动物肠道内益生菌具有分泌抗菌物质、抑制肠道内有害细菌的繁殖、预防疾病发生的功效[1],在养殖过程中经常用到的主要有乳酸杆菌类、酵母菌类以及芽孢杆菌类等[2⇓-4]。动物肠道内益生菌还能够促进养分的吸收和转化,提高饲料中养分的利用率,刺激组织黏膜的生长,提高免疫力,减少因天气变化、接种疫苗和其他情况导致的应激反应的发生[5]。益生菌对动物健康至关重要,在养殖过程中动物因体内益生菌失衡而引起一些疾病,为了预防或治疗常需要用一些西药或疫苗,该法尽管见效快,但对动物甚至消费者都会产生化学药物成分残留等一些后续副作用,而中草药并无此副作用,因此选用一些中草药代替西药或疫苗成为人们的选择之一,故筛选出一些能激活肠道益生菌增殖的中草药意义重大。我国地大物博,自然环境复杂,中药资源极其丰富,2011—2020年国家中医药管理局组织开展了第4次全国中药资源普查,普查结果显示我国现有中药资源18 817种之多,这1.8万余种中药资源包括中国特有的药用植物3 151种[6]。中草药大多成分复杂,有些中草药含有刺激益生菌生长繁殖的有效成分[7-8],如茶多酚、人参皂甙等。为了从中草药中筛选出一些对益生菌有激活增殖活性的激活剂,本试验在测定添加不同中草药水提液前后益生菌培养液pH差值(△pH)后利用96孔板进行筛选,同时检测益生菌被激活增殖活性后的数量变化,为以后寻找对动物肠道益生菌具有激活增殖活性的中草药提供研究和应用参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验所用供试菌:德氏乳杆菌保加利亚亚种T15 (Lactobacillus.delbrueckii subsp. Bulgaricus.T15 菌种编号:1.155),购于广东省微生物菌种保藏中心,于-20 ℃冰箱保存。
试验所用培养基(MRS琼脂培养基)配方:蛋白胨10.0 g、牛肉膏粉5.0 g、酵母膏粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、吐温-80 1.0 mL、磷酸氢二钠2.0 g、乙酸钠5.0 g、柠檬酸三铵2.0 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.2 g、琼脂15.0 g,加蒸馏水至1 L。
乳酸杆菌选择性培养基配方:胰酪蛋白胨10.0 g、酵母浸粉5.0 g、磷酸二氢钾6.0 g、柠檬酸铵2.0 g、乙酸钠25.0 g、硫酸镁0.575 g、硫酸锰0.12 g、亚硫酸铁0.034 g、吐温-80 1.0 mL、葡萄糖20.0 g、琼脂15.0 g,加蒸馏水至1 L,pH调至5.5±0.2,25 ℃配制,置于2~8 ℃冰箱保存。
1.2 试验方法
1.2.1 中草药水提液的制备
初筛过程使用煎煮法。将中草药粉碎过40~100目筛,用天平称取5.000 g粉碎好的中草药,用适量蒸馏水浸泡(浸泡使药材内部膨胀有利于有效成分的提取)30 min,加入10倍量的蒸馏水在电陶炉上进行煎煮,先用武火煎煮至沸腾,然后用文火煎煮微沸30 min,用纱布过滤药液到烧杯中,然后再加第1次加水量的1/3继续煎煮2次,将提取的药液进行浓缩至1.000 g/mL,倒入准备好的离心管中,用离心机(离心力3 552×g)离心后取上清液放入高压蒸汽灭菌锅灭菌,取出观察无沉淀后置于2~8 ℃冰箱保存(低温下可以保存5 d)备用。
1.2.2 乳酸杆菌复活及菌液的制备
从0 ℃冰箱取出乳酸杆菌菌种,在超净工作台取0.5 mL菌液涂布于MRS培养基平板上,将接种好的乳酸杆菌放入厌氧罐中,放入气体指示剂,然后将厌氧产气袋包装剪开,取出里面纸袋立即放入罐中,与罐中空气接触后立即吸收氧气产生二氧化碳,盖好放入恒温培养箱即可。将培养罐倒置放入37 ℃电热恒温培养箱中培养,48~72 h后取出观察乳酸杆菌生长结果,观察平板培养基表面是否浑浊,有无菌落附着在培养基,乳酸杆菌应为乳白色菌落,部分菌体生长较少的可以清楚的看到白色点状菌落。用上述方法进行乳酸杆菌液体培养制备菌液。
