在现代家禽养殖业中,细菌性疾病严重影响禽类的健康成长及产业经济效益[1]。由于急性败血症、关节炎、雏鸡脐炎、输卵管炎等多种疾病的频发以及由此导致的雏鸡和中雏死亡率增加,使得家禽业的健康发展受到严重制约[2]。尽管传统上使用抗生素可以有效抑制这些细菌感染,但长期滥用抗生素已引发了全球范围内的细菌耐药性问题[3],致使我国已全面禁止抗生素在饲料中的添加和使用[4]。因此,研发新型、安全、高效的抗生素替代品成为重要课题[5]。抗菌肽作为一种天然存在于生物体内的免疫活性物质,因其广谱抗菌、低耐药性、无药物残留等优势,成为了替代抗生素的理想候选[6]。昆虫抗菌肽是一类由昆虫产生的小分子蛋白质,它们是昆虫先天免疫系统的重要组成部分,在对抗病原微生物如细菌、真菌、病毒等入侵时起到关键作用[7]。这些抗菌肽是在昆虫受到感染或者外部刺激后,通过特定的信号传导途径被诱导产生的[8]。昆虫抗菌肽的研究对于理解昆虫免疫机制以及开发新的抗生素替代品具有重要意义[9]。
美洲大蠊作为蜚蠊目蜚蠊科的一种古老昆虫,虽携带多种致病菌却能自我抵抗,体内富含多种活性物质,具有良好的抗菌特性及丰富的营养价值,是潜在的抗菌肽资源[10]。研究表明,美洲大蠊体内能产生1种或多种抗菌肽[11],这类抗菌肽具有显著的抗菌活性,不仅能够抑制甚至杀死多种细菌,如大肠杆菌,而且其抗菌作用机制可能涉及到直接破坏细菌细胞膜的结构[12]。此外,进一步的研究还发现,美洲大蠊抗菌肽可能具有更广泛的生物活性,包括但不限于抗癌活性,能够抑制癌细胞增殖,促进正常细胞修复,并增强正常细胞活性[13]。因此,本研究旨在以大肠杆菌为诱导源使美洲大蠊产生抗菌肽,并测定其对不同致病菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌)的抑菌效果,为其进一步在家禽业中作为饲料添加剂替代抗生素提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试昆虫
美洲大蠊由石河子大学农学院昆虫研究所提供,虫龄为5龄。饲养温度保持在28~30 ℃,相对湿度保持在65%~75%。
1.1.2 供试菌株
大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌由石河子大学动物科技学院微生物实验室提供。
1.1.3 主要试剂
主要试剂有LB肉汤液体培养基(青岛海博生物有限公司)、LB肉汤固体培养基(青岛海博生物有限公司)、琼脂粉(上海生物工程有限公司)、乙酸铵缓冲溶液(上海生物工程有限公司)、苯甲基磺酰氟(上海生物工程有限公司)、疏基乙醇(上海生物工程有限公司)和环丙酰胺(上海生物工程有限公司)。
1.1.4 主要仪器
主要仪器有真空冷冻干燥机(美国Thermo Fisher公司)、分析天平(北京楚齐仪表责任有限公司)、超清台(美国Thermo Fisher公司)、紫外分光光度计(美国Thermo Fisher公司)、酶标仪(美国Thermo Fisher公司)、高速冷冻离心机(美国Thermo Fisher公司)、组织研磨仪(上海净信实业发展有限公司)、无菌离心管(上海生物工程有限公司)和微量移液枪(艾本德生物有限公司)。
1.2 试验方法
1.2.1 细菌制备
将已有的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌置于LB液体肉汤培养基中,37 ℃摇床培养12 h,收集细菌调至浓度为1×108 CFU/kg,用于后续试验。
1.2.2 美洲大蠊抗菌肽诱导及提取
选取100只5龄美洲大蠊,随机分为2组,每组5个重复,每个重复10只。诱导组以1×108 CFU/kg的大肠杆菌为诱导源,用微量注射器向美洲大蠊的背腹部注射1 μL的诱导源,对照组注射1 μL的生理盐水,适宜环境下饲养,分别在诱导后12、24、36、48、60、72 h后挑取活的虫体。
美洲大蠊抗菌肽提取方法参照本课题组朱小奇等[14]的方法并进行改进。按照分组将美洲大蠊处理干净后放入研钵中,按重量体积比为1∶3加入提取液(0.05 mol/L,pH=5的乙酸铵缓冲液,35 μg/mL苯甲基磺酰氟,2‰巯基乙醇),匀浆液在高速冷冻离心机8 049×g离心30 min,重复3次合并上清液,100 ℃水浴5 min,1 288×g离心30 min,去除变性蛋白,取上清液装入超滤离心管浓缩,截留分子质量在3.5 ku的浓缩液于-20 ℃保存。
1.2.3 美洲大蠊抗菌肽蛋白浓度测定
