Chinese Journal of Animal Nutrition >

2024 , Vol. 36 >Issue 10: 6780 - 6790

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.577

RESEARCH PAPER

Probiotic Function Evaluation of Bacillus licheniformis SXAU08 from Alpacas and Its Effects on Gut Microbiota of Mice

  • YU Xiuju , 1 ,
  • HU Yanjiao 1, * ,
  • SUN Zheng 1 ,
  • WANG Rongrong 2 ,
  • ZHU Zhiwei 2 ,
  • WANG Haidong 1 ,
  • HE Junping , 1, ** ,
  • YANG Lihua , 1, 3, **
Expand
  • 1 College of Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Jinzhong 030801, China
  • 2 College of Life Sciences, Shanxi Agricultural University, Jinzhong 030801, China
  • 3 College of Animal Science, Shanxi Agricultural University, Jinzhong 030801, China
**HE Junping, professor, E-mail: ;
YANG Lihua, associate professor, E-mail:

*Contributed equally

Received date: 2024-04-30

  Online published: 2024-10-14

Fold

Abstract

The purpose of this study was to investigate the probiotic functions of Bacillus licheniformis SXAU08 isolated from the intestinal tract of alpacas and its effects on the gut microbiota of mice. The isolated strain was first identified by Gram staining and 16S rRNA gene, and was named Bacillus licheniformis SXAU08. Then, the high temperature tolerance, survival rate in simulated gastric fluid and simulated intestinal fluid, antibacterial activity and antibiotic sensitivity of the strain were determined. Forty 21-day-old clean grade Kunming mice were randomly divided into 2 groups with 20 mice in each group (half male and half female). The mice in the control group were fed a basal diet and given saline, and those in the experimental groups were fed the basal diet and given 1×1010 CFU/mL Bacillus lichens SXAU08, with the gavage volume of 0.3 mL/mouse. The experiment lasted for 30 days to study the effects of the bacterium on intestinal morphology and gut microbiota of mice. The results showed as follows: 1) the cell-free culture medium of the bacterium could significantly inhibit the growth of Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis and Micrococcus luteus. It could still grow normally after treatment at 40 to 100 ℃, and could still survive 6 h after treatment with simulated gastric fluid and simulated intestinal fluid, and showed a growth trend. It was sensitive to 10 common antimicrobial agents such as gentamicin, ofloxacin and amoxicillin. 2) There were no adverse reactions in the mice after administration of Bacillus licheniformis SXAU08, the survival rate was 100%, and there were no pathological changes at autopsy. 3) Compared with the control group, the villus height and villus height to crypt depth ratio (V/C) in duodenum of mice treated with Bacillus licheniformis SXAU08 in experimental group were extremely significantly increased (P<0.01), and the crypt depth in duodenum was extremely significantly decreased (P<0.01). 4) Compared with the control group, at the phylum level, the relative abundances of Firmicutes and Desulfobacterota in jejunum of mice in experimental group were significantly increased (P<0.05), the Bacteroidota relative abundance in jejunum was significantly decreased (P<0.05), and the relative abundances of Desulfobacterota and Patescibacteria in cecum were significantly increased (P<0.05); at the genus level, the Lactobacillus relative abundance in jejunum and cecum of mice in experimental group was significantly increased (P<0.05). In summary, Bacillus licheniformis SXAU08 derived from the intestinal tract of alpacas can improve the intestinal morphology of mice, increase the relative abundances of intestinal probiotics, regulate gut microbiota and maintain intestinal health, and can be used as a candidate strain of probiotics.

