Immunoadjuvant Effects of Allium mongolicum Regel Polysaccharide on Ovalbumin in Mice

ZHAO Yuqi; AO Changjin; KHAS Erdene; BAI Chen; CAO Qi’na; ZHENG Yankai

doi:10.12418/CJAN2024.509

Chinese Journal of Animal Nutrition >

2024 , Vol. 36 >Issue 9: 6007 - 6014

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.509

RESEARCH PAPER

Immunoadjuvant Effects of Allium mongolicum Regel Polysaccharide on Ovalbumin in Mice

ZHAO Yuqi ,
AO Changjin ^,^* ,
KHAS Erdene ,
BAI Chen ,
CAO Qi’na ,
ZHENG Yankai

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Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science of Colleges and Universities of Inner Mongolia, College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China

^* professor, E-mail: changjinao@aliyun.com

Received date: 2024-03-06

Online published: 2024-09-08

Fold

Abstract

The aim of this experiment was to study the adjuvant effects of Allium mongolicum Regel polysaccharide (AMRP) on mice immunized with model antigen ovalbumin (OVA). Forty specific pathogen free (SPF) female Kunming mice aged 6 to 8 weeks and weighing (20±2) g were randomly divided into 5 groups, which were blank control group (BC group), OVA immune control group (OVA group), OVA+low-dose AMRP group (LAMRP group), OVA+medium-dose AMRP group (MAMRP group) and OVA+high-dose AMRP group (HAMRP group), with 8 replicates per group and 1 replicate per replicate. The pre-trial period lasted for 7 days and the experimental period lasted for 34 days. During days 1 to 4 and days 16 to 19, the mice in BC group and OVA group were administrated with normal saline by oral gavage, and those in LAMRP group, MAMRP group and HAMRP group were administrated with 15, 20 and 25 mg/kg BW AMRP by oral gavage, respectively, with an amount of 0.2 mL. On day 5 and day 20, the mice in BC group were injected subcutaneously with 0.1 mL normal saline every mouse, and those in the other groups were injected with 100 μg OVA solution every mouse. Samples were collected for 2 weeks after second immunization. The results showed as follows: 1) compared with BC group and OVA group, different doses of AMRP had no significant effects on body weight and weight gain rate of mice at each stage of the experiment (P>0.05). 2) Compared with BC group and OVA group, there were no significant differences in thymus index of mice in each dose of AMRP group (P>0.05); the spleen index (P<0.01) and germinal center diameter in spleen (P<0.05) in MAMRP group were significantly increased. 3) Compared with BC group and OVA group, the serum interleukin-10 (IL-10) content of mice in MAMRP group and HAMRP group was extremely significantly increased (P<0.01); compared with OVA group, the serum interferon-γ (IFN-γ) content in LAMRP group and MAMRP group was significantly increased (P<0.05); there were no significant differences in serum contents of interleukin-2 (IL-2) and interleukin-4 (IL-4) among all groups (P>0.05). 4) Compared with BC group, the OVA specific antibody immunoglobulin G (IgG) content in serum of mice in MAMRP group was extremely significantly increased (P<0.01). In conclusion, AMRP can improve the immune ability of mice against antigen OVA, and then show certain adjuvant effects, which can be used as an effective vaccine adjuvant to induce immune response; under the experimental conditions, the adjuvant effects are better when 20 mg/kg BW AMRP is administrated by oral gavage.

