原位尼龙袋技术,又称瘤胃尼龙袋法,是测定饲料营养物质在瘤胃中降解程度和速率的常用方法,但该方法的测定结果受到尼龙袋大小、洗涤方式以及尼龙袋残渣中微生物氮是否校正等因素的影响。在使用该技术时对这些影响因素没有统一要求,就造成了实验室之间,甚至实验室内部评价结果的不一致,限制了相关研究结果的比较、借鉴,以及数据库构建,甚至是数据的开发与应用[1]。因此,有必要对这些影响因素进行研究,并加以优化。
本文总结了针对原位尼龙袋技术优化问题开展的相关试验研究结果,在2019版原位尼龙袋技术评定羊饲料瘤胃蛋白质降解率的技术规程的基础上提出新的建议方案,同时为该方法牛上的应用给出建议,以期为进一步制定相关技术规程或标准提供参考。
1 原位尼龙袋技术优化研究进展
影响原位尼龙袋技术测定结果的因素具体分为2类,其一为试验动物(如品种、年龄、生理阶段等)和饲粮因素(如饲粮类型、饲喂水平、饲喂制度等);其二为尼龙袋规格、待测饲料粉碎粒度及装袋量、投放尼龙袋开始时刻及其在瘤胃培养的时间等因素。而这些影响因素完全可以通过试验研究加以优化。
自2019年《原位尼龙袋技术在评价饲料营养价值中的应用与建议方案》[1]一文在《动物营养学报》上发表以来,国内学者就原位尼龙袋技术优化开展了一些研究工作。此外,就原位尼龙袋技术简化也开展了部分研究。
1.1 饲粮精粗比和尼龙袋投放方式对羊常用饲料瘤胃降解规律的影响
任何对瘤胃微生物区系造成影响的饲粮因素都可能对利用原位尼龙袋技术评定饲料瘤胃降解率和降解程度造成影响。饲粮精料水平是影响瘤胃生态系统的主要因素,饲粮精粗比是反映饲粮精料水平的常用指标之一,它对瘤胃微生物合成、瘤胃内环境、饲料的降解等方面均有一定的影响。
栾银银[5]以毛肉兼用羊为试验动物,研究了饲粮精粗比(3∶7、4∶6)和投放方式(分开投放、同时投放)对羊常用饲料瘤胃降解规律的影响,结果表明,玉米、豆粕、鸭茅和黑麦秸4种饲料在不同精粗比饲粮下的瘤胃降解特性不同,除豆粕粗蛋白质(CP)的瘤胃降解率在精粗比为4∶6时较高外,其他3种饲料CP、DM、有机物(OM)的瘤胃降解率均在精粗比为3∶7时较高;对于尼龙袋的投放方式,分开投放时玉米、豆粕这2种精饲料CP、DM和OM的瘤胃降解率高于同时投袋,同时投放时黑麦秸CP、鸭茅OM的瘤胃降解率较高,2种投放方式对其他营养成分的降解特性无显著影响;此外,饲粮精粗比和尼龙袋投放方式两者之间存在互作效应。根据上述试验结果,结合生产实际,建议在绒毛羊上应用原位尼龙袋技术评价饲料营养价值时饲粮精粗比为3∶7,肉用羊和奶山羊为4∶6,同时为了保证不同时间点的尼龙袋于相同的瘤胃环境中开始降解,采取同时投放分别取出的方式更好。
1.2 尼龙袋冲洗方法对饲料瘤胃降解率的影响
为保证称量和计算准确,阻止附着在饲料残渣上的瘤胃微生物继续发酵,需要将尼龙袋从瘤胃取出后立即进行清洗。手洗和机洗是目前常用的清洗方式。Vanzant等[4]通过查阅63份相关的文献发现,手洗、机洗的比例分别为70%和30%,为了更好的实现程序化,他们建议对尼龙袋进行机洗。
1.3 饲喂频率和投放时间对饲料瘤胃降解特性的影响