1.2.3 激活乳酸杆菌增殖活性的中草药的初步筛选
乳酸杆菌增殖活性试验:本试验用96孔板法,它是一种高通量筛选方法[10],利用药物对细菌的作用,在乳酸杆菌接种到96孔板中培养24 h后能够清楚地观察到孔板内每个孔是否有白色菌落沉淀或者浑浊,根据沉淀或者浑浊程度来初步判断乳酸杆菌增殖情况。因为乳酸杆菌在生长过程中会产生乳酸,所以96孔板法培养前后分别用精密pH试纸测定其pH,根据培养前后pH的变化对是否有菌生长进行判断。
具体操作:打开96孔板盖,先用微量移液器吸取每个准备好的药液100 μL在对应孔中,吸取药液前要先摇匀;再分别吸取100 μL菌悬液到每个孔中,对照组为100 μL菌悬液+100 μL肉汤(肉汤应该微热,减少肉汤内含的氧气);盖上盖子,用明矾将盖缝封好,隔绝氧气形成相对厌氧环境;把96孔板放入37 ℃电热恒温培养箱中培养24 h后取出,从每个孔吸取10 μL混合液滴在精密pH试纸上测定其pH,培养前后pH变化越大说明该孔中乳酸杆菌增殖活性越强。
1.2.4 激活乳酸杆菌增殖活性的中草药的定量试验
将96孔板法获得的激活乳酸杆菌增殖活性较强的4味中草药(五味子、白术、木香、山楂)粉碎后煎煮浓缩离心进行微量化高通量定量试验。
药液的稀释:用二倍稀释法对各药液进行稀释,即每个药液用微量移液器吸取1 mL后加入准备好的试管中(每支试管用微量移液器加有1 mL无菌水),每个药液稀释10个浓度备用。
菌液的准备:将在肉汤中提前培养了48 h的乳酸杆菌从冰箱取出,置于37 ℃电热恒温培养箱中培养30 min。
增殖活性试验:将稀释好的菌液用微量移液器吸取150 μL于96孔板中,每个孔放1个浓度,1个孔板做3次重复,做1组添加MRS肉汤的空白对照,然后每个孔均吸取150 μL准备好的菌液;将96孔板每个孔内的菌液、药液混匀之后用微量移液器吸取10 μL,用精密试纸分别测pH(称初始pH,计作pH0 h);盖好96孔板,用明矾将孔板外面缝隙封好隔绝氧气,置于电热恒温培养箱中培养24 h,其中间隔几小时测定每个浓度菌悬液的pH(计作pHn h),计算培养不同时间后的△pH(△pH=pHn h-pH0 h)。
1.2.5 中草药水提液对乳酸杆菌增殖活性影响的测定
药液的煎煮:用天平分别称五味子、山楂各20 g(经粉碎机粉碎后)于烧杯中,先加少量蒸馏水润湿30 min,加10倍量水用武火煎煮至沸腾后用文火煎煮30 min,用纱布过滤到烧杯,再加1/3头煎所用水煎煮2次,合并3次煎煮液浓缩至20 mL,离心取上清液,灭菌。
菌悬液的处理:取4支无菌试管,用量筒(经过高压蒸汽灭菌15 min)量取16 mL MRS肉汤培养基分别倒入每支试管,将平板上的乳酸杆菌用接种环接到每支试管中,用移液器量取100 mL石油醚隔绝氧气,培养24 h后混匀4支试管测其OD值(0.085,为初始值)。
增菌试验:用二倍法稀释药液(10 mL蒸馏水加10 mL药液)依次稀释到浓度为62.5 mg/mL。用微量移液器吸取稀释后的每个浓度的药液5 mL,加入到无菌试管中,每支试管再加入5 mL MRS肉汤+5 mL菌悬液,空白对照加入10 mL肉汤+5 mL菌悬液,再用移液器吸取10 mL石油醚加入到每支试管中隔绝氧气,置于37 ℃培养箱中培养。
△OD值的测定:分别在培养0、1、2、4、6、12、16、24 h后测每支试管内菌悬液在600 nm处的OD值,测定时每支试管吸取1 mL菌悬液加4 mL蒸馏水,根据前面所述公式计算每个时间点△OD值。
1.2.6 被中草药激活增殖活性后的乳酸杆菌平板试验