Key words： Allium mongolicum Regel polysaccharide; mice; ovalbumin; vaccine; adjuvant

Cite this article

ZHAO Yuqi , AO Changjin , KHAS Erdene , BAI Chen , CAO Qi’na , ZHENG Yankai . Immunoadjuvant Effects of Allium mongolicum Regel Polysaccharide on Ovalbumin in Mice[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2024 , 36(9) : 6007 -6014 . DOI: 10.12418/CJAN2024.509

众所周知,接种疫苗是预防和控制人畜传染病传播的最有效途径^[1]。疫苗佐剂是一类起辅助作用的物质,可以增强机体对抗原的免疫反应,所以,开发有效的疫苗佐剂对于提高疫苗的有效性和安全性至关重要^[2]。研究发现,从中草药中提取的多糖可作为疫苗的佐剂^[3]。天然植物多糖具有内在免疫调节、生物相容性、生物降解性和低毒等特点^[4],对于抗原可产生特异性细胞免疫和体液免疫应答,因此越来越多的植物多糖被应用于疫苗中作为佐剂^[5]。

沙葱(Allium mongolicum Regel)是百合科、葱属植物,含有多糖、黄酮和精油等多种生物活性物质,广泛生长在我国内蒙古西部和西北地区^[6]。沙葱多糖(Allium mongolicum Regel polysaccharide,AMRP)是从新鲜沙葱中提取的活性成分,研究表明沙葱多糖具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒和免疫促进等作用,且具有绿色环保和无毒性的特点^[7⇓-9]。卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)作为一种模式抗原,被以注射方式免疫机体,并用于检验疫苗的佐剂效力^[10]。本试验在灌胃沙葱多糖后,再以注射方式用OVA免疫小鼠,探究沙葱多糖对抗原的免疫佐剂作用,为进一步寻找天然、无毒、高效的植物提取物免疫佐剂提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选取40只6~8周龄无特定病原体(SPF)级雌性昆明小鼠,体重为(20±2) g,购自内蒙古大学动物实验中心,实验动物生产许可证号:SYXK(蒙)2020-0006。

1.2 试验材料

试验所用新鲜沙葱购自甘肃省武威市,烘干(65 ℃)粉碎备用。沙葱多糖的提取参照陈圣阳^[9]的方法,为实验室自制。具体步骤为:将新鲜沙葱自然风干3~4 d后置于烘箱65 ℃烘干粉碎,过80目筛得沙葱粉用于石油醚脱脂脱色,料液比为1∶5,摇床振荡24 h后弃石油醚,置于65 ℃烘箱挥发残留石油醚;将烘干好的沙葱粉加入料液比为1∶20的蒸馏水,水浴加热8 h后用真空泵抽滤得到滤液,后用旋转蒸发仪浓缩得到浓缩液;最后,加入无水乙醇避光醇沉48 h,弃上清液,2 679.94×g离心20 min得沉淀,用真空冷冻机冻干得到白褐色的沙葱多糖,纯度为10.09%,于-20 ℃保存备用。

1.3 试验试剂

OVA购自美国Sigma公司;特异性抗体免疫球蛋白G(IgG)及其亚类检测试剂盒、细胞因子检测试剂盒购自江苏晶美生物科技有限公司。

1.4 试验设计和饲养管理

本试验在内蒙古农业大学动物科学学院鼠房进行,采用单因素试验设计,将40只昆明小鼠随机分为5组,分别为空白对照组(BC组)、OVA免疫对照组(OVA组)、OVA+低剂量沙葱多糖组(LAMRP组)、OVA+中剂量沙葱多糖组(MAMRP组)和OVA+高剂量沙葱多糖组(HAMRP组),每组8个重复,每个重复1只。预试期7 d,正试期34 d。

小鼠免疫方法参考封海波^[11],第1~4天和第16~19天,BC组和OVA组小鼠灌胃生理盐水,LAMRP组、MAMRP组和HAMRP组分别灌胃15、20和25 mg/kg BW沙葱多糖,灌胃量为0.2 mL;第5天和第20天,BC组小鼠腹部皮下注射0.1 mL/只生理盐水,其余各组小鼠注射100 μg/只OVA溶液,二免后2周进行样品采集。

试验开始前对鼠房进行统一消毒处理,小鼠饲养于温度(20±1) ℃、相对湿度(55±5)%和光照12 h昼夜循环的鼠房中,饲喂商业化无污染饲粮,自由采食及饮水。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 小鼠体重和免疫器官指数测定