Key words： alpacas; Bacillus licheniformis; probiotics; mice; gut microbiota

Cite this article

YU Xiuju , HU Yanjiao , SUN Zheng , WANG Rongrong , ZHU Zhiwei , WANG Haidong , HE Junping , YANG Lihua . Probiotic Function Evaluation of Bacillus licheniformis SXAU08 from Alpacas and Its Effects on Gut Microbiota of Mice[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2024 , 36(10) : 6780 -6790 . DOI: 10.12418/CJAN2024.577

近年来,我国全面禁止在动物饲料中使用抗生素,因此寻找新型高效的动物健康促进剂成为动物养殖领域的热门课题。益生菌作为一类安全、绿色的微生物制剂,在促进宿主健康和防病治病发面发挥着重要的作用[1]。随着相关研究的不断深入,越来越多的益生菌被应用在人类疾病的预防和治疗中,并在动物的养殖中也有广泛的应用[2]。食用益生菌主要通过平衡宿主的肠道微生态系统,丰富肠道有益菌菌群丰度,进而发挥促进宿主健康的作用[3⇓-5]。性能优良的益生菌不仅具有耐高温、耐酸碱的特性,且可代谢产生抑制有害菌生长的活性物质[6-7]。地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)作为一种我国农业农村部批准的可添加饲用芽孢杆菌,属于革兰氏阳性菌,该类菌及其孢子在不同温度和酸碱条件下具有较好的稳定性[8],可产生抑制多种革兰氏阳性和阴性细菌生长的活性物质[9],且对药物不易产生耐药性。地衣芽孢杆菌进入动物肠道后,通过增殖消耗大量的氧气,形成更有利于厌氧有益菌生长的肠道环境,抑制好氧病原菌的生长,进而调节肠道菌群丰度,促进肠道健康[10]。因此,地衣芽孢杆菌在动物健康养殖领域具有潜在的应用前景。
羊驼为驼科动物,原产于安第斯高原恶劣环境,具有耐寒、耐旱、抗病能力强且可产生天然单链抗体等特性[11-12],推测这些优良特性可能与其肠道微生物菌群有着密切关系。但目前对其肠道微生物的研究较少。前期的研究表明,羊驼肠道存在高产细菌素的益生芽孢杆菌菌种资源[13]。因此,本试验旨在从健康的羊驼肠道中筛选具有潜力的益生芽孢杆菌,鉴定和检测其菌属和耐受特性,并研究该菌株对小鼠肠道组织形态和菌群丰度的影响,以期为其作为动物微生态制剂在动物养殖中的应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株的分离和鉴定

在山西农业大学羊驼繁育基地,随机采取20头羊驼的肠道内容物,将其置于15 mL无菌离心管中,低温运回实验室。按照1∶5(体积比)将羊驼肠道内容物制成磷酸缓冲液(PBS)混悬液,37 ℃孵育1 h后,取1 mL混悬液进行10倍梯度稀释,分别取10-5、10-6、10-7和10-8倍稀释液100 μL涂布于LB平板,置于37 ℃培养箱中进行培养。通过观察菌落形态、颜色等特征,挑选单菌落,划线纯化进行革兰氏染色镜检,并保存菌株。分别以大肠杆菌(Escherichia coli)CMCC 44102、甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonella Paratyphi A)CMCC(B)50001、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC26003、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)CMCC(B)26069、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)CMCC(B)28001、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC19111和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CMCC(B)63202作为指示菌,采用牛津杯琼脂扩散法测定分离菌株无细胞上清液的抑菌活性。基于菌落特征、革兰氏染色和抑菌活性,挑选抑菌效果最佳的疑似芽孢杆菌菌株送至华大基因进行16S rRNA菌种鉴定,并将其序列上传至美国国家生物技术信息中心(NCBI)。通过NCBI的基本局部比对搜索工具(BLAST)和Clustal Omega在线分析软件进行序列比对并构建系统发育树,分析分离菌株的菌种归属。

1.2 温度耐受性试验

取LB液体培养基过夜培养的菌液,以4%接种量接种于LB液体培养基中,分别置于37、40、60、80和100 ℃的水浴锅中作用5 min,之后,37 ℃摇床进行培养。取其培养6、12、18、24、30、36、42及48 h时的菌液,在600 nm波长处测定其吸光度(OD600)值。每个处理设定5个重复,经37 ℃水浴处理的菌液作为对照。

1.3 人工胃液和人工肠液耐受性试验

参照《中华人民共和国兽药典》[14]配制人工胃液和人工肠液。取37 ℃培养24 h的菌液5 mL,5 000×g离心10 min,将菌体分别悬浮于5 mL不同pH(pH分别为2.0、3.0和4.0)的人工胃液和不同胆盐浓度(0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%)的人工肠液中,37 ℃摇床培养,取其培养1、2、3、4、5和6 h时的菌液测定其OD600值。每个处理设定5个重复,未经任何处理的菌液作为对照。

