Chinese Journal of Animal Nutrition >

2024 , Vol. 36 >Issue 10: 6279 - 6292

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.535

RESEARCH PAPER

Effects of Adding Different Sources of Microecological Preparations Instead of Antibiotics to Diets on Growth Performance, Serum Biochemical Indexes, Nutrient Apparent Digestibility, and Fecal Microbiota of Weaned Piglets

  • DUAN Xiaoyan , 1 ,
  • HU Mingyang 1 ,
  • LIU Xule 1 ,
  • JING Kunpeng 1 ,
  • ZHU Xiaoyan 1, 2 ,
  • YANG Xiaojin 3 ,
  • FAN Shouwu 3 ,
  • LI Zhentian , 1, 2, 3, *
Expand
  • 1 College of Animal Science and Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
  • 2 Key Laboratory of Innovation and Utilization of Forage Resources in Henan Province, Zhengzhou 450002, China
  • 3 Luoyang Ouke Baike Biotechnology Co., Ltd., Luoyang 471600, China
*associate professor, E-mail:

Received date: 2024-04-11

  Online published: 2024-10-14

Fold

Abstract

To investigate the effects of dietary microecological preparations from different sources on growth performance, serum immunity, antioxidant function, nutrient apparent digestibility and fecal microbiota of weaned piglets, 156 healthy “Duroc×Landrace×Large” weaned piglets were randomly divided into 4 groups (3 replicates per group and 13 pigs per replicate) using a single factor design. They were divided into antibiotic group (basal diet+0.15 g/kg aureomycin, AN group), low-concentration Bacillus licheniformis group (basal diet+0.5 g/kg Bacillus licheniformis, LBL group), high-concentration Bacillus licheniformis group (basal diet+1.0 g/kg Bacillus licheniformis, HBL group), and Enterococcus faecalis group (basal diet+0.5 g/kg Enterococcus faecalis, EF group). The experiment lasted for 28 days. The results showed as follows: The results showed as follows: 1) compared with the AN group, the final weight and average daily weight gain (ADG) of the HBL and EF groups significantly increased (P<0.05), while the feed to gain ratio (F/G) of the LBL group significantly decreased (P<0.05); compared with the LBL group, the EF group showed a significant increase in average daily feed intake (ADFI) (P<0.05). 2) Compared with the AN group, the contents of serum immunoglobulin A (IgA), interleukin-2 (IL-2), interleukin-4 (IL-4), interleukin-6 (IL-6), and tumor necrosis factor-α(TNF-α) in the LBL group and EF group were significantly increased (P<0.05), while the serum malondialdehyde (MDA) content and catalase (CAT) activity in the EF group were significantly decreased (P<0.05) and increased (P<0.05), respectively. 3) Compared with the AN group, the apparent digestibility of crude protein in the HBL group was significantly increased (P<0.05). 4) Compared with the AN group, the LBL and HBL groups downregulated the relative abundance of Firmicutes, while the EF group upregulated the relative abundance of Firmicutes; the relative abundance of Actinobacteria was upregulated in all experimental groups, and the LBI group upregulated the relative abundance of Bacteroidetes. In conclusion, adding probiotics to the diet can improve the growth performance of weaned piglets, enhance immunity and antioxidant activity, and improve the fecal microbiota. In all experimental groups, the addition of Enterococcus faecalis preparation showed better experimental results than Bacillus licheniformis preparation.

Key words： microecological preparations; weaned piglets; growth performance; serum biochemical indexes; fecal microbiota

Cite this article

DUAN Xiaoyan , HU Mingyang , LIU Xule , JING Kunpeng , ZHU Xiaoyan , YANG Xiaojin , FAN Shouwu , LI Zhentian . Effects of Adding Different Sources of Microecological Preparations Instead of Antibiotics to Diets on Growth Performance, Serum Biochemical Indexes, Nutrient Apparent Digestibility, and Fecal Microbiota of Weaned Piglets[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2024 , 36(10) : 6279 -6292 . DOI: 10.12418/CJAN2024.535

仔猪早期断奶可以提高养殖场经营效益,但由于饲粮、养分来源、环境变更等会引起仔猪产生应激反应,仔猪胃肠道黏膜结构、肠道屏障和微生物菌群平衡发生变化,出现采食量下降、腹泻率升高等问题,严重时会导致仔猪死亡[1-2]。抗生素是当前治疗人类和牲畜感染性疾病的最有效药物之一,主要用于控制和预防由革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌等引起的人类和动物疾病,并作为饲料添加剂促进禽畜生长[3],维持和改善动物健康。然而,大多数抗生素并不能被机体充分代谢,过度滥用会导致动物耐药性增强、药物残留、环境污染等负面问题[4]。我国自2020年7月1日起饲料业开始全面禁抗,而且《饲料添加剂安全使用规范》[5]明确规定了断奶仔猪饲粮中氧化锌最高限量不得超过1 600 mg/kg。在此双重压力下,寻找新的替抗方案已成为目前养殖业的趋势。
微生态制剂又称活菌制剂、促生素或益生素[6],是利用益生菌制成的活菌制剂,添加到饲粮中可以改善动物的肠道菌群的平衡,提高生长性能和免疫功能,具备纯天然、无公害、无残留等优势[7]。粪肠球菌(Enterococcus faecalis)是人和动物肠道中的共生益生菌,具有很强的抑菌和产酸能力[8],是理想的替抗产品。研究表明,饲粮中添加复合枯草芽孢杆菌、粪肠球菌混剂和地衣芽孢杆菌制剂能改善畜禽、猪肠道发育,提高生产性能和免疫功能[9⇓-11]。因此,本试验通过在饲粮中添加不同来源微生态制剂饲喂断奶仔猪,旨在比较不同替抗方案对断奶仔猪生长性能和养分表观消化率的影响,以选择合适的配比,为生猪养殖提供新的参考思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