对小鼠进行定时灌胃,并称重记录。第35天,将小鼠进行空腹称重,脱颈处死;根据首次免疫前体重和二免后2周体重计算增重率;取出脾脏、胸腺用生理盐水冲洗干净,用滤纸吸净组织表面水分后称重,计算免疫器官指数。计算公式为:

增重率(%)=[(二免后2周体重-首免前体重)/首免前体重]×100;

脾脏(胸腺)指数(mg/g )=脾脏(胸腺)重(mg)/体重(g)。

1.5.2 小鼠脾脏形态和生发中心直径测定

将脾脏组织用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片成4 μm厚;将切片进行苏木精-伊红(HE)染色,在100倍镜下放大进行形态学检查;使用Case Viewer软件随机选取切片中的区域,选择完整的生发中心进行直径测定。

1.5.3 小鼠血清细胞因子和特异性抗体及其亚类含量测定

第35天,小鼠眼球采血,973.95×g离心15 min收集上清,于-20 ℃保存。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测血清OVA特异性抗体IgG和亚类IgG1、IgG2a、IgG2b含量以及细胞因子白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)和干扰素-γ(IFN-γ)含量。测定步骤严格按照试剂盒说明书方法进行操作,利用酶标仪(SYNERGY-H1,BioTek,美国)进行检测。

1.6 数据统计

试验数据使用Excel 2019进行初步整理后,采用SPSS 25.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),并进行LSD法多重比较。结果数据以“平均值±标准差”形式表示,P<0.01为差异极显著,P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 沙葱多糖对小鼠体重的影响

由表1可知,与BC组和OVA组相比,不同剂量沙葱多糖对试验各阶段小鼠体重和增重率均无显著影响(P>0.05)。

表1 沙葱多糖对小鼠体重的影响

Table 1 Effects of Allium mongolicum Regel polysaccharide on body weight of mice

项目 Items	组别Groups					P值 P-value
项目 Items	BC	OVA	LAMRP	MAMRP	HAMRP	P值 P-value
首免前体重 Weight before first immunization/g	25.79±2.28	25.65±1.29	26.64±1.89	26.21±2.98	25.30±1.54	0.824
二免前体重 Weight before second immunization/g	31.18±1.19	32.85±2.50	32.75±1.18	31.98±2.58	30.77±1.70	0.268
二免后2周体重 Weight for 2 weeks after second immunization/g	32.90±2.48	35.03±3.68	33.97±3.12	34.02±2.30	31.57±2.41	0.303
增重率WGR/%	33.62±5.73	36.72±13.62	27.50±7.42	30.65±11.19	28.34±8.25	0.499

	同行数据肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01),不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同小写字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。
	In the same row, values with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01), and with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same small letter or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 沙葱多糖对小鼠免疫器官指数及脾脏形态和生发中心直径的影响

由表2可知,与BC组和OVA组相比,各剂量沙葱多糖组小鼠胸腺指数均无显著差异(P>0.05);MAMRP组脾脏指数极显著提高(P<0.01),脾脏生发中心直径显著提高(P<0.05)。

表2 沙葱多糖对小鼠免疫器官指数及脾脏生发中心直径的影响

Table 2 Effects of Allium mongolicum Regel polysaccharide on immune organ indices and germinal center diameter in spleen of mice

项目 Items	组别Groups					P值 P-value
项目 Items	BC	OVA	LAMRP	MAMRP	HAMRP	P值 P-value
脾脏指数Spleen index/(mg/g)	5.27±1.09^Bb	5.88±0.81^Bb	4.84±0.70^Bb	7.04±0.79^Aa	5.71±1.07^Bb	0.003
胸腺指数Thymus index/(mg/g)	2.99±0.67	2.94±0.73	2.88±0.70	2.95±0.29	2.75±0.27	0.964
脾脏生发中心直径 Germinal center diameter in spleen/μm	385.13±40.14^b	440.73±33.19^b	439.90±27.63^b	574.00±148.42^a	453.98±74.85^b	0.047

