thoracis,LT)亮度值和MDA含量,从而改善肉品质。另有研究发现,纳米胶囊化植物精油混合物还可增加肉牛背长肌肌节长度和肌肉中可溶性胶原蛋白含量,降低肌肉中Ⅲ型胶原蛋白含量,增加肉质嫩度[57]。
4 小结与展望
植物精油的纳米胶囊化主要有乳化法、纳米脂质体、沉淀法等方法。纳米胶囊化可改善植物精油的高挥发性和水不溶性等局限性,并进一步加强植物精油的抗菌、抗氧化及抗炎等生物活性。将植物精油的纳米胶囊应用于畜禽生产,可进一步提高动物的生长性能、机体免疫力和健康水平。未来纳米胶囊化植物精油在畜禽生产上的应用仍有许多有待研究的问题,如纳米胶囊化不同包被壁材对植物精油特定生物活性的影响,纳米胶囊植物精油在动物消化道不同部位的释放速度及最佳效果的研究,以及其调节畜禽肠道微生物区系的作用效果及机制等,都需要进一步深入的研究,以便更好地应用于畜禽生产中。