金霉素:粉剂,纯度为25%。地衣芽孢杆菌制剂:活菌数量≥1.25×109 CFU/g。粪肠球菌制剂:活菌数量≥1.0×1010 CFU/g。试验用猪由洛阳高品生态养殖猪场提供。

1.2 试验设计

试验选择体重为(12.30±0.10) kg、健康的“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪156头,随机分为4组,每组3个重复,每个重复13头猪。4个组分别为抗生素组(基础饲粮+0.15 g/kg金霉素,AN组)、低浓度地衣芽孢杆菌制剂组(基础饲粮+0.5 g/kg地衣芽孢杆菌制剂,LBL组)、高浓度地衣芽孢杆菌制剂组(基础饲粮+1.0 g/kg地衣芽孢杆菌制剂,HBL组)、粪肠球菌制剂组(基础饲粮+0.5 g/kg粪肠球菌制剂,EF组)。试验从仔猪断奶(42±1) 日龄开始,试验期28 d。基础饲粮按照NRC(2012)标准配制,其组成及营养水平见表1。
表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)%

项目 Items 含量 Content
原料 Ingredients
玉米 Corn 38.00
小麦面粉 Wheat flour 25.00
葡萄糖 Glucose 5.00
豆粕 Soybean meal 18.00
发酵豆粕 Fermented soybean meal 6.00
乳化油粉 Emulsified oil powder 3.00
石粉 Limestone 1.00
磷酸氢钙 CaHPO4 1.00
氯化胆碱 Choline chloride 0.05
酸化剂 Acidifier 0.30
植酸酶 Phytase 0.04
L-赖氨酸 L-Lys 0.80
L-苏氨酸 L-Thr 0.25
DL-蛋氨酸 DL-Met 0.18
L-色氨酸 L-Try 0.08
氯化钠 NaCl 0.20
多矿预混料 Multi-mineral premix1) 0.80
多维预混料 Multi-vitamin premix2) 0.10
抗氧化剂 Antioxidant 0.05
防霉剂 Fungicide 0.10
乳猪复合酶
Suckling pig complex enzyme3)		 0.05
合计 Total 100.00
营养水平 Nutrient levels4)
消化能 DE/(MJ/kg) 14.23
净能 NE/(MJ/kg) 10.46
干物质 DM 88.94
粗蛋白质 CP 19.21
粗脂肪 EE 3.27
粗灰分 Ash 5.60
钙 Ca 0.77
总磷 TP 0.43
赖氨酸 Lys 1.32
蛋氨酸 Met 0.43
苏氨酸 Thr 0.83
色氨酸 Trp 0.24
中性洗涤纤维 NDF 53.80
酸性洗涤纤维 ADF 3.75

1) 多矿预混料为每千克饲粮提供 Multi-mineral premix provided the following per kilogram of the diet:Fe 120 mg,Cu 125 mg,Mn 30 mg,Zn 80 mg,I 10 mg,Se 0.5 mg。

2)多维预混料为每千克饲粮提供 Multi-vitamin premixed provided the following per kilogram of the diet:VA 9 000 IU,VD3 3 000 IU,VE 50 IU,VK3 10 mg,VB1 0.4 mg,VB2 6.6 mg,VB6 0.8 mg,VB12 16 mg,烟酸 nicotinic acid 29 mg,泛酸 pantothenic acid 14.36 mg,叶酸 folic acid 0.4 mg,生物素 biotin 0.018 mg。

3)乳猪复合酶组成 Composition of suckling pig complex enzyme:木聚糖酶活性 xylanase activity≥10 000 U/g,β-甘露聚糖酶活性 β-mannanase activity≥1 200 U/g,半乳糖苷酶活性 galactosidase activity≥200 U/g,淀粉酶活性 amylase activity≥2 000 U/g,水分 moisture≤10.0%,β-葡聚糖酶活性 β-glucanase activity 21 000 U/g,纤维素酶活性 cellulase activity 2 300 U/g,果胶酶活性 pectase activity 23 000 U/g,蛋白酶活性 proteinase activity 24 500 U/g。

4) 消化能和净能根据《中国饲料成分及营养价值表(2023年第34版)》计算而得,其他营养水平均为测定值。DE and NE were calculated according to Tables of China Feed Composition and Nutritional Value (34th Edition,2023),while the other nutrient levels were measured values.