1.4 耐药性试验

将0.1 g抗菌药物粉末(磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶钠、庆大霉素、新霉素、盐酸土霉素、氟氧沙星、氟苯尼考、红霉素、甲硝唑、阿莫西林)溶于10 mL的无菌水或甲醇中,配制成10 mg/mL的原液。以10倍梯度稀释,配制终浓度为1、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5 mg/mL的抗生素溶液。采用牛津杯扩散法测定菌株的耐药性:双层培养基的下层板为10 mL 2%琼脂,上层板为15 mL含1×109 CFU/mL地衣芽孢杆菌SXAU08的LB半固体培养基。每孔加入150 μL不同浓度的抗生素溶液,不同浓度设定3个重复,以无菌水或甲醇为空白对照,4 ℃静置2 h后移至37 ℃培养箱中培养12 h,测量抑菌圈的直径。

1.5 动物试验

选取40只21日龄清洁级昆明小鼠[购于山西医科大学实验动物中心,生产许可证号:SCXK(晋)2019-004],平均体重为(20±2) g,随机分为2组,每组20只(公母各占1/2)。对照组小鼠饲喂基础饲粮并灌服生理盐水,试验组小鼠根据前期试验结果选定在基础饲粮的基础上灌服1×1010 CFU/mL地衣芽孢杆菌SXAU08,灌胃量均为0.3 mL/只。试验期30 d。按照常规饲养程序饲养小鼠,自由采食和饮水。试验期内,观察并记录小鼠的精神状态、毛色、口鼻分泌物、粪便颜色及状态等生长状况。

1.5.1 肠道组织形态分析

试验结束后,小鼠禁食24 h,麻醉后解剖观察脏器的形态、色泽、大小及有无眼观病变。每组选取体增重最接近的10只小鼠,采用无菌手术刀快速采集十二指肠中段2 cm,置于Bouin氏固定液中固定。固定好的组织进行梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡和包埋,制成5 μm厚的石蜡切片,然后进行苏木精-伊红(HE)染色,并在显微镜下采集图片。各组选取5~8张切片,每张切片选取3~5根肠绒毛。使用Image-Pro Plus[15]和GraphPad Prism[16]软件,测量并分析肠绒毛高度和隐窝深度,并计算绒毛高度/隐窝深度(V/C)值。

1.5.2 肠道菌群分析

每组选取体增重最接近的10只小鼠,麻醉后用无菌手术器械迅速采集空肠和盲肠内容物置于无菌冻存管中,编号后迅速放入液氮罐中冻存,送至上海美吉生物医药科技有限公司进行肠道菌群分析。具体步骤如下:采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法[17]提取小鼠空肠和盲肠内容物的基因组DNA后,然后采用特异性引物进行PCR扩增,PCR扩增产物由AMPure XT beads纯化,Qubit 4.0(Invitrogen,美国)定量;采用Agilent 2100生物分析仪和Illumina文库定量试剂盒对纯化后的PCR产物进行评估,合格的样本使用NovaSeq PE250测序平台进行双端测序。测序完成后所有数据均在美吉生物云平台(https://cloud.majorbio.com)进行分析,首先使用Fastp软件[18]对双端原始数据(raw reads)进行质控,然后采用FLASH软件[19]进行数据拼接后获得有效数据(effective tags);使用UPARSE v7.1软件[20]在effective tags的基础上进行操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)聚类并剔除嵌合体;利用RDP classifier软件[21]进行OTU物种分类学注释;同时,采用Wilxocon秩和检验进行alpha多样性的组间差异分析;使用基于布雷-柯蒂斯(Bray-Curtis)距离算法的主坐标分析(PCoA)检验样本间微生物群落结构的相似性,并结合置换多元方差分析(PERMANOVA)非参数检验分析样本组间微生物群落结构差异是否显著;采用线性判别分析效应大小(LEfSe)[22]分析确定不同组间肠道菌群从门到属水平上相对丰度差异显著的细菌类群。