使用BCA试剂盒测定美洲大蠊抗菌肽蛋白浓度,按试剂盒说明书稀释标准液和配制BCA工作液。按照加样顺序在96孔板中加牛血清白蛋白(BSA)蛋白标样以及适当稀释的BSA蛋白样品(20 μL),BSA蛋白标准样需要用磷酸盐缓冲液稀释液补足到20 μL;每孔加BCA工作液200 μL,振荡混匀后在37 ℃培养箱中静置30 min,之后用酶标仪测量吸光度值(波长设为562 nm),每个样品反复测3次,以标准蛋白浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线(图1),并计算待测样品蛋白浓度。
1.2.4 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定
采用不连续体系制备聚丙烯酰胺凝胶电泳,浓缩胶浓度为5%,分离胶浓度为12%,简要操作步骤为:0.5 mL菌液→2 124×g离心10 min收集菌体→弃上清→加40 μL TE缓冲液菌体悬浮→加40 μL 2×蛋白样品缓冲液,混匀→100 ℃水浴煮沸10 min→冷却后取30 μL上样→电泳4 h(浓缩胶90 V 1.5 h,分离胶120 V 3 h)→倒出电泳缓冲液,用水冲洗电泳槽→小心撬开玻璃,剥胶→用考马斯亮蓝R250染色1 h→加约200 mL脱色液脱色过夜→弃去脱色液,用水冲洗凝胶并用Image MasterVDS系统扫描拍照。
1.2.5 美洲大蠊抗菌肽抑菌活性测定(滤纸片扩散法)
取30 μL的大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌,均匀涂布在LB固体培养基上。将直径为6 mm的滤纸片高压灭菌后,放入装有不同时间段提取的美洲大蠊抗菌肽和抗生素(20 μg/mL)的无菌烧杯中浸泡5 min,用无菌镊子取出,在超清台中放置5 min,制成药敏片。在涂好大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的LB固体培养基中分别放入不同时间提取的美洲大蠊抗菌肽和抗生素制成的药敏片,二者中心距离不低于23 mm,纸片距培养皿内缘距离不小于15 mm,在37 ℃培养箱中培养18~24 h后用游标卡尺测量抑菌圈直径的大小,重复试验3次并记录数据。抑菌圈直径=0 mm为不抑菌,0~15 mm为低度抑菌,15~19 mm为中度抑菌,≥19 mm为高度抑菌。
1.2.6 美洲大蠊抗菌肽最小抑菌浓度(MIC)测定
采用微量肉汤稀释法测定美洲大蠊抗菌肽最小抑菌浓度。将浓度为1×108 CFU/mL的大肠杆菌、沙门氏菌和金葡萄球菌经MH肉汤(Mueller-Hinton broth)培养基、7.5% NaCl肉汤培养基1∶1 000稀释后,向每孔加入100 μL。美洲大蠊抗菌肽提取液和环丙沙星分别按照0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mg/L的浓度添加到无菌的96孔板中,每孔加10 μL。封好后将96孔板于37 ℃培养12~24 h,观察结果。
1.2.7 美洲大蠊抗菌肽热稳定性测定
将美洲大蠊抗菌肽提取液分别在55、65、75、85、95和100 ℃水浴10 min后,以高速冷冻离心机(8 049×g,4 ℃)离心15 min,收集上清液,测定对大肠杆菌的抑菌效果,每个处理重复测定3次。以未经水浴的样品作为对照组(设定对照组的抑菌率为100%)。
1.2.8 美洲大蠊抗菌肽反复冻融性测定
将冻存在-20 ℃的美洲大蠊抗菌肽提取液分别反复冻融1、2、4、6、8和10次,高速冷冻离心机(8 049×g,4 ℃)离心15 min。收集上清液,测定上清液对大肠杆菌的抑菌效果,每个处理重复测定3次。以未经处理的美洲大蠊抗菌肽提取液作为对照组(设定对照组的抑菌率为100%)。
1.2.9 不同pH对美洲大蠊抗菌肽活性的影响
配制pH分别为1、3、5、7、9和11的磷酸盐缓冲溶液,按体积比1∶1将不同pH溶液与美洲大蠊抗菌肽提取液混匀,室温静置1 h后检测其对大肠杆菌的抑菌效果,重复测定3次。以未经处理的美洲大蠊抗菌肽提取液作为对照组(设定对照组的抑菌率为100%)。
1.3 数据分析
应用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析,Duncan氏多重比较法检验组间差异显著性,数据用“平均值±标准误”表示,P>0.05表示差异不显著,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。
2 结果与分析
2.1 SDS-PAGE结果
如图2所示,与对照组相比,大肠杆菌诱导组的美洲大蠊抗菌肽提取液增加了1条分子质量在7.5 ku左右的蛋白条带。
2.2 不同时间点美洲大蠊抗菌肽提取液的蛋白浓度
如表1所示,诱导后12、24、36、48、60、72 h,诱导组美洲大蠊抗菌肽提取液的蛋白浓度极显著高于对照组(P<0.01)。诱导后12~48 h,美洲大蠊抗菌肽提取液的蛋白浓度随着诱导时间的增加而增加;诱导后60~72 h,美洲大蠊抗菌肽提取液的蛋白浓度随着诱导时间的增加呈现下降趋势。美洲大蠊抗菌肽提取液的蛋白浓度在诱导后48 h时最高,因此选择48 h时诱导产生的美洲大蠊抗菌肽进行后续的抑菌试验。