1.3 饲养管理

试验在洛阳高品生态养殖猪场进行。本研究中概述的试验程序已获得河南农业大学试验动物护理和使用指南的批准(批准号HENAU-2022-015)。饲喂时将不同来源和比例的微生态制剂直接混入基础饲粮中作为整体饲粮饲喂。试验各组猪只在同一栋保育舍内不同保育栏进行,饲养管理条件一致,分别于每天06:00、11:30和17:30进行饲喂,06:30定时清理圈舍,保持猪圈干净,定时通风。试验期仔猪自由采食与饮水,按照养殖场常规饲养管理和免疫。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 生长性能

在试验期间每天准确记录各组仔猪的采食量,在试验开始和结束时分别对仔猪空腹称重,计算试验期内仔猪断奶后平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

平均日增重=(末重-初重)/饲养天数;

平均日采食量=总采食量/饲养天数;

料重比=总采食量/总增重。

1.4.2 腹泻情况记录

试验期间,每天认真观察并记录每组每头仔猪的健康状况,观察粪便形状及腹泻程度,计算腹泻率。依据美国密歇根州大学粪便分值体系[12]进行评分,腹泻评分标准见表2。

腹泻率(%)=[(试验期内每组仔猪腹泻头数×腹泻天数)/(每组试验仔猪头数×试验天数)]×100。

表2 腹泻评分标准

Table 2 Diarrhea scoring criteria

腹泻程度 Degree of diarrhea 标准 Standard 评分 Score
正常 Normal 干燥,成形或者粒形 0
轻度 Mild 软粪,能成形 1
中度 Moderate 稠状,不成形,粪水无分离现象 2
严重 Serious 液状,不成形,粪水无有离现象 3

1.4.3 血清生化和抗氧化指标

饲养试验结束时,停饲12 h,从每组每个重复中随机选取1头试验仔猪,共计12头。用含有肝素钠的采血管通过前腔静脉采集血液10 mL,静置2 h后离心,取上层血清,-20 ℃保存。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒测定血清各项指标:免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、干扰素-γ(INF-γ)、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性与总抗氧化能力(T-AOC)。上述指标均使用南京建成生物工程研究所的试剂盒检测,严格按照操作说明进行。

1.4.4 养分表观消化率

在正试期第26、27和28天,分别于每天上午同一时间连续3 d采集不同组仔猪的粪便样品150 g于自封袋内,与37.5 mL的10%酒石酸溶液充分混合后密封,置于-20 ℃保存。把采集的粪便和饲粮样品放在烘箱中,65 ℃烘干72 h,室温下冷却,粉碎,过40目筛,密封,储藏于阴凉通风处,待测。
养分表观消化率采用指示剂法进行测定,以酸不溶灰分为指示剂。按照《饲料中盐酸不溶灰分的测定》(GB/T 23742—2009)方法测定盐酸不溶灰分含量。按照GB/T 6432—2018的方法,使用海能全自动定氮仪(K1100)测定粗蛋白质含量。按照GB/T 6433—2006的方法测定粗脂肪含量。按照GB/T 20806—2006的方法测定中性洗涤纤维含量。按照NY/T 1459—2007的方法测定酸性洗涤纤维含量。按GB/T 6438—2007的方法测定粗灰分含量。按照GB/T 6436—2018和GB/T 6437—2018的方法分别测定钙和总磷含量。按照GB/T 18246—2019的方法测定氨基酸的含量。养分表观消化率计算公式如下:

养分表观消化率(%)=100×[1-(A/B)×(C/D)]。

式中:A为粪中该养分含量;B为饲粮中该养分含量;C为饲粮中盐酸不溶灰分含量;D为粪中盐酸不溶灰分含量。

1.4.5 粪便微生物

在正试期结束后第1天早上,于每组每个重复选择2头仔猪采集新鲜无污染的粪便于5 mL冻存管中,保存于-80 ℃冰箱中,待测。用QIAamp粪便DNA提取试剂盒(Qiagen,GmbH Hilden,德国)测定粪便样品,按照说明进行操作。从0.25 g解冻粪便样品中提取微生物基因组DNA,1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因DNA的完整性。基于Illumina MiSeq平台,对采集的粪便样品16S rRNA的V3~V4区域进行高通量测序。通过对所得原始测序序列进行过滤、双端拼接,得到优化序列,再将其进行聚类,划分操作分类单元(OTU),利用美吉生物云平台进行物种Alpha多样性和微生物组成分析。

1.5 数据统计分析

采用SPSS 26.0统计软件对各试验结果进行单因素方差分析(one-way ANOVA),采用Duncan氏法进行多重比较,结果均以“平均值±标准差”来表示,以P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 饲粮中添加不同来源微生态制剂对断奶仔猪生长性能的影响