1.6 数据统计分析

试验数据采用SPSS 28.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),并采用Duncan氏法进行组间差异显著性的多重比较检验,试验结果以“平均值±标准差(mean±SD)”形式表示,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。肠道菌群相关数据分析均在美吉生物云平台(https://cloud.majorbio.com)上进行。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离鉴定结果

本试验中,LB培养基上有多个单菌落,通过菌落特征观察和革兰氏染色镜检初步筛选到20株疑似芽孢杆菌(依次编码为SXAU01~SXAU20),根据抑菌活性检测结果挑选到抑菌效果最佳的SXAU08菌株进行后续的分析和鉴定。如图1所示,SXAU08菌株经划线纯化后的菌落呈微黄色,不整齐,表面不光滑、湿润,有类似黏液的物质,呈“花朵状”,为需氧菌(图1-A);菌体呈紫色的短杆状,单个或成对排列(图1-B);该菌的无细胞上清液对金黄色葡萄球菌(图1-C)、表皮葡萄球菌(图1-D)和藤黄微球菌(图1-H)具有明显的抑菌活性,对大肠杆菌(图1-E)、单增李斯特菌(图1-F)和短小芽孢杆菌(图1-G)具有一定的抑菌活性,但对甲型副伤寒沙门氏菌无抑菌活性。基于16S rRNA的序列结果和BLAST比对,该菌株在系统发育进化树上与地衣芽孢杆菌为同一簇(图1-I),且相似度高达99.57%,NCBI登录号为PP930813.1。因此,将其命名为地衣芽孢杆菌SXAU08(Bacillus licheniformis SXAU08)。
图1 分离菌株鉴定结果

A为菌落形态,B为革兰氏染色结果,C~H分别表示对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、单增李斯特菌、短小芽孢杆菌和藤黄微球菌的抑菌效果,I为系统发育进化树。

Bacillus licheniformis:地衣芽孢杆菌;Bacillus amyloliquefaciens:解淀粉芽孢杆菌;Bacillus subtilis:枯草芽孢杆菌;Bacillus pumilus:短小芽孢杆菌;Heyndrickxia coagulans:凝结芽孢杆菌;Bacillus lentus:迟缓芽孢杆菌;Bacillus cereus:蜡样芽孢杆菌;Bacillus megaterium:巨大芽孢杆菌。

Fig.1 Identification results of isolated strain

A was colony morphology, B was Gram staining result, C to H represented the antibacterial effects on Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Bacillus pumilus and Micrococcus luteus, respectively, and I was phylogenetic evolutionary tree.

2.2 地衣芽孢杆菌SXAU08对温度的耐受性

地衣芽孢杆菌SXAU08在不同温度(37、40、60、80和100 ℃)水浴5 min后,分析其生长情况。由表1可知,菌液在40~100 ℃处理后,地衣芽孢杆菌SXAU08均能生长,其中在培养6和12 h时的菌液OD600值呈现随处理温度升高而降低的趋势,表明高温对其活性产生一定的影响。不同温度处理后的菌液在培养18 h时的OD600值基本一致,开始进入稳定期,且100℃水浴5min后的菌体依然具有活性,可以正常生长。结果表明:地衣芽孢杆菌SXAU08对高温具有良好的耐受性。
表1 温度对地衣芽孢杆菌SXAU08生长的影响

Table 1 Effects of temperature on growth of Bacillus licheniformis SXAU08

时间
Time/h		 温度 Temperature/℃
37 40 60 80 100
6 0.30±0.01a 0.30±0.00a 0.25±0.00b 0.10±0.00c 0.05±0.00d
12 0.43±0.10a 0.42±0.00a 0.37±0.00b 0.31±0.00c 0.33±0.00c
18 0.51±0.00c 0.49±0.00c 0.56±0.02ab 0.59±0.01a 0.53±0.01bc
24 0.53±0.01b 0.46±0.00c 0.56±0.02b 0.64±0.01a 0.43±0.01c
30 0.55±0.01b 0.52±0.01c 0.58±0.00b 0.63±0.01a 0.51±0.01c
36 0.55±0.01b 0.51±0.01c 0.52±0.01c 0.65±0.01a 0.46±0.00d
42 0.57±0.00b 0.54±0.01bc 0.55±0.01b 0.62±0.01a 0.50±0.00c
48 0.55±0.02b 0.55±0.03b 0.56±0.01b 0.65±0.01a 0.41±0.01c

同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)。表2和表3同。

Data in the same row with different letter superscripts differ significantly (P<0.05). The same as Table 2 and Table 3.