对乳酸杆菌增殖活性有一定激活作用(即△pH大于0)的15种中草药进行平板试验。根据15种待测中草药定量试验结果将菌液作梯度稀释至1×10-7,取各浓度梯度的菌液1 mL涂平板,每个浓度梯度作3个重复,置37 ℃培养24 h,以不加中草药水提液的平板作空白对照,取出后参考GB 4789.2—2022《食品微生物学检验 菌落总数测定》选菌落数在30~300个的平板计数菌落数。
1.2.7 动物验证试验
1.2.7.1 小鼠阿莫西林型肠道乳酸杆菌失衡模型建立
将阿莫西林溶于30%蔗糖溶液中,使其终质量浓度为0.25 mg/kg。采取自由饮用阿莫西林溶液的方法造模,为保证溶液的有效性,每2 d更换1次。将小鼠饲养于25 ℃恒温、通风良好的饲养笼内,处理期为7 d。
模型判定:1)对小鼠粪便进行菌落特征、革兰氏染色、镜检初步鉴定,观察其中乳酸杆菌的菌落数变化,进而初步确定乳酸杆菌的失调情况。2)在造模第0(开始前)、4、8天采集小鼠粪便,采用平板计数法测定小鼠肠道内乳酸杆菌的数量,根据乳酸杆菌数量的变化情况判定模型是否建立成功。
1.2.7.2 模型处理
灌胃中草药水提液的制备:根据定性试验确定的五味子、山楂、木香、白术水提液最佳作用浓度,分别制得最佳作用浓度的五味子(250 mg/mL)、山楂(500 mg/mL)、木香(500 mg/mL)、白术水提液(250 mg/mL)。
将小鼠分为6组,其中5组小鼠采用上述建模方法进行阿莫西林处理,剩余1组小鼠不进行阿莫西林处理,每组6只。阿莫西林型肠道乳酸杆菌失衡模型建立以后,小鼠每天灌胃0.5 mL中草药水提液或无菌生理盐水,连续灌胃7 d。A组为五味子组(进行了阿莫西林处理的模型小鼠),灌胃的五味子水提液浓度为250 mg/mL;B组为山楂组(进行了阿莫西林处理的模型小鼠),灌胃的山楂水提液浓度为500 mg/mL;C组为木香组(进行了阿莫西林处理的模型小鼠),灌胃的木香水提液浓度为500 mg/mL;D组为白术组(进行了阿莫西林处理的模型小鼠),灌胃的白术水提液浓度为250 mg/mL;E组为阴性对照组(未进行阿莫西林处理的正常小鼠),灌胃无菌生理盐水;F组为阳性对照组(进行了阿莫西林处理的模型小鼠),灌胃无菌生理盐水。
1.2.7.3 样品处理及细菌培养
样品处理:对照组在第0(灌胃开始时)、4、8、12、16、20、24、28天收集粪便,试验组在第4、8、12、16、20、24、28天收集粪便。用灭菌的镊子夹取小鼠新鲜粪便0.5~1.0 g,加入预先已称质量并灭菌的试管中,添加无菌玻璃珠将小鼠粪便进行充分振荡,加1 mL磷酸盐缓冲液混匀后置于4 ℃保存备用。
细菌的培养和计数:将充分振荡混匀的粪便样品作系列梯度稀释,分别取其适当稀释度的一定量悬液涂布于乳酸杆菌选择培养基上,置37 ℃厌氧培养48 h,培养基中细菌菌落需根据菌落特征、革兰氏染色、镜检初步鉴定后方可计数,并转换成每克粪便中乳酸杆菌数量(1 g粪便溶于1 mL水即g/mL),单位以lg(CFU/g)表示。
1.3 数据处理及分析
试验数据使用Origin 2018软件进行可视化绘图,使用SPSS 22.0对获得的数据进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 中草药激活乳酸杆菌增殖活性的定性试验结果
从表1可知,49种中草药对乳酸杆菌增殖活性的激活效果各不相同,△pH越大说明对乳酸杆菌增殖活性的激活作用越强。从△pH大小来看,五味子、山楂、木香、白术对乳酸杆菌增殖活性的激活作用最强,在加入这4种中草药水提液前后△pH均在1.0以上;在加入汉防己、黄芪等11种中草药水提液前后△pH均在1.0以下,说明这11种中草药对乳酸杆菌的增殖活性具一定的激活作用;在加入厚朴、大青叶等34种中草药水提液前后△pH均为0,说明这34种中草药对乳酸杆菌的增殖活性无激活作用。根据上述待测中草药对乳酸杆菌增殖活性的激活效果,选用五味子、山楂、木香、白术4种中草药进行后续研究,对其进行定量检测。