表1 不同时间美洲大蠊抗菌肽提取液的蛋白浓度Table 1 Protein concentration of extracting solution of antimicrobial peptides from Periplaneta americana at different timemg/mL |
| 项目 Items | 时间Time/h | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 12 | 24 | 36 | 48 | 60 | 72 | |
| 对照组Control group | 0.987±0.010A | 0.987±0.020A | 0.984±0.025A | 0.999±0.033A | 1.023±0.026A | 1.021±0.030A |
| 诱导组Induction group | 1.121±0.018B | 1.313±0.050B | 1.521±0.040B | 1.673±0.036B | 1.496±0.035B | 1.323±0.034B |
同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。 | |
In the same column, values with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). |
2.3 美洲大蠊抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌效果
如表2所示,与对照组相比,诱导组的大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径极显著升高(P<0.01)。诱导组的大肠杆菌的抑菌圈直径高达23 mm左右,显著高于沙门氏菌和金黄色葡萄球菌(P<0.05),且金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径显著高于沙门氏菌(P<0.05)。对照组的大肠杆菌的抑菌圈直径显著高于沙门氏菌(P<0.05),但金黄色葡萄球菌与大肠杆菌、沙门氏菌之间的抑菌圈直径无显著差异(P>0.05)。
表2 美洲大蠊抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌圈直径Table 2 Diameter of antibacterial circle of antimicrobial peptides from Periplaneta americana on Escherichia coli, Salmonella and Staphylococcus aureusmm |
| 项目 Items | 抑菌圈直径Diameter of antibacterial circle | ||
|---|---|---|---|
| 大肠杆菌 Escherichia coli | 沙门氏菌 Salmonella | 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus | |
| 对照组Control group | 17.85±0.40Aa | 15.94±0.25Ab | 16.86±0.39Aab |
| 诱导组Induction group | 23.86±1.39Bc | 17.94±0.24Ba | 18.87±0.29Bb |
同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)。 | |
In the same column, values with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). |
如图3所示,诱导组的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌圈直径明显大于对照组。