由表3可知,与AN组相比,HBL、EF组末重均显著升高(P<0.05)。与AN组相比,HBL、EF组平均日增重显著增加(P<0.05)。与LBL组相比,EF组平均日采食量显著升高(P<0.05)。与AN组相比,LBL组料重比显著降低(P<0.05)。
表3 饲粮中添加不同来源微生态制剂对断奶仔猪生长性能的影响

Table 3 Effects of adding different sources of microecological preparations to diets on growth performance of weaned piglets

项目
Items		 组别 Groups
AN LBL HBL EF
始重 IW/kg 12.30±0.02 12.31±0.07 12.28±0.11 12.27±0.07
末重 FW/kg 27.13±1.00c 28.36±0.21bc 29.12±0.28ab 30.14±0.98a
平均日增重 ADG/kg 0.54±0.02c 0.57±0.01b 0.60±0.01ab 0.61±0.02a
平均日采食量 ADFI/kg 1.00±0.24ab 0.93±0.44b 1.01±0.00ab 1.08±0.04a
料重比 F/G 1.84±0.08a 1.62±0.05b 1.68±0.03ab 1.76±0.10ab

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同或无字母表示差异不显著 (P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant differences (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant differences (P>0.05). The same as below.

2.2 饲粮中添加不同来源微生态制剂对断奶仔猪粪便评分和腹泻率的影响

由表4可知,与AN组相比,各试验组的粪便指数和腹泻率均无显著差异(P>0.05)。
表4 饲粮中添加不同来源微生态制剂对断奶仔猪粪便指数和腹泻率的影响

Table 4 Effects of adding different sources of microecological preparations to diets on fecal index and diarrhea rate of weaned piglets

项目
Items		 组别 Groups
AN LBL HBL EF
粪便指数 Fecal index 0.55±0.25 1.62±1.80 0.31±0.47 0.84±0.72
腹泻率 Diarrhea rate/% 1.40±0.73 4.76±5.02 0.85±1.32 2.09±1.66

2.3 饲粮中添加不同来源微生态制剂对断奶仔猪血清生化指标的影响

由表5可知,与AN组相比,LBL组和EF组血清IgA含量显著升高(P<0.05),LBL组血清IL-2、IL-4含量显著升高(P<0.05),EF组血清IL-6含量显著升高(P<0.05),各试验组组血清TNF-α含量均显著升高(P<0.05)。
表5 饲粮中添加不同来源微生态制对断奶仔猪血清生化指标的影响

Table 5 Effects of adding different sources of microecological preparations to diets on serum biochemical indexes of weaned piglets

项目
Items		 组别 Groups
AN LBL HBL EF
免疫球蛋白A IgA/(μg/mL) 537.10±22.98b 588.13±30.92a 573.39±15.10ab 591.13±25.36a
免疫球蛋白G IgG/(mg/mL) 15.06±1.14 15.93±0.78 15.93±1.07 16.25±0.59
免疫球蛋白M IgM/(mg/mL) 14.39±1.61 12.85±1.51 15.24±1.19 12.70±1.77
白细胞介素-2 IL-2/(pg/mL) 215.45±7.05b 235.70±16.18a 217.48±6.20b 226.55±10.87ab
白细胞介素-4 IL-4/(pg/mL) 36.67±0.94b 42.71±4.56a 38.74±2.35ab 38.90±1.76ab
白细胞介素-6 IL-6/(pg/mL) 443.63±39.64b 482.78±39.42ab 452.52±22.23ab 488.27±48.21a
白细胞介素-10 IL-10/(pg/mL) 104.86±10.84 110.78±6.90 89.18±21.32 91.61±30.10
肿瘤坏死因子-α TNF-α/(pg/mL) 133.31±3.70c 140.83±3.52ab 140.96±3.99ab 146.56±8.55a
干扰素-γ INF-γ/(pg/mL) 23.39±1.46 24.89±1.80 23.21±0.86 24.36±1.75

2.4 饲粮中添加不同来源微生态制剂对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响

由表6可知,与AN组相比,EF组血清T-AOC显著降低(P<0.05)。与AN组相比,各组血清MDA含量呈现降低趋势,其中EF组差异显著(P<0.05)。与AN组相比,LBL组血清CAT活性显著升高(P<0.05)。
表6 饲粮中添加不同来源微生态制剂对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响

Table 6 Effects of adding different sources of microecological preparations to diets on serum antioxidant indexes of weaned piglets

项目
Items		 组别 Groups
AN LBL HBL EF
总抗氧化能力 T-AOC/(mmol/L) 0.47±0.16a 0.47±0.25a 0.31±0.08ab 0.27±0.11b
超氧化物歧化酶 SOD/(U/mL) 136.82±5.14ab 133.37±9.24b 144.97±9.41a 143.25±8.36ab
丙二醛 MDA/(nmol/mL) 8.31±2.74a 7.11±3.14ab 7.64±2.95a 4.45±0.77b
过氧化氢酶 CAT/(U/mL) 9.86±3.31b 14.63±3.08a 9.03±3.81b 9.44±1.76b