表1 49种中草药激活乳酸杆菌增殖活性的定性试验结果Table 1 Qualitative test result of proliferation activity of Lactobacillus activated by 49 Chinese herbal medicines |
| 项目 Items | pH差值 △pH | ||
|---|---|---|---|
| >1.0 | <1.0 | =0 | |
| 乳酸杆菌增殖活性 Proliferation activity of Lactobacillus | 增殖活性高 | 有增殖活性 | 无增殖活性 |
| 中草药名称 Names of Chinese herbal medicines | 五味子、山楂、 木香、白术 | 汉防己、黄芪、 黄芩、党参、栀子、 鱼腥草、桔梗、枸杞子、 金银花、羌活、旋覆花 | 厚朴、大青叶、板蓝根、秦皮、陈皮、贯众、 乌梅、牡丹皮、千里光、苏木、余甘子、 茯苓、大黄、虎杖、玄参、连翘、 紫花地丁、决明子、菊花、藁本、百合、 桑叶、苍术、石榴皮、瞿麦、金钱草、 天门冬、甘草、黄连、黄柏、穿心莲、 荷叶、丁香、徐长卿 |
2.2 对乳酸杆菌具有较高激活增殖活性的4种中草药的定量试验结果
不同浓度的4种中草药水提液培养前后的菌液△pH如表2所示。定量试验结果显示山楂、五味子、木香和白术这4种中草药对乳酸杆菌都具有激活增殖活性的作用,其中五味子的激活作用最强,其水提液最佳作用浓度为250 mg/mL,此时△pH为2.0,其次是山楂,其水提液最佳作用浓度为500 mg/mL,此时△pH为1.4,再次是木香和白术,木香水提液最佳作用浓度为500 mg/mL,白术水提液最佳作用浓度为250 mg/mL,二者最佳作用浓度下△pH均为1.1。
表2 不同浓度的4种中草药水提液培养前后菌液△pHTable 2 △pH of bacteria solution before and after culture with different concentrations of water extracts for 4 Chinese herbal medicines |
| 水提液浓度 Water extract concentrations/(mg/mL) | 中草药名称 Names of Chinese herbal medicines | 空白对照 Blank control | |||
|---|---|---|---|---|---|
| 山楂 Crataegus pinnatifida | 五味子 Fructus schizandrae | 木香 Aucklandia lappa | 白术 Atractylodes macrocephala | ||
| 1 000 | 1.1 | 1.0 | 0.8 | 0.7 | 0.7 |
| 500 | 1.4 | 1.2 | 1.1 | 0.9 | |
| 250 | 1.3 | 2.0 | 0.7 | 1.1 | |
| 125 | 1.0 | 1.9 | 0.6 | 0.9 | |
| 62.5 | 0.6 | 1.0 | 0.6 | 0.6 | |
| 31.25 | 0.5 | 1.3 | 0.3 | 0.4 | |
| 15.625 | 0.4 | 0.3 | 0.4 | 0.2 | |
| 7.812 5 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.3 | |