图3 美洲大蠊抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌效果从上到下,依次是大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌圈,左边为对照组,右边为诱导组。 Fig.3 Antibacterial effects of antimicrobial peptides from Periplaneta americana on Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Salmonella From top to bottom, the inhibition circles of Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Salmonella were shown successively, the control group on the left and the induction group on the right. |
2.4 美洲大蠊抗菌肽最小抑菌浓度
如表3所示,美洲大蠊抗菌肽对大肠杆菌的最小抑菌浓度1.0 mg/L,对沙门氏菌的最小抑菌浓度为3.0 mg/L,对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为2.5 mg/L。
表3 美洲大蠊抗菌肽最小抑菌浓度Table 3 Minimum inhibitory concentration of antimicrobial peptides from Periplaneta americana |
| 美洲大蠊抗菌 肽浓度 Antimicrobial peptides from Periplaneta americana/(mg/L) | 大肠杆菌 Escherichia coli | 沙门氏菌 Salmonella | 金葡萄球菌 Staphylococcus aureus | 环丙沙星浓度 Ciprofloxacin concentration/ (mg/L) | 大肠杆菌 Escherichia coli | 沙门氏菌 Salmonella | 金葡萄球菌 Staphylococcus aureus | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 5.0 | - | - | - | 5.0 | - | - | - | |
| 4.5 | - | - | - | 4.5 | - | - | - | |
| 4.0 | - | - | - | 4.0 | - | - | - | |
| 3.5 | - | - | - | 3.5 | - | - | - | |
| 3.0 | - | + | - | 3.0 | - | - | - | |
| 2.5 | - | + | + | 2.5 | - | + | - | |
| 2.0 | - | ++ | ++ | 2.0 | - | + | + | |
| 1.5 | - | ++ | ++ | 1.5 | - | ++ | ++ | |
| 1.0 | + | ++ | ++ | 1.0 | - | ++ | ++ | |
| 0.5 | ++ | ++ | ++ | 0.5 | + | ++ | ++ | |
| 0.0 | ++ | ++ | ++ | 0.0 | ++ | ++ | ++ |
-:无细菌生长;++:细菌正常生长;+:只有少量细菌生长。 | |
-: no bacterial growth; ++: bacteria normal growth; +: only a small number of bacteria grow. |
2.5 美洲大蠊抗菌肽热稳定性
如表4所示,与对照组相比,经55、65 ℃水浴加热后的美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌圈直径差异不显著(P>0.05),抑菌率分别为99.1%和96.3%;经75 ℃水浴加热后的美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌直径显著降低(P<0.05),抑菌率在90%以上;经85、95、100 ℃水浴加热后的美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌直径显著降低(P<0.05),自85 ℃起,随着温度的升高美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌率逐渐降低,但仍然维持在68%以上。以上结果表明,经大肠杆菌诱导的美洲大蠊抗菌肽提取液具有较好的热稳定性。
表4 不同温度对美洲大蠊抗菌肽提取液抑菌活性的影响Table 4 Effects of different temperatures on antibacterial activity of extracting solution of antimicrobial peptides from Periplaneta americana |