2.3 地衣芽孢杆菌SXAU08对人工胃液和人工肠液的耐受性

由表2可知,在pH分别为2.0、3.0和4.0的人工胃液作用下,地衣芽孢杆菌SXAU08菌株均可存活。其中,在pH为2.0的人工胃液作用下,地衣芽孢杆菌SXAU08菌液的OD600值始终保持稳定(P>0.05);在pH为3.0和4.0的人工胃液作用下,地衣芽孢杆菌SXAU08在1~4 h的OD600值保持不变(P>0.05),在4~5 h有所增长,且菌株生长优于pH为2.0的人工胃液。在不同胆盐浓度的人工肠液作用下,地衣芽孢杆菌SXAU08菌液的OD600值随时间延长呈现先下降后上升的趋势,且胆盐对地衣芽孢杆菌SXAU08的抑制作用表现为剂量依赖性特征。结果表明:地衣芽孢杆菌SXAU08具有耐受人工胃液和人工肠液的特性。
表2 人工胃液和人工肠液对地衣芽孢杆菌SXAU08生长的影响

Table 2 Effects of simulated gastric fluid and simulated intestinal fluid on growth of Bacillus licheniformis SXAU08

项目
Items		 时间 Time/h
1 2 3 4 5 6
人工胃液 Simulated gastric fluid
pH 2.0 1.54±0.01 1.58±0.01 1.54±0.02 1.56±0.04 1.59±0.01 1.61±0.01
3.0 1.74±0.01c 1.86±0.01bc 1.85±0.03c 1.81±0.03c 1.97±0.00ab 1.98±0.02a
4.0 1.78±0.01c 1.85±0.02c 1.87±0.01c 1.87±0.01c 2.14±0.04a 1.97±0.04b
人工肠液 Simulated intestinal fluid
胆盐浓度
Bile salt
concentration/%		 0 0.42±0.01e 0.44±0.01e 0.62±0.01d 0.70±0.00c 0.75±0.01b 0.81±0.00a
0.2 0.34±0.00e 0.40±0.01d 0.41±0.01d 0.49±0.00c 0.51±0.00b 0.66±0.01a
0.4 0.34±0.00c 0.32±0.01c 0.41±0.01b 0.43±0.01b 0.44±0.01b 0.50±0.01a
0.6 0.34±0.01c 0.36±0.00c 0.39±0.01b 0.37±0.01c 0.46±0.01a 0.45±0.01a
0.8 0.35±0.00d 0.36±0.00cd 0.40±0.02ab 0.43±0.00a 0.39±0.00bc 0.42±0.00a
1.0 0.27±0.01b 0.31±0.04b 0.37±0.00a 0.41±0.01a 0.40±0.01a 0.42±0.00a

2.4 地衣芽孢杆菌SXAU08的耐药性分析

由表3可知,地衣芽孢杆菌SXAU08对不同种类抗生素敏感程度随着抗生素浓度的降低而降低。当抗菌药物浓度为1 mg/mL时,地衣芽孢杆菌SXAU08对所测的各种抗生素均表现出不同程度的敏感性;当抗菌药物浓度为10-1 mg/mL时,地衣芽孢杆菌SXAU08对磺胺嘧啶钠和甲硝唑不敏感;当抗菌药物浓度为10-2 mg/mL时,地衣芽孢杆菌SXAU08对盐酸土霉素也表现出了不敏感;当抗菌药物浓度为10-3 mg/mL时,地衣芽孢杆菌SXAU08则只对氟氧沙星和红霉素表现出不同程度的敏感性;而当抗菌药物浓度为10-4 mg/mL时,目标菌株对所测抗生素均不敏感。
表3 地衣芽孢杆菌SXAU08对抗生素的敏感性