2.5 饲粮中添加不同来源微生态制剂对断奶仔猪养分表观消化率的影响

由表7可知,与AN组相比,LBL组干物质表观消化率显著降低(P<0.05),HBL组粗蛋白质表观消化率显著升高(P<0.05),各试验组的粗脂肪表观消化率显著降低(P<0.05)。
表7 饲粮中添加不同来源微生态制剂对断奶仔猪养分表观消化率的影响

Table 7 Effects of adding different sources of microecological preparations to diets on apparent digestibility of nutrients of weaned piglets%

项目
Items		 组别 Groups
AN LBL HBL EF
干物质 DM 83.85±1.48a 76.02±1.16b 83.70±1.48a 82.95±0.29a
粗蛋白质 CP 78.17±1.92b 67.92±1.63c 81.07±2.30a 77.35±0.40b
粗脂肪 EE 55.21±3.85a 50.92±4.92b 50.59±4.80b 50.99±5.68b

2.6 饲粮中添加不同来源微生态制剂对断奶仔猪粪便微生物的影响

2.6.1 Alpha多样性分析

由图1可知,所有样本的覆盖率平均为99.62%,样品测序深度估计趋近100%,样品覆盖率高。因此测序结果充分反映了粪便微生物的分布。所有样品Coverage和Shannon指数曲线比较一致且逐渐趋于平缓,说明本次测序数据量足够,表明不同的样本中物种组成比较均匀,样本的测序数据深度合理。由表8可知,HBL组的Chao1指数显著低于其他各组(P<0.05)。
图1 微生物Alpha多样性稀释曲线分析

AN:抗生素组 antibiotic group;LBL:低浓度地衣芽孢杆菌制剂组 low concentration Bacillus licheniformis group;HBL:高浓度地衣芽孢杆菌制剂组 high concentration Bacillus licheniformis group;EF:粪肠球菌制剂组 Enterococcus faecalis group。下图同 the same as below。

Fig.1 Analysis of microbial Alpha diversity dilution curve

表8 饲粮中添加不同来源微生态制剂对断奶仔猪粪便菌群Alpha多样性的影响

Table 8 Effects of adding different sources of microecological preparations to diets on Alpha diversity of fecal microbiota of weaned piglets

项目
Items		 组别 Groups
AN LBL HBL EF
Sobs指数 Sobs index 481.75±31.01 498.00±86.14 440.25±88.47 428.50±74.88
Shannon指数 Shannon index 3.39±0.26 3.50±0.63 3.10±0.40 2.84±0.44
Ace指数 Ace index 567.46±14.76 581.06±73.53 518.60±94.90 540.25±69.42
Chao1指数 Chao1 index 587.23±29.14a 588.59±74.94a 520.33±90.09b 561.87±76.75a
Simpson指数 Simpson index 0.12±0.03 0.12±0.07 0.19±0.09 0.20±0.10
Coverage指数 Coverage index 0.996 2±0.000 4 0.996 3±0.000 3 0.996 6±0.000 7 0.996 0±0.000 5

2.6.2 Beta多样性分析

由图2-A和图2-B可知,AN组和各试验组的猪粪便微生物组成相似。非度量多维尺度分析(NMDS)(图2-C)表明,在粪便微生物OTU水平,各组的微生物结构没有表现出明显的分离,且所有的β多样性分析的组间均无显著差异。
图2 基于OTU水平的微生物多样性指数分析

Fig.2 Analysis of microbial diversity index based on OTU level

2.6.3 粪便微生物门、属水平组成和差异微生物

由图3和图4可知,粪便中的优势菌门为厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、疣菌门、螺旋体门。与AN组相比,LBL组、HBL组厚壁菌门的相对丰度下调,而EF组厚壁菌门的相对丰度上调;所有试验组的放线菌门相对丰度均上调;LBL组拟杆菌门的相对丰度上调;各试验组螺旋菌门的相对丰度均下调,同时疣菌门的相对丰度上调。在属水平上,粪便中的优势菌属为狭义梭菌属1、乳杆菌属、链球菌属、土孢杆菌属、罕见小球菌属。与AN组相比,各试验组的狭义梭菌属1相对丰度均上调了;除LBL组的乳杆菌属相对丰度上调外,其他各组乳杆菌属的相对丰度均下调。相较AN组,所有试验组链球菌属的相对丰度下调;各试验组的罕见小球菌属相对丰度均上调;LBL组土孢杆菌属的相对丰度下调,而HBL组和EF组则相反。
图3 断奶仔猪粪便微生物OTU水平物种Venn图(A)和群落饼图(B)