| 项目 Items | 抑菌圈直径 Diameter of antibacterial circle/mm | 抑菌率 Bacteriostasis rate/% |
|---|---|---|
| 温度Temperature/℃ | ||
| 55 | 22.176±0.167a | 99.1 |
| 65 | 21.759±0.113a | 96.3 |
| 75 | 20.447±0.299b | 90.5 |
| 85 | 19.968±0.726b | 88.4 |
| 95 | 17.361±0.669c | 76.8 |
| 100 | 15.554±0.712d | 68.8 |
| 对照组Control group | 22.485±0.040a | 100.0 |
同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。 | |
In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below. |
2.6 美洲大蠊抗菌肽反复冻融稳定性
如表5所示,与对照组相比,随着冻融次数的增加,美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌圈直径出现不同程度地下降;冻融2、4、6、8、10次的美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌圈直径显著降低(P<0.05)。在冻融次数6次以内时,美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌率仍然维持在90%以上。以上结果表明,少次的反复冻融不会对美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌活性产生影响,但是随着冻融次数的增加,会降低美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌活性。
表5 不同冻融次数对美洲大蠊抗菌肽提取液抑菌活性的影响Table 5 Effects of different time of freezing and thawing on antibacterial activity of extracting solution of antimicrobial peptides from Periplaneta americana |
| 项目 Items | 抑菌圈直径 Diameter of antibacterial circle/mm | 抑菌率 Bacteriostasis rate/% |
|---|---|---|
| 冻融次数Times of freezing and thawing/次 | ||
| 1 | 22.369±0.269a | 97.7 |
| 2 | 21.875±0.143b | 95.6 |
| 4 | 21.659±0.090b | 94.6 |
| 6 | 20.569±0.122c | 90.3 |
| 8 | 19.952±0.073d | 87.0 |
| 10 | 17.903±0.225e | 78.2 |
| 对照组Control group | 22.879±0.139a | 100.0 |
2.7 美洲大蠊抗菌肽pH稳定性
如表6示,与对照组相比,经不同pH溶液处理后,美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌圈直径出现不同程度地下降,pH为1、3、7、9、11溶液处理后的美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌圈直径显著降低(P<0.05)。经不同pH溶液处理后,美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌率仍然维持在60%以上;在pH为5、7时,美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌率为90%以上;在pH为5时,美洲大蠊抗菌肽提取液的抑菌率最高,达99.3%。以上结果表明,过酸或过碱的环境均不利于美洲大蠊抗菌肽提取液的稳定性。
表6 不同pH对美洲大蠊抗菌肽提取液抑菌活性的影响Table 6 Effects of different pH on antibacterial activity of extracting solution of antimicrobial peptides from Periplaneta americana |
| 项目 Items | 抑菌圈直径 Diameter of antibacterial circle/mm | 抑菌率 Bacteriostasis rate/% |