Table 3 Sensitivity of Bacillus licheniformis SXAU08 to antibioticsmm

项目
Items		 浓度 Concentration/(mg/mL)
1 10-1 10-2 10-3 10-4
磺胺甲恶唑 Sulfamethoxazole 41.15±0.94a 33.07±1.58b 21.89±0.29c 0.00±0.00d 0.00±0.00d
磺胺嘧啶钠 Sodium sulfadiazine 16.65±0.50a 0.00±0.00b 0.00±0.00b 0.00±0.00b 0.00±0.00b
庆大霉素 Gentamicin 27.81±0.37a 21.04±0.23b 14.27±0.09c 0.00±0.00d 0.00±0.00d
新霉素 Neomycin 23.32±0.11a 16.79±0.89b 9.46±0.39c 0.00±0.00d 0.00±0.00d
盐酸土霉素 Oxytetracycline hydrochloride 25.34±0.53a 16.08±0.20b 0.00±0.00c 0.00±0.00c 0.00±0.00c
氟氧沙星 Ofloxacin 45.11±0.34a 37.42±0.47b 29.94±0.48c 16.32±0.15d 0.00±0.00e
氟苯尼考 Florfenicol 40.38±0.28a 28.41±0.41b 18.14±0.34c 0.00±0.00d 0.00±0.00d
红霉素 Erythromycin 24.15±0.12a 20.14±0.27b 15.59±0.59c 12.63±0.38d 0.00±0.00e
甲硝唑 Metronidazole 25.12±0.60a 0.00±0.00b 0.00±0.00b 0.00±0.00b 0.00±0.00b
阿莫西林 Amoxicillin 32.71±0.41a 25.78±0.21b 24.93±4.53b 0.00±0.00c 0.00±0.00c

2.5 地衣芽孢杆菌SXAU08对小鼠十二指肠组织形态的影响

在30 d的动物试验中,各组小鼠均无不良反应,存活率为100%,毛发光亮顺滑,精神状态、口鼻分泌物和活动性等生理状态正常,粪便呈颗粒状;剖检观察各脏器形态、大小和色泽正常,未见任何病变。
如图2所示,与对照组相比,试验组小鼠十二指肠绒毛高度和V/C值极显著提高(P<0.01),十二指肠隐窝深度极显著降低(P<0.01)。结果表明:灌服地衣芽孢杆菌SXAU08能够提高小鼠肠道绒毛高度、降低隐窝深度,从而增加小鼠肠道的吸收面积。
图2 地衣芽孢杆菌SXAU08对小鼠十二指肠组织形态的影响

A:对照组小鼠十二指肠HE染色(100×);B:试验组小鼠十二指肠HE染色(100×);C:十二指肠绒毛高度分析;D:十二指肠隐窝深度分析;E:十二指肠V/C值分析。**表示差异极显著(P<0.01)。

Fig.2 Effects of Bacillus licheniformis SXAU08 on duodenal tissue morphology of mice

A: HE staining in duodenum of mice in control group (100×); B: HE staining in duodenum of mice in experiment group (100×); C: villus height analysis in duodenum; D: crypt depth analysis in duodenum; E: V/C value analysis in duodenum. ** mean extremely significant difference (P<0.01).

2.6 地衣芽孢杆菌SXAU08对小鼠肠道菌群的影响

如图3所示,通过数据软件对试验组空肠内容物(JT)、对照组空肠内容物(JC)、试验组盲肠内容物(CT)和对照组盲肠内容物(CC)测序结果进行聚类和物种注释,以97%相似水平下的OTU进行生物信息统计分析发现,JT、JC、CT和CC的OTU数量分别为694、551、476和483个,其中JT和JC共有OTU数量为451个,特有OTU数量分别为243和100个;CT和CC共有OTU数量为402个,特有OTU数量分别为74和81个。
图3 小鼠肠道菌群OTU维恩图

JT:试验组空肠;JC:对照组空肠;CT:试验组盲肠;CC:对照组盲肠。图4同。

Fig.3 Venn diagram of OTU in gut microbiota of mice

JT: jejunum in experimental group; JC: jejunum in control group; CT: cecum in experimental group; CC: cecum in control group. The same Fig.4.