反刍动物采食后,瘤胃pH等指标随着时间变化,瘤胃微生物的活性也有差异,进而影响饲料在瘤胃中的降解特性。Meyer等[7]研究发现,随着饲喂频率的增加,瘤胃细菌进入尼龙袋的数量和速度也随之增加。由于饲喂前后瘤胃内环境不同,故尼龙袋的投放时间(饲喂前或者饲喂后)也会影响饲料的瘤胃降解特性。
党世彬[6]研究了饲喂频率(2和4次饲喂)和尼龙袋投放时间(晨饲前投袋和饲喂后2 h投袋)对常用饲料瘤胃降解特性的影响,结果发现,饲喂频率除了对各时间点的实时降解率的影响不一致外,4次饲喂的玉米、小麦秸、黑麦干草这3种饲料CP的降解参数、有效降解率以及小麦秸、黑麦干草这2种饲料DM的降解参数、有效降解率均高于2次饲喂;投放时间对玉米、豆粕这2种精饲料DM个别时间点的实时降解率、有效降解率,对小麦秸、黑麦干草这2种粗饲料CP、DM的个别时间点的实时降解率有影响。鉴于同时投放分别取出的尼龙袋投取方式,晨饲前因胃内容物少投放更容易操作,因此,在使用原位尼龙袋技术测定饲料瘤胃降解特性时,建议晨饲前投放。
1.4 尼龙袋中样品重对饲料瘤胃降解特性的影响
Diao等[12]研究了尼龙袋装袋量对2种饲料(豆粕、黑麦干草)CP和DM瘤胃降解特性的影响,所使用的尼龙袋规格为6 cm×10 cm,豆粕的装袋量为3、4、5、6 g,黑麦干草的装袋量为1.5、2.5、3.5、4.5 g,结果发现,对于豆粕来说,其CP、DM的有效降解率不受装袋量的影响,但多个时间点的实时降解率会受到装袋量的影响;对于黑麦干草来说,装袋量对CP的降解参数无影响,对DM的降解率及降解参数的影响不同,当装袋量为1.5、2.5 g时,DM的有效降解率显著提高。综合上述研究结果及实际操作过程,若装袋量过大,则会增加投取尼龙袋时的难度,尤其是对于体积较大的粗饲料来说;若装袋量过小,则会导致残渣中营养成分测定样品不足,因此建议在羊上应用原位尼龙袋技术评价饲料营养价值时,精饲料、粗饲料的样品装袋量分别为3.0、2.5 g左右,样品重/尼龙袋面积分别为25、20 mg/cm2左右。
1.5 羊常用饲料瘤胃外流速率和有效降解率的研究
刘胜寒[18]使用重铬酸钾标记法和消化试验实测了6种羊常用饲料的瘤胃外流速率,并比较了使用实测外流速率值得到的有效降解率与使用参考值得到的有效降解率之间的差异,结果发现,不同饲料在瘤胃中停留的时间不同,豆粕、菜籽粕、玉米这3种精饲料和鸭茅、大豆秸秆、小麦秸秆这3种粗饲料粪中铬含量达到峰值的时间分别是24~28 h、24~36 h,外流速率分别为7.30、7.49、6.84、5.02、5.59、3.97%/h,3种精饲料的瘤胃外流速率均高于3种粗饲料;用实测饲料瘤胃外流速率计算得到的6种饲料3种营养成分(DM、OM和CP)的有效降解率值均小于使用参考值得到的值,且2种方法测得的有效降解率相对误差较大。因此,建议在使用原位尼龙袋技术测定饲料瘤胃降解特性时,尤其是在计算饲料瘤胃有效降解率时实测待测饲料的外流速率,待这方面的数据积累较多时,再考虑参考引用。
1.6 0时间点的应用对饲料瘤胃降解特性的影响