如图1所示,MAMRP组小鼠脾脏生发中心明显大于BC组、OVA组、LAMRP组和HAMRP组。

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图1 小鼠脾脏组织HE染色结果

A~E分别表示BC组、OVA组、LAMRP组、MAMRP组和HAMRP组。

Fig.1 HE staining results of spleen tissues of mice (100×)

A to E represented BC group, OVA group, LAMRP group, MAMRP group and HAMRP group, respectively.

2.3 沙葱多糖对小鼠血清细胞因子含量的影响

由表3可知,与BC组和OVA组相比,各剂量沙葱多糖组小鼠血清IL-2和IL-4含量均无显著差异(P>0.05);MAMRP组和HAMRP组小鼠血清IL-10含量极显著提高(P<0.01)。与OVA组相比,LAMRP组和MAMRP组小鼠血清IFN-γ含量显著提高(P<0.05)。

表3 沙葱多糖对小鼠血清细胞因子含量的影响

Table 3 Effects of Allium mongolicum Regel polysaccharide on serum cytokine contents of mice

项目 Items	组别Groups					P值 P-value
项目 Items	BC	OVA	LAMRP	MAMRP	HAMRP	P值 P-value
白细胞介素-2 IL-2/(ng/L)	1 086.43±49.90	1 113.33±81.93	886.43±276.35	989.29±107.55	1 019.29±148.69	0.291
白细胞介素-4 IL-4/(pg/mL)	338.37±11.09	364.42±21.79	332.79±50.74	335.35±19.57	361.24±39.68	0.468
白细胞介素-10 IL-10/(pg/mL)	674.83±75.59^Bb	656.08±59.47^Bb	692.13±97.45^Bb	837.75±86.96^Aa	810.20±57.36^Aa	0.001
干扰素-γ IFN-γ/(ng/L)	693.24±45.46^ab	678.89±33.41^b	777.50±92.41^a	783.75±18.48^a	715.46±108.63^ab	0.045

2.4 沙葱多糖对小鼠血清特异性抗体IgG及其亚类含量的影响

由表4可知,与BC组相比,MAMRP组小鼠血清IgG含量极显著提高(P<0.01);与OVA组相比,HAMRP组血清IgG含量极显著降低(P<0.01)。与BC组和OVA组相比,各剂量沙葱多糖组小鼠血清IgG1含量均无显著差异(P>0.05);LAMRP组血清IgG1含量显著高于MAMRP组和HAMRP组(P<0.05)。与BC组和OVA组相比,各剂量沙葱多糖组小鼠血清IgG2a和IgG2b含量均无显著差异(P>0.05)。

表4 沙葱多糖对小鼠血清特异性抗体IgG及其亚类含量的影响

Table 4 Effects of Allium mongolicum Regel polysaccharide on contents of serum specific antibody IgG and its subclasses of mice

项目 Items	组别Groups					P值 P-value
项目 Items	BC	OVA	LAMRP	MAMRP	HAMRP	P值 P-value
免疫球蛋白G IgG	0.22±0.01^Bb	0.27±0.02^Aa	0.25±0.03^ABab	0.28±0.02^Aa	0.23±0.01^Bb	0.006
免疫球蛋白G1 IgG1	0.15±0.02^ab	0.15±0.02^ab	0.16±0.02^a	0.14±0.02^b	0.15±0.02^b	0.033
免疫球蛋白G2a IgG2a	0.26±0.02	0.27±0.01	0.24±0.03	0.24±0.04	0.25±0.01	0.136
免疫球蛋白G2b IgG2b	0.25±0.02	0.26±0.02	0.24±0.03	0.27±0.02	0.25±0.03	0.685

	数值为450 nm吸光度值。
	Values were optical density values at 450 nm.