组间差异性分析结果显示,不同组间小鼠肠道细菌类群在门和属水平上相对丰度存在显著差异。如图4-A所示,在门水平上,小鼠肠道的优势菌门主要为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、脱硫杆菌门(Desulfobacterota)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和髌骨菌门(Patescibacteria)。与对照组相比,试验组小鼠空肠厚壁菌门和脱硫杆菌门相对丰度显著提高(P<0.05),空肠拟杆菌门相对丰度显著降低(P<0.05),空肠变形菌门相对丰度降低,但差异不显著(P>0.05);试验组盲肠厚壁菌门相对丰度升高,但差异不显著(P>0.05),盲肠脱硫杆菌门和髌骨菌门相对丰度显著提高(P<0.05),盲肠拟杆菌门和放线菌门相对丰度降低,但差异不显著(P>0.05)。如图4-B所示,在属水平上,小鼠肠道中共检测出26个属的微生物,其中相对丰度>1%的菌属JT有11个,JC有10个,CT有16个,CC有15个。与对照组相比,试验组小鼠空肠和盲肠乳杆菌属(Lactobacillus)相对丰度均显著提高(P<0.05);试验组空肠norank_f_Muribaculaceae、布克氏菌属(Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia)和毛螺菌科NK4A136群(Lachnospiraceae_NK4A136_group)相对丰度显著降低(P<0.05);试验组盲肠norank_f_Muribaculaceae、未分类毛螺菌科(unclassified_f_Lachnospiraceae)和脱硫弧菌属(Desulfovibrio)相对丰度显著增高(P<0.05),但盲肠毛螺菌科NK4A136群、文肯菌属(Rikenella)、Odoribacter和肠杆菌属(Enterorhabdus)相对丰度显著降低(P<0.05)。
图4 小鼠肠道菌群在门和属水平上的相对丰度