Firmicutes: 厚壁菌门;Actinobacteriota: 放线菌门; Bacteroidota: 拟杆菌门; Spirochaetota: 螺旋菌门; Verrucomicrobiota: 疣菌门; Clostridium_sensu_stricto_1:狭义梭菌属1;Lactobacillus:乳杆菌属;Terrisporobacter: 土孢杆菌属;Streptococcus: 链球菌属;Subdoligranulum: 罕见小球菌属; norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014: 未分类梭菌属UCG-014;Blautia: 布劳特氏菌属;Olsenella: 欧尔森菌属; Christensenellaceae_R-7_group: 克里斯滕森菌科_R-7群;norank_f_Muribaculaceae: 未分类的拟杆菌门;norank_f_norank_o_RF39: 未分类_RF3;Ruminococcus_gauvreauii_group: 瘤胃球菌属群;Pseudoramibacter: 假分枝杆菌属;Clostridium_sensu_stricto_6: 狭义梭菌属6;Marvinbryantia: 马文氏菌属;Catenibacterium: 链杆菌属; norank_f_Butyricicoccaceae: 未分类丁酸球菌科;Other: 其他。

Fig.3 Venn plot (A) and community pie chart (B) of OTU level species in fecal microbiota of weaned piglets

图4 断奶仔猪粪便微生物组成

Firmicutes: 厚壁菌门;Actinobacteriota: 放线菌门;Bacteroidota: 拟杆菌门;Spirochaetota: 螺旋菌门;Verrucomicrobiota: 疣菌门;Clostridium_sensu_stricto_1: 狭义梭菌属1;Lactobacillus: 乳杆菌属;Streptococcus: 链球菌属;Terrisporobacter: 土孢杆菌属;Subdoligranulum: 罕见小球菌属;norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014: 未分类梭菌属UCG-014;Blautia: 布劳特氏菌属;Olsenella: 欧尔森菌属;Christensenellaceae_R-7_group: 克里斯滕森菌科_R-7群;norank_f_Muribaculaceae: 未分类的拟杆菌门;norank_f_norank_o_RF39: 未分类_RF3;Ruminococcus_gauvreauii_group: 瘤胃球菌属群;Pseudoramibacter: 假分枝杆菌;Clostridium_sensu_stricto_6: 狭义梭菌属6;Marvinbryantia: 马文氏菌属;Catenibacterium: 链杆菌属;norank_f_Butyricicoccaceae: 未分类丁酸球菌科;Akkermansia: 阿克曼菌属;Others: 其他。

Fig.4 Microbial composition of feces of weaned piglets

2.6.4 粪便微生物LEfSe分析

由图5可知,4组的粪便微生物之间有6种不同的微生物。在不同的差异微生物中,2个属于AN组,1个属于LBL组,3个属于HBL组。其中AN组中丁酸球菌科和未分类丁酸球菌科的相对丰度最高,LBL组未分类月形单胞菌科的相对丰度最高,HBL组芽孢杆菌科、芽孢杆菌目和芽孢杆菌属相对丰度最高。EF组中没有显著丰度差异特征的微生物。
图5 仔猪粪便LEfSe多级物种差异判别分析

f_Butyricicoccaceae: 丁酸球菌科;g_norank_f_Butyricicoccaceae: 未分类丁酸球菌科;g_norank_f_Selenomonadaceae: 未分类月形单胞菌科;f_Bacillaceae: 芽孢杆菌科;o_Bacillales: 芽孢杆菌目;g_Bacillus: 芽孢杆菌属。

Fig.5 Discriminant analysis of multi-level species differences of LEfSe in piglet feces

2.6.5 粪便微生物功能预测

由图6可知,在HBL组中表现出了更高的厌氧性的相关丰度。
图6 仔猪粪便BugBase表型预测分析

Facultatively_Anaerobic: 兼性厌氧; Forms_Biofilms: 生物膜形成;Gram_Negative: 革兰氏阴性;Anaerobic: 需氧型;Contains_Mobile_Elements: 移动元件;Potentially_Pathogenic: 潜在致病性; Anaerobic: 厌氧型;Gram_Positive: 革兰氏阳性;Stress_Tolerant: 氧化胁迫耐受。

“*”表示显著相关(P<0.05)。 “*” indicates a significant correlation (P<0.05).

Fig.6 Prediction analysis of BugBase phenotype in piglet feces

2.6.6 粪便微生物与血清指标相关性分析

由图7可知,门水平上的蓝菌门和属水平上的未分类葡萄球菌的相对丰度均与仔猪血清中的IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、INF-γ和IgG含量呈显著或极显著的正相关(P<0.05或P<0.01)。在属水平上,未分类丁酸球菌科相对丰度与仔猪血清中的IgM和MDA含量呈显著或极显著的正相关(P<0.05或P<0.01)。芽孢杆菌属相对丰度与仔猪血清中的TNF-α和IgG含量呈显著的正相关(P<0.05)。肠球菌属相对丰度与仔猪血清中的TNF-α和IgG含量呈极显著的正相关(P<0.01),而与血清T-AOC呈显著的负相关(P<0.05)。g_UCG-008和未分类月形单胞菌科相对丰度则与血清炎症因子和抗氧化指标均未表现出显著的相关性(P>0.05)。
图7 仔猪粪便差异微生物与血清指标相关性分析

