莱克多