刘俊杰等[23]用3种方式计算了0时间点数据在拟合瘤胃降解参数中的应用,分别为不使用0时间点数据(方式1)、将0时间点作为1个时间点数据参与计算(方式2)、将0时间点的降解率作为空白对其他时间点的降解率进行校正(方式3),结果表明,使用方式1、2得到的有效降解率均高于方式3,且方式1、2之间无显著差异,即用0时间点的数据对其他时间点的降解率进行校正后所得的有效降解率显著降低。根据上述试验结果及原位尼龙袋技术的基础理论,建议0时间点的数据不参与降解参数的计算,可以与计算得到的快速降解部分进行比较来评估试验的准确性。
1.7 新尼龙袋使用前瘤胃浸泡处理及使用次数对饲料瘤胃降解特性的影响
目前,新尼龙袋使用前的处理方式有3种,第1种是不浸泡,第2种是用水浸泡,第3种是在瘤胃中浸泡,使用第3种的较多。尼龙袋重复使用在一定程度上可以降低试验成本、减少浪费,但是多次重复使用势必造成尼龙袋孔径变化而影响饲料瘤胃降解特性。
李森[24]以羊为试验动物,研究了新尼龙袋使用前的浸泡处理(未浸泡、瘤胃预浸泡72 h)及使用次数(新尼龙袋以及使用1、2、3、4、5次的尼龙袋)对饲料瘤胃降解特性的影响,结果显示,在新尼龙袋使用前浸泡处理会影响饲料的瘤胃降解特性,且对不同种类饲料的影响不同,除小麦秸CP的有效降解率显著提高外,玉米、豆粕CP、DM的有效降解率及小麦秸、黑麦干草DM的有效降解率均降低,说明新尼龙袋使用前浸泡处理会导致尼龙袋表面大量积累附着物,堵塞孔径,降低饲料的瘤胃降解率;在研究尼龙袋重复使用对饲料瘤胃降解特性影响的同时,使用扫描电镜观察了不同使用次数的尼龙袋的孔径结构,结果发现,尼龙袋使用次数除了对豆粕DM、CP的降解率无影响外,对玉米、小麦秸DM和CP的降解率及对黑麦干草DM、CP的降解率均有显著影响;随着尼龙袋使用次数的增加,尼龙袋空隙堵塞程度增大,表面附着物也增多。综合上述试验结果,建议在使用原位尼龙袋技术测定饲料瘤胃降解特性时,如有条件不重复使用尼龙袋或尽量降低使用次数,且新尼龙袋使用前无需在瘤胃中浸泡处理。
1.8 25种饲料原位降解动力学参数及瘤胃培养时间点的简化
不同学者在使用原位尼龙袋技术测定饲料瘤胃降解率时选择的瘤胃培养时间点个数不同,一般为5~7个。通常测量的时间点个数越多,得到的降解参数和有效降解率越准确,降解曲线的拟合程度越高。但是,过多的时间点会增加试验的工作量,给试验动物带来严重负担,通过减少测量时间点,可以提高试验动物福利,减少成本和人工。此外,时间点设置过多,时间间隔短,频繁的投袋和取袋会导致瘤胃微生物长期暴露于外部环境,影响瘤胃的正常功能,从而影响试验结果。
Li等[25]采用原位尼龙袋技术测定了25种饲料(6种蛋白质饲料、9种能量饲料和10种粗饲料)的瘤胃降解特性,并用拟合优度(R2)评价了5和7个时间点得到的降解曲线的差异,结果表明,只有几种饲料用5个时间点得到的降解参数a(快速降解部分)、b(慢速降解部分)和c(慢速降解部分降解率)与7个时间点得到的差异显著外,其他饲料差异不显著,且5个时间点得到的降解曲线的R2更接近于1,说明5个时间点的拟合更能准确预测饲料的瘤胃有效降解率。由此可见,设置5个瘤胃培养时间点即可确定饲料瘤胃降解特性,并根据合理的选择标准,其中精饲料的最佳瘤胃培养时间为2、16、24、36、48 h,粗饲料的最佳瘤胃培养时间为4、8、16、48、72 h。