g_norank_f_Butyricicoccaceae: 未分类丁酸球菌科;g_Bacillus: 芽孢杆菌属;p_Cyanobacteria: 蓝藻门;g_norank_f_norank_o_Gastranaerophilales: 未分类葡萄球菌;g_Enterococcus: 肠球菌属;g_norank_f_Selenomonadaceae: 未分类月形单胞菌科;IgA:免疫球蛋白A immunoglobulin A;IgG:免疫球蛋白G immunoglobulin G;IgM:免疫球蛋白M immunoglobulin M;IL-2:白细胞介素-2 interleukin-2;IL-4:白细胞介素-4 interleukin-4;IL-6:白细胞介素-6 interleukin-6;IL-10:白细胞介素-10 interleukin-19;TNF-α:肿瘤坏死因子-α tumor necrosis factor-alpha;INF-γ:干扰素-γ interferon-gamma;MDA:丙二醛 malonaldehyde;SOD:超氧化物歧化酶 superoxide dismutase;CAT:过氧化氢酶 catalase;T-AOC:总抗氧化能力 total antioxidant capacity。

“*”表示显著相关(P<0.05);“**”表示极显著相关(P<0.01)。“*” indicates a significant correlation (P<0.05); “**” indicates a very significant association (P<0.01).

Fig.7 Correlation analysis between differential microorganisms in piglet feces and serum in indexes

3 讨论

3.1 饲粮中添加不同来源微生态制剂对断奶仔猪生长性能的影响

仔猪在断奶后由于断奶应激会经常出现食欲和采食量下降等现象,明显影响养殖场经济效益。饲粮中添加地衣芽孢杆菌和丁酸梭菌可有效提高断奶仔猪生长性能,降低腹泻发生率,改善血清抗氧化能力和免疫水平[13]。尹会方等[14]研究结果表明,饲粮中添加地衣芽孢杆菌和丁酸梭菌可以增强仔猪免疫功能,改善仔猪生长性能。粪肠球菌是人类和动物消化道中的共生益生菌,具有很强的产酸能力和抑菌功能[1]。研究表明,粪肠球菌能改善断奶仔猪生长性能和养分的消化率,促进肠道菌群平衡,添加5×108~1×1010 CFU/kg水平效果良好[2⇓-4]。陈雪颖等[15]研究表明,饲粮中添加1 g/kg地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌对断奶仔猪生长性能无显著影响,但能改善仔猪血清生化指标,提高机体免疫力,改善仔猪肝脏功能。在本试验中,添加微生态制剂的3个试验组平均日增重均显著增加,其中LBL组料重比显著降低,HBL组料重比下降,但效果不显著,平均日采食量变化不显著,这与陈雪颖等[15]试验结果一致。LBL组平均日采食量略微降低,可能与采用的微生态添加剂组成、试验猪品种、动物应激反应、试验阶段及采样数量等原因有关,待作进一步论证。与AN组比较,EF组的末重和平均日增重均显著增加,这与前人的研究结果基本一致。

3.2 饲粮中添加不同来源微生态制剂对断奶仔猪粪便评分和腹泻率的影响

断奶仔猪处于胃肠道功能尚未发育完全阶段,添加微生态制剂可以改善肠道健康,降低仔猪腹泻,增强机体的抗氧化功能及抗应激能力,从而促进动物的生长发育。研究表明,饲粮中添加0.3%由酿酒酵母和枯草芽孢杆菌(5×108 CFU/g)的复合益生菌可显著提高断奶仔猪试验期末重和平均日增重,显著降低料重比和腹泻率,且血清中TNF-α含量显著降低[16]。在本试验中,与AN组对比,试验组的粪便指数和腹泻率没有显著变化,除了HBL组降低之外,其他组均增加了,说明添加微生态制剂可以降低断奶仔猪腹泻率,与前人研究结果具有相似性,也有差异性,添加剂组分品种差异及剂量等原因有关。

3.3 饲粮中添加不同来源微生态制剂对断奶仔猪免疫功能的影响

免疫应答是动物维护机体各项功能正常运转的一种防御保护机制。在此过程中,相关细胞因子起着重要的作用。动物血清中主要的免疫球蛋白有IgA、IgG、IgM,其中IgG和IgM能够帮助机体抵抗细菌和病毒的入侵[17]。断奶后前炎症细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-6含量迅速升高,说明仔猪的自身免疫系统被迅速激活。研究发现,断奶能显著增加仔猪肠黏膜的前炎症细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的基因表达[18]。崔玉革等[16]研究发现, 饲粮中添加地衣芽孢杆菌等益生菌后仔猪血清IgA、IgG和IgM含量显著升高。本研究结果表明,在添加微生态制剂后,部分血清免疫因子的含量提升,这表明添加微生态制剂可以在一定程度上改善断奶仔猪免疫系统的功能,提高断奶仔猪的免疫能力,与先前的研究结果一致。