| 3.906 25 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | |
| 1.953 13 | 0.4 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | |
2.3 五味子、山楂对乳酸杆菌增殖活性的影响
图1为被五味子水提液激活的乳酸杆菌的生长曲线,生长曲线中△OD值越大,说明乳酸杆菌增殖越多。由生长曲线可以看出,五味子水提液浓度为250 mg/mL时乳酸杆菌增殖活性最高,在培养12 h时△OD值为0.368,增长趋势最快,而浓度为125 mg/mL时在培养12 h时的△OD值为0.256,尽管它们的△pH均为1.9;五味子水提液浓度为500 mg/mL时,在0~2 h时增殖速度最快,在培养2 h时的△OD值为0.059;当五味子水提液浓度为62.5 mg/mL时,对乳酸杆菌表现出无激活甚至抑制增殖作用。
图2为被山楂水提液激活的乳酸杆菌的生长曲线。由生长曲线可以看出,在培养12 h时,山楂水提液浓度为500 mg/mL时乳酸杆菌增殖活性最高,增殖速度最快,其次为250 mg/mL,再次为1 000 mg/mL,空白对照的增殖速度最慢。
2.4 对乳酸杆菌增殖活性有激活作用的中草药平板试验结果
平板试验结果(表3)显示,添加五味子水提液后乳酸杆菌的活菌数为(8.68±0.04) lg(CFU/g),活菌数最多;其次是添加山楂水提液,乳酸杆菌的活菌数为(8.39±0.05) lg(CFU/g);再次是添加木香水提液和白术水提液,乳酸杆菌的活菌数分别为(8.17±0.09) lg(CFU/g)和(8.02±0.03) lg(CFU/g),而空白对照的乳酸杆菌活菌数仅为(6.37±0.07) lg(CFU/g)。统计分析结果表明,添加不同中草药水提液后乳酸杆菌的活菌数均显著高于空白对照(P<0.05),表明添加中草药水提液后乳酸杆菌的增殖活性增强显著。
表3 添加不同中草药水提液后乳酸杆菌的活菌数Table 3 Viable bacteria count of Lactobacillus after adding different Chinese herbal medicine water extractslg(CFU/g) |
| 项目 Item | 五味子 Fructus schizandrae | 山楂 Crataegus pinnatifida | 木香 Aucklandia lappa | 白术 Atractylodes macrocephala | 汉防己 Hanfangji | 黄芪 Astragalus membranaceus | 党参 Codonopsis pilosula | 栀子 Gardenia | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 活菌数 Viable bacteria count | 8.68 ±0.04a | 8.39 ±0.05a | 8.17 ±0.09a | 8.02 ±0.03a | 7.72 ±0.03a | 7.60 ±0.02a | 7.52 ±0.05a | 7.46 ±0.05a | |||||||||
| 项目 Item | 鱼腥草 Houttuynia cordata | 桔梗 Platycodon grandiflorum | 枸杞子 Lycium barbarum | 金银花 Lonicera japonica | 羌活 Notopterygium root | 旋覆花 Spiny flower | 黄芩 Scutellaria baicalensis | 空白对照 Blank control | |||||||||