3 讨论

疫苗的设计目的是刺激特异性和长时间的免疫反应,以实现对感染或疾病的长期保护^[2]。免疫佐剂是一种疫苗成分,可以增强免疫系统对抗原的识别,从而刺激细胞免疫和体液免疫。由减毒或灭活病原体组成的传统疫苗可以实现对免疫系统的持久有效刺激。然而,传统疫苗可能存在恢复病原体传染性的突变或病原体不完全失活等安全问题。因此,开发潜在有效、安全的新型免疫佐剂将解决现有疫苗研究中的一个重要问题^[1,12]。理想的免疫佐剂不仅要能引起体液免疫,而且要能诱导有效的细胞免疫。

植物多糖具有安全性能高、毒副作用小、功能多样,并且可作为免疫佐剂等优点。灌胃给药作为传统的给药途径被认为是相对安全的,并且经过胃肠道可很大程度地降低药物毒副作用。谢锋^[13]研究表明,灌胃小鼠不同剂量白术多糖对各个时期的体重均无显著影响,且在试验过程中小鼠无异常行为,这与本试验研究结果一致。在本试验中,灌胃小鼠不同剂量沙葱多糖对小鼠不同阶段体重及增重率均无显著影响,这可能与小鼠已接近体成熟有关;在整个试验过程中,小鼠也无任何异常行为,表明灌胃给药途径是安全的。

有研究认为,免疫器官指数能很好地反映机体免疫器官的重量变化,且能将个体差异影响降低到最低程度。胸腺和脾脏是重要的淋巴器官和淋巴细胞的生产者,脾脏指数和胸腺指数是机体免疫反应状态的指标^[14]。Feng等^[15]研究表明,利用立方液相给药系统包封OVA偶联杜仲叶多糖可显著提高胸腺指数和脾脏指数。本研究结果表明,不同剂量沙葱多糖对小鼠胸腺指数无显著影响,但MAMRP组小鼠脾脏指数极显著高于BC组和OVA组,这提示该组剂量下的沙葱多糖对OVA诱导的小鼠脾脏发育可能有一定的促进作用,且能刺激小鼠机体产生免疫反应,从而提高沙葱多糖对增强免疫器官重量的有效性。Zhou等^[2]研究发现,黄芪多糖组OVA诱导的小鼠脾脏生发中心显著变大,这与本试验研究结果类似。本试验采用形态计量方法发现,灌胃20 mg/kg BW沙葱多糖的小鼠脾脏生发中心增大,表明该组小鼠脾脏生发中心代谢活跃,进而增强了脾脏的特异性免疫功能。