1.9 瘤胃尼龙袋饲料残渣中微生物氮含量的研究
本实验室采用持续瘤胃灌注15N标记硫酸铵的方法标记瘤胃微生物,区分饲料残渣中剩余的饲料氮和瘤胃微生物合成的微生物氮,实测了30种粗饲料尼龙袋残渣中微生物氮污染量,准确测定了粗饲料氮在瘤胃中的降解特性。目前,我们正在探寻尼龙袋残渣中微生物氮与饲料原料营养成分之间存在的回归关系,拟合饲料残渣中微生物氮的预测方程。此外,本实验室通过研究还发现,在使用原位尼龙袋技术测定粗饲料瘤胃降解特性时必须进行微生物污染的校正,且用瘤胃液体相关细菌和固体相关细菌2种标记方法校正微生物污染无差异;粗饲料微生物氮污染程度符合指数方程Ncont.=Nmax(1-exp-Kt)[式中:Ncont.表示尼龙袋残渣中微生物氮的污染量(%);Nmax表示瘤胃培养时间≈∞时最大微生物氮污染量(%);K表示微生物污染速率(%/h);t表示尼龙袋在瘤胃中的培养时间(h)]。
2 原位尼龙袋技术简化研究进展
王雨菲等[30]以绵羊为试验动物,研究了25种饲料原料(15种精饲料、10种粗饲料)各时间点实时降解率与有效降解率之间的相关性,结果表明,25种饲料原料的16 h DM、CP的实时降解率与有效降解率的相对误差最小,且DM、CP有效降解率(Y)与16 h的实时降解率(X)间的线性方程分别为Y=0.793 1X+10.767(R2=0.682,P<0.01,n=25)、Y=0.761 8X+13.535(R2=0.821,P<0.01,n=25)。因此,在测定饲料瘤胃降解特性时,可以用16 h的实时降解率或者线性回归方程来估算待测饲料的有效降解率。
3 羊用原位尼龙袋技术建议方案
根据课题组前期开展的试验,以及其他学者的相关研究,对羊用原位尼龙袋技术的建议方案(2019版)[1]进行更新,2024版供参考应用。
2024版建议方案内容如下:肉羊和奶山羊饲粮精粗比4∶6、饲喂水平1.3倍维持需要,绒毛羊精粗比3∶7、饲喂水平1∶1~1∶2倍维持需要,动物每天至少2次饲喂,自由饮水(有条件时,饲粮、饲喂水平和饲喂频率与动物的实际饲养一致);尼龙袋孔径40~60 μm,大小6 cm×10 cm;新尼龙袋使用前无需用水或在瘤胃内浸泡;尼龙袋使用次数越少越好;粗饲料装袋量2.5 g左右,精饲料装袋量3.0 g左右;瘘管羊4只以上;于晨饲前同时投放于瘤胃腹囊(根据羊的大小,固定尼龙袋的塑料软管15~25 cm);时间点5个以上(精饲料可包含2、16、24、36、48 h,粗饲料可包含4、8、16、48、72 h);最好采用洗衣机清洗;粗饲料必须对微生物污染进行校正;暂时需要实测外流速率,当外流速率结果足够多时,可以参考。
另外,牛用原位尼龙袋技术和羊的差异主要是在尼龙袋大小或饲料装袋量,且在牛上未见原位尼龙袋技术的优化研究工作。因此,牛可以参考肉羊的饲喂水平,或与实际饲养一致;尼龙袋大小为8 cm×12 cm,样品装袋量按照精饲料、粗饲料分别为25、20 mg/cm2左右计算。此外,因为牛的瘤胃瘘管较大,培养时间点7个最好。
4 小结
针对影响原位尼龙袋技术测定结果的因素,所开展的技术优化研究结果均已经吸收到新版建议方案,建议加快制定原位尼龙袋技术相关技术规程或标准。