|---|---|---|
| pH | ||
| 1 | 9.683±0.246e | 57.3 |
| 3 | 12.402±0.500b | 73.3 |
| 5 | 16.715±0.770a | 99.3 |
| 7 | 15.606±0.173c | 92.3 |
| 9 | 13.483±0.289d | 79.7 |
| 11 | 10.408±0.375e | 61.5 |
| 对照组Control group | 16.898±0.336a | 100.0 |
3 讨论
昆虫的蛋白质资源丰富,粗蛋白质含量是畜禽的2~3倍,同时富含各种氨基酸,抗菌肽、溶菌蛋白、各类防御素等,具有抑制细菌繁殖、抗真菌和抗病毒等多种作用[15-16]。美洲大蠊体内蛋白质含量丰富,高达63.1%,与秘鲁鱼粉的粗蛋白质含量(62%)相近[17]。昆虫抗菌肽是指昆虫体内经诱导后产生的一种具有抗菌活性,且分子质量在2~7 ku的活性多肽[18]。本研究通过SDS-PAGE试验发现,经大肠杆菌诱导后的美洲大蠊抗菌肽出现了一条分子质量在7.5 ku左右的蛋白质条带。张雪等[19]研究表明,在鹌鹑的饲粮里添加浓度为23.19 mg/L蝇蛆抗菌肽可以观察到鹌鹑血液的免疫球蛋白含量显著升高,肠道内的优势菌群数量显著升高。何晓辉等[20]试验表明,经大肠杆菌诱导的黄粉虫幼虫会产生一种特别的物质,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等相关致病菌有抑制作用。抑菌活性受到蛋白浓度高低的直接影响[21]。本试验通过对不同时间段美洲大蠊抗菌肽提取液蛋白浓度的测定发现,在诱导后48 h之内美洲大蠊抗菌肽提取液的蛋白浓度随着诱导时间的增加而升高,在48 h时达到最高,之后开始逐渐降低,这与前人研究的抗菌肽最佳的提取时间在诱导后48 h相符[22]。抑菌圈的大小代表着抑菌活性的高低[23]。朱小奇等[14]在研究黄粉虫抗菌肽的提取及其理化性质的结果表明,黄粉虫抗菌肽对大肠杆菌的抑菌圈直径在23 mm左右。阿琪玛[24]研究发现,厩螫蝇的抗菌蛋白提取液对大肠杆菌的抑菌直径为25.55 mm左右。本试验采用大肠杆菌诱导后48 h时产生的美洲大蠊抗菌肽来进行抑菌试验,结果表明对大肠杆菌的抑菌效果最好,抑菌圈的直径在23 mm左右。不同的方法和诱导源所产生的抗菌肽也不相同[25],同一抗菌肽或不同抗菌肽对同一种菌或不同菌的抑菌效果也不同[26]。在家禽业的生产过程中,除了大肠杆菌之外,金黄色葡萄球菌和沙门氏菌也是引起家禽发病的主要致病菌[27]。本研究通过美洲大蠊抗菌肽对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抑菌活性的测定,结果表明美洲大蠊抗菌肽对这2种致病菌也存在一定的抑菌效果。
从温度稳定性来看,美洲大蠊抗菌肽提取液在55~65 ℃保持良好的热稳定性,抑菌率超过90%,但在75 ℃及以上温度下,抑菌活性降低,但仍能维持一定的抑菌效果,特别是在85~100 ℃时,抑菌圈直径显著变小。另外,针对反复冻融稳定性的结果表明,美洲大蠊抗菌肽提取液经过多次冻融处理后,尽管抑菌圈直径有所下降,但在冻融次数6次以内仍能保持90%以上的抑菌率,暗示少量的冻融循环不影响其抑菌活性,但频繁冻融会影响其抑菌活性。在pH稳定性的结果表明,美洲大蠊抗菌肽提取液在中性偏酸环境(pH为3~5)中具有最佳抑菌活性,尤其在pH为5时抑菌率高达99.3%,而在极端酸性和碱性条件下抑菌活性减弱,但即使在较低抑菌率下,抑菌活性依然维持在60%以上,说明其在一定酸碱变化范围内具有一定稳定性。以上结果与大多数的研究结果相一致,张建新等[28]研究表明,黄粉虫抗菌肽在121 ℃加热25 min后,抑菌活性有所降低,但是仍然能保持基本的抑菌效果,显示黄粉虫抗菌肽具有较好的热稳定性。高诗琪等[29]在研究斗米虫抗菌肽生化特性的时候,发现斗米虫抗菌肽经不同温度水浴后,其抑菌活性仍然维持在一定的范围内,证明斗米虫抗菌肽具有较好的热稳定性;在不同的pH溶液处理后,显示过酸或过碱的环境都会影响斗米虫抗菌肽的抑菌活性;少次的反复冻融不会影响斗米虫抗菌肽的抑菌活性,但随着冻融次数的增加会逐渐降低。
4 结论
本试验在前人的研究基础上进行改进提取出了美洲大蠊抗菌肽,采用SDS-PAGE试验确定了美洲大蠊抗菌肽的分子质量在7.5 ku左右。通过对美洲大蠊抗菌肽提取液蛋白浓度和抑菌活性的测定,表明美洲大蠊抗菌肽的最佳提取时间在诱导后48 h,其对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有不同程度的抑菌效果,为美洲大蠊抗菌肽作为饲料添加剂在家禽业的应用奠定了基础。