3.4 饲粮中添加不同来源微生态制剂对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响

仔猪断奶后,机体功能相对紊乱,抗氧化功能较弱,导致体内自由基过量增加,从而引起氧化应激[19]。衡量机体抗氧化能力的重要指标有SOD、T-AOC、CAT、GSH-Px和MDA。MDA含量提高,动物机体的氧化损伤增加。动物机体SOD、GSH-Px和CAT活性升高,机体的抗氧化能力随之增强,能更好地保护细胞免受活性氧(ROS)含量过高所造成的损害,减少氧化应激。任冰等[19]研究发现,饲粮中添加地衣芽孢杆菌可显著提高肉仔鸡血清中GSH-Px、SOD的活性,同时能够提高谷胱苷肽还原酶和CAT的活性。李宁等[20]研究表明,仔猪饲粮中添加地衣芽孢杆菌能够显著提高仔猪平均日均采食量、平均日增重,降低料重比,提高血清球蛋白含量,增加机体抗氧化能力,提高机体免疫力。侯璐[21]研究表明,断奶仔猪中添加粪肠球菌等益生菌制剂能够降低仔猪腹泻率,促进养分利用率,提升仔猪平均日增重,血清中抗体IgG的含量增加。本研究表明,饲粮中添加微生态制剂后,可以改善血清SOD活性,降低MDA含量,表明微生态制剂能够维持机体氧化平衡,清除自由基,提高仔猪自身抗氧化能力,与先前研究结果一致。

3.5 饲粮中添加不同来源微生态制剂对断奶仔猪养分表观消化率的影响

地衣芽孢杆菌可提高菌群中有益菌的比例,并刺激消化酶的分泌。研究表明,在饲粮中添加适量的抗菌肽或者地衣芽孢杆菌能提高畜禽消化酶的活性,改善肠道发育,从而促进其对营养物质的消化吸收[22⇓-24]。王汉星[9]试验结果表明,饲粮中枯草芽孢杆菌与粪肠球菌单独添加均可促进肠道发育,提高氨基酸消化率。本试验研究表明,低剂量的地衣芽孢杆菌制剂能显著提高断奶仔猪养分的表观消化率。

3.6 饲粮中添加不同来源微生态制剂对断奶仔猪粪便微生物的影响

仔猪的肠道和粪便中存在着很多微生物,它们的相互作用共同维持着肠道微生态平衡和动物健康。肠道内有害微生物的过度增殖会破坏肠道微生态平衡,产生大量毒性物质,影响动物的健康[25]。本试验结果显示,饲粮中添加这2种不同来源的微生态制剂均影响仔猪粪便的微生物相对丰度。通常健康动物粪便中含有3个优势门,拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门[26],这与本研究的结果一致。本试验中所有试验组放线菌门的相对丰度均提高,LBL组和EF组厚壁菌门及拟杆菌门的相对丰度提高。厚壁菌门相对丰度的增加对动物肠道健康有积极意义,能够促进机体对高纤维食物的消化,同时也能在肠道中产生抗菌物质,维护肠道健康。芽孢杆菌属于厚壁菌门,是革兰氏阳性菌,属细菌中有专性需氧菌或兼性厌氧菌,喜厌氧环境,能够提高免疫性能,促进肠道发育和调节肠道菌群[27]。厌氧管菌属的部分菌株可以将膳食肌醇代谢为丙酸盐和丁酸盐等短链脂肪酸(SCFA),肌醇是一种六碳环醇,存在于哺乳动物多数组织以及食物中。SCFA对维持肠道稳态有积极的作用,例如乙酸参与调控体重和胰岛素敏感性,丙酸盐和丁酸盐参与多种信号的转导过程[28];芽孢杆菌属能够迅速消耗动物体肠道内的游离氧, 为动物提供淀粉酶、蛋白酶等多种内源酶,能弥补动物机体内源酶的不足,有效提高养分利用率。片球菌是一种能够促进消化的益生菌,能够有效促进胃肠道蠕动,促进消化,而且含有多糖成分,能够抑制细菌生长,促进免疫细胞产生抗体,进而提高自身的免疫力,能够预防疾病的发生。在差异微生物中,本试验发现添加HBL的芽孢杆菌属相对丰度明显改善,在对仔猪粪便微生物的BugBase表型功能预测分析中发现,各试验组较AN组具有更高厌氧型微生物。在粪便微生物与血清指标相关性分析中发现,芽孢杆菌属和肠球菌属相对丰度与仔猪血清中的TNF-α和IgG含量呈显著或极显著的正相关。本试验结果与前人的研究结果[20-21]一致。

4 结论

① 与AN组相比,LBL组和EF组断奶仔猪的生长性能显著提高,其中EF组猪只的生长性能改善效果更加显著。
② 与AN组相比,LBL组和EF组断奶仔猪的免疫能力和抗氧化能力显著提高。
③ 在猪粪便微生物组成上,LBL组和EF组断奶仔猪粪便微生物的多样性得到改善,进而促进肠道健康,其中EF组猪只的肠道健康提升效果更加显著。
④ 综合各组试验效果,EF组试验效果良好,其次是HBL组。

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