佐剂影响免疫反应的性质,有利于机体对抗原的Th1或Th2型免疫反应。Th1和Th2免疫是免疫系统的重要组成部分,在体内起维持平衡作用。Th1细胞因子IL-2和IFN-γ参与促进细胞免疫应答,Th2细胞因子IL-4和IL-10则介导体液免疫应答^[16-17]。因此,血清细胞因子含量通常用于评估免疫反应的偏倚^[15]。Zhou等^[2]研究发现,黄芪多糖作为免疫佐剂可提高OVA免疫小鼠血清中IL-2、IL-10和IFN-γ等细胞因子含量,表明黄芪多糖增强了机体体液和细胞免疫。Feng等^[16]研究表明,灌胃小鼠川牛膝多糖可促进脾脏细胞中IL-4和IFN-γ细胞因子的分泌,以及CD4⁺ T细胞中的IL-2、IFN-γ和IL-4的分泌,表明川牛膝多糖可促进脾细胞因子的分泌,从而加强小鼠机体对OVA的免疫应答能力。Lin等^[18]研究发现,灵芝多糖作为免疫佐剂可增强小鼠脾脏中的CD4⁺和CD8⁺ T细胞分泌IFN-γ和IL-17的能力,从而产生佐剂作用。曾丽等^[19]研究发现,小鼠灌胃不同剂量太子参参须多糖可提高血清IFN-γ和IL-4含量,表明机体通过分泌相应的Th1和Th2细胞因子来提高其体液免疫和细胞免疫能力,在一定程度上增强机体对OVA的免疫应答反应。本试验研究结果表明,沙葱多糖对小鼠血清细胞因子IL-2和IL-4含量未产生影响,可能是不同提取物中的活性成分不尽相同所致。IL-10是由CD4⁺辅助性T细胞的Th2亚组产生的细胞因子,也由一些活化的B细胞和一些非淋巴细胞产生,如活化的巨噬细胞、角质形成细胞和滋养细胞,具有很强的抗炎作用,可以抑制促炎介质和促炎因子的合成,并发挥炎症介导作用^[20]。IFN-γ是CD4⁺辅助性T细胞中最为主要的细胞介质,可诱导幼稚T辅助细胞向Th1分化^[21]。本研究结果表明,灌胃15和25 mg/kg BW沙葱多糖分别显著提高了小鼠血清Th1细胞因子(IFN-γ)和Th2细胞因子(IL-10)的产生,灌胃20 mg/kg BW沙葱多糖可诱导Th1细胞因子(IFN-γ)和Th2细胞因子(IL-10)的产生,说明沙葱多糖能够刺激机体分泌相应的Th1和Th2细胞因子,以此来提高机体体液和细胞免疫能力,原因可能是沙葱多糖通过刺激CD4⁺辅助性T细胞和脾脏淋巴细胞来提高细胞因子的分泌,进而在一定程度上增强机体对OVA的免疫应答反应,后续可继续从分子层面探究沙葱多糖作为免疫佐剂的作用机制。

血清中抗原特异性抗体IgG及其亚类的含量反映机体的免疫状态。此外,在免疫应答过程中,通常使用蛋白亚类的比例来评估细胞活性^[22]。IgG1的产生是Th2极化免疫反应的特征,而IgG2a的产生是Th1极化免疫反应的特征。IgG2a/IgG1值高表明偏向Th1型免疫反应^[23]。Liu等^[24]利用立方脂质体联合黄精多糖制备成免疫佐剂与OVA一起免疫小鼠,结果显示免疫后该免疫佐剂可以促使小鼠特异性IgG的分泌,提高其体液免疫反应能力,表明被修饰的黄精多糖具有很好的佐剂作用。谢锋^[13]研究表明,小鼠口服白术多糖作为免疫佐剂可提高特异性抗体IgG含量。太子参参须多糖作为免疫佐剂时可显著提高小鼠血清中特异性抗体亚类含量^[19]。免疫茯苓多糖的小鼠血清OVA特异性抗体IgG、IgG2a和IgG1含量均显著升高^[25]。川明参多糖可提高小鼠血清特异性IgG及其亚类抗体滴度,从而产生一定的佐剂作用^[26]。本研究结果表明,与BC组相比,灌胃20 mg/kg BW沙葱多糖显著提高小鼠血清OVA特异性抗体IgG含量,说明该剂量沙葱多糖可以提高小鼠机体体液免疫应答水平;各剂量沙葱多糖组血清IgG1和IgG2a含量均无显著差异,这与其他多糖类提取物作为免疫佐剂的试验结果不一致,可能与提取物活性组分和给药途径等不同有关。不过,虽然不能从特异性抗体亚类角度提示沙葱多糖偏向Th1还是Th2型免疫,但可从一定程度上说明沙葱多糖具有提高机体对OVA的免疫应答能力。

4 结论

沙葱多糖可提高小鼠对抗原OVA的免疫能力,进而表现出一定的佐剂效用,可以作为一种有效的疫苗佐剂诱导机体免疫应答。综合各项指标,在本试验条件下,小鼠灌胃20 mg/kg BW沙葱多糖时其免疫佐剂效果较佳。

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