| 活菌数 Viable bacteria count | 7.40 ±0.03a | 7.22 ±0.12a | 7.24 ±0.08a | 7.21 ±0.02a | 7.02 ±0.03a | 7.37 ±0.05a | 7.41 ±0.13a | 6.73 ±0.07b | |||||||||
表内活菌数数据表示为平均值±标准差。数据肩标相同字母者表示差异不显著(P>0.05),不同字母者表示差异显著(P<0.05)。 | |
Data of viable bacteria count in the table expressed as mean±standard deviation. Values with the same letter shoulders indicated no significant difference (P>0.05), while with different letter shoulders indicated significant difference (P<0.05). |
2.5 4种中草药对小鼠肠道内乳酸杆菌的激活和增殖调节作用
试验小鼠在阿莫西林干预(饮用阿莫西林蔗糖溶液)期间(第1~7天),肠道内乳酸杆菌数量明显下降,与阴性对照组相比,肠道内乳酸杆菌数量下降2个数量级即109下降至107。此时,小鼠毛无光泽、不顺,粪便蓬松湿润,结合肠道内乳酸杆菌数量的变化,小鼠阿莫西林型肠道乳酸杆菌失衡模型已建立。
以阿莫西林干预(饮用阿莫西林蔗糖溶液)小鼠7 d后,灌胃4种不同中草药水提液期间,小鼠肠道内乳酸杆菌数量发生不同的变化,详见图3。250 mg/mL五味子水提液组小鼠肠道内乳酸杆菌数量在灌胃第4天时为7.5 lg(CFU/g)[阳性对照组为7.0 lg(CFU/g),阴性对照组为8.9 lg(CFU/g)],在灌胃第20天时为9.0 lg(CFU/g)[阳性对照组为7.3 lg(CFU/g),阴性对照组为9.0 lg(CFU/g)],此时该组小鼠肠道内乳酸杆菌数量基本恢复至正常水平,即与阴性对照组水平相当;而阳性对照组小鼠在停止饮用阿莫西林蔗糖溶液后,肠道内乳酸杆菌数量缓慢恢复,直至试验结束时也未恢复至正常水平;500 mg/mL山楂水提液组和250 mg/mL白术水提液组小鼠在灌胃第24天时肠道内乳酸杆菌数量均达到9.0 lg(CFU/g)[阳性对照组为7.3 lg(CFU/g),阴性对照组为9.0 lg(CFU/g)],已恢复至正常水平,但与250 mg/mL白术水提液组相比,500 mg/mL山楂水提液组在第4~24天期间乳酸杆菌数量恢复较为迅速;500 mg/mL木香水提液组的药效较慢些,灌胃至第28天后肠道内乳酸杆菌数量方达到正常水平。
3 讨论
益生菌可通过平衡体内细菌的数量和促进良好的新陈代谢来创造健康的肠道环境,从而提高动物机体的免疫力[12-13]。Maeda等[14]将热灭活的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L-137给试验小鼠服用,再用H1N1型禽流感病毒对小鼠进行滴鼻灌毒时验,结果表明,热灭活的Lactobacillus plantarum L-137能够刺激小鼠机体产生β-干扰素(IFN-β,为Ⅰ型干扰素细胞因子),机体抗病毒能力得到增强。Kobayashi等[15]证实了口服热灭活的戊糖乳杆菌菌株B240能够增强流感病毒感染小鼠的免疫保护能力。Waki等[16]将冻干的短乳杆菌KB290通过灌胃的方式给小鼠免疫,用流感病毒(IFV)对小鼠进行鼻内感染,结果显示,在感染前口服短乳杆菌KB290可以减轻IFV引起的临床症状,并能够增强α-干扰素(IFN-α)的产生和诱导产生特异性的IFV-免疫球蛋白A(IFV-IgA)。在本研究中,给肠道内乳酸杆菌失衡模型小鼠灌胃筛选出的中草药水提液后,随着灌胃中草药水提液时间的推移,小鼠肠道内乳酸杆菌数量也在变化并逐渐恢复到正常水平。据此推测,有些中草药应该具有促进动物肠道内益生菌的繁殖和生长的活性,从而增强动物的免疫力,促进动物新陈代谢。