Fig.4 Relative abundances of gut microbiota of mice at phylum and genus levels

3 讨论

本研究从羊驼的肠道中分离出地衣芽孢杆菌SXAU08,并对其抑菌活性、益生菌所需特性及其对小鼠肠道菌群的影响进行研究,为羊驼地衣芽孢杆菌的益生潜能挖掘和应用奠定理论基础。饲用性益生菌一般会经过一系列的热加工过程,目前畜禽饲料加工一般制粒温度为70~90 ℃,时间为30 s左右,热加工会直接影响其生物活性。因此,良好的高温耐受性是筛选益生菌菌株必需的条件之一。益生菌制剂一般经口服到达胃肠进行定植,从而发挥调节肠道菌群、促进肠道健康等作用。动物消化道环境复杂,其中胃肠道内含有胃酸、胆盐和各种消化酶,构成了天然的化学屏障,对外来菌具有选择性,同时也影响益生菌的生存和定植。因此,菌株对人工胃液和人工肠液的耐受性也是评价益生菌功能的关键因素之一。益生菌的耐受特性通常通过体外试验进行测定[23],按照动物胃液的pH,一般设置试验pH为2~4。大量研究结果表明,地衣芽孢杆菌具有耐高温、耐酸碱以及耐人工胃液、肠液的特性[24-25],加之,芽孢杆菌在其生长发育后期会产生一种具有极低含水量和极强抗逆性的椭圆形厚壁休眠体,即芽孢,芽孢可以在肠道中发芽、定植并充当益生菌[26],且可以在肠上皮细胞中定植而不会对细胞造成任何损害[27]。因此,使用芽孢杆菌作为饲用益生菌的关键优势之一是其能够抵抗动物胃肠道的酸碱环境[1]。本试验结果与前人的报道基本一致,地衣芽孢杆菌SXAU08能在100 ℃作用5 min后仍保持活性;能耐受pH 2.0的人工胃液和0.4%胆盐的人工肠液。结果表明,地衣芽孢杆菌SXAU08可以抵抗机体胃酸、胰酶和胆盐的作用,其机制可能与其细胞膜各组分组成比例、代谢产物以及离子泵等有关[28]。
益生菌通过抑制有害菌生长从而发挥改善肠道菌群的作用。在本研究中,地衣芽孢杆菌SXAU08对指示菌的生长具有不同程度的抑制作用。地衣芽孢杆菌SXAU08无细胞培养上清液对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和藤黄微球菌的抑菌效果显著,对大肠杆菌、单增李斯特菌和短小芽孢杆菌具有一定的抑菌活性,而对甲型副伤寒沙门氏菌无抑菌作用。结合前期的研究结果,这可能与其产生的细菌素有密切的关系[29]。测定饲用菌的抗生素耐药性是对现有的和潜在的益生菌菌株体外安全性评估的一个重要内容。本试验结果表明,地衣芽孢杆菌SXAU08对常见的不同种类抗菌药物具有不同程度的敏感性,初步判断其不存在转移抗菌素耐药性相关基因的风险。
通过体内试验检测益生菌菌株的安全性,通常使用的动物模型有小鼠、大鼠,或是本源动物。本试验以小鼠为模型,灌服地衣芽孢杆菌SXAU08后,小鼠生长状态正常,零死亡,剖检各脏器颜色和性状均正常,表明该菌株是安全的,可进一步研究其益生作用。肠绒毛高度的提高使肠道对食物的接触面积增大,养分吸收能力增强;隐窝深度的变浅,表明肠上皮细胞再生能力增强,对营养物质的吸收能力增强;V/C值综合反映肠道消化吸收功能的强弱,其大小与肠道消化吸收能力呈正相关[30]。本试验对各组小鼠十二指肠形态进行了观察发现,与对照组相比,试验组小鼠十二指肠绒毛高度和V/C值极显著提高,这表明地衣芽孢杆菌SXAU08对小鼠肠道形态有一定的改善作用。对照组和试验组小鼠空肠和盲肠内容物的菌群测序和生物信息学分析得出:小鼠肠道的4大优势菌门为厚壁菌门、拟杆菌门、脱硫杆菌门和变形菌门,这与给小鼠灌服地衣芽孢杆菌菌株的相关研究结果[31]基本一致。相关研究表明,厚壁菌门/拟杆菌门值的高低与宿主营养物质运输、利用能力相关[32]。本研究中,与对照组相比,试验组小鼠空肠厚壁菌门相对丰度显著提高,空肠拟杆菌门相对丰度显著降低,空肠厚壁菌门/拟杆菌门值显著提高,这表明地衣芽孢杆菌SXAU08有利于宿主对饲粮的利用。此外,试验组小鼠空肠和盲肠脱硫杆菌门相对丰度显著高于对照组,脱硫杆菌门细菌是胃肠道硫化氢的主要生产者,细菌释放的硫化氢扩散到上皮下区域,这个过程由肠细胞和结肠细胞调控,这种相互作用对调节肠道黏膜功能及其内环境具有重要作用。
在属水平上,灌服地衣芽孢杆菌SXAU08的试验组小鼠空肠和盲肠乳杆菌属相对丰度均显著高于对照组。乳杆菌属的众多菌株已作为微生态饲料添加剂广泛应用于饲粮中,其在微生态制剂方面的研究也备受关注[33]。乳杆菌属在促进宿主代谢、增加动物体重、促进动物健康、增强免疫力以及预防疾病方面发挥作用[34]。相关研究表明,芽孢杆菌进入肠道生长摄取氧气进一步创造了一个厌氧环境,从而促进了乳杆菌属的生长[35-36]。结果提示,地衣芽孢杆菌SXAU08可能是通过提高小鼠肠道有益菌属的相对丰度,从而改善小鼠的肠道健康。

4 结论

① 源自羊驼肠道的地衣芽孢杆菌SXAU08具有良好的耐高温以及耐人工胃液和人工肠液的特性,其培养液对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和藤黄微球菌具有抑制作用。
② 灌服地衣芽孢杆菌SXAU08可提高小鼠十二指肠绒毛高度和V/C值,从而改善肠道形态;同时可提高肠道有益菌相对丰度,从而调节肠道菌群,维持肠道健康。

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