另外,中草药对动物肠道中微生物菌群的调节作用有时是西药无法代替的,目前有关中草药直接对肠道内益生菌的激活和增殖调理的研究并不多见,现有的研究报道主要集中在微生态益生菌制剂、益生元、合生菌和后生元等,这些微生态制剂一般都直接添加益生菌进入肠道内[17-18]。但这些益生菌的活菌数是否稳定或一直达标,能否在肠道内特定部位定植还存在一些不确定性。研究如何筛选出一些能对原有体内益生菌即土著益生菌有激活和增殖功能并能在一定程度上修复动物肠道内土著益生菌微生态的中草药就显得非常有意义。本试验中筛选到的4种能激活乳酸杆菌的中草药——五味子、山楂、白术和木香:五味子含五味子素、脱氧五味子素、新一味子素、五味子醇以及五味子酯A、B、C、D、E、F、G、H、J、K1、K2、K3、L1、L2、M1、M2、N2、O、R等[9],其中能作为乳酸杆菌营养物质可能是五味子醇、五味子酯,别的成分是否也能激活乳酸杆菌增殖有待进一步研究;山楂含有石酸、柠檬酸、皂苷、果糖、维生素C、维生素B1、烟酸、钙、铁、硒、黄酮等成分[9],其中能作为益生菌生长所需营养有皂昔、果糖、维生素C、维生素B1、烟酸、钙、铁、硒,这可能是山楂能激活乳酸杆菌增殖的原因所在;白术含1.4%的挥发油,其主要成分为苍术醇、苍术酮、维生素A、白术内酯甲、白术内酯乙、芹统二烯酮、β-芹油烯、校树萜、氧香豆素类、糖类及树脂等[9],其中能作为乳酸杆菌营养物质的可能只有醇类和糖类、维生素A,但别的成分是否也能激活乳酸杆菌增殖有待进一步研究;木香含有挥发油、木香碱、菊糖等[9],其中作为乳酸杆菌营养物质可能只有菊糖。上述这4种中草药均含有乳杆菌繁殖生长所需要的营养成分碳源和氮源,如醇、糖酯类碳水化合物[19];有些还具有乳酸杆菌生长繁殖所需要的大量元素和微量元素,如维生素类[19]。另外,通过《中药大辞典》[9]对其余的34种对乳酸杆菌增殖无激活作用的中草药主要组分进行查找,结果表明这些中草药大部分不含有或有含量极低的乳酸杆菌生长繁殖所需的营养成分,或含有不能被乳酸杆菌分解吸收的大分子复杂有机物成分,如萜类、纤维素类、木质素类、长链烃类[19](因乳酸杆菌细胞内无相应降解酶系)。综上所述,对乳酸杆菌有激活作用的中草药中大都含该菌生长繁殖所需的有效成分:醇类、糖类、酯类及大量元素如钙、铁和微量元素如维生素C、维生素B1、维生素A,没有激活乳酸杆菌增殖活性的中草药一般没有上述乳酸杆菌生长繁殖所需的有效成分。当然,通过水煮、煎熬获取中草药水提液的提取方法可能存在某些局限性,如有些中草药的有机成分不一定溶于水,而是溶于某些有机溶剂如酒精等[20⇓-22],这些中草药的有效成分可能被遗漏,这将在今后的中草药筛选中进一步完善和补充。
4 结论
本试验结果表明,五味子、山楂、白术、木香对乳酸杆菌增殖活性具有较强的激活作用,其中作用最强的是五味子,其水提液的最佳作用浓度为250 mg/mL,其次是山楂,其水提液的最佳作用浓度为500 mg/mL,木香、白术对乳酸杆菌增殖活性也有一定的激活作用,木香水提液的最佳作用浓度为500 mg/mL,白术水提液的最佳作用浓度为250 mg/mL;汉防己、黄芪等11种中草药对乳酸杆菌增殖活性具有较低的激活作用;其余34种中草药对乳酸杆菌增殖活性没有激活作用。上述研究结果是在本实验室现有条件下得出的部分中草药的筛选结果,该结果可为今后大规模高通量筛选出能对土著益生菌增殖活性有激活作用并能修复肠道内土著益生菌微生态的中草药研究提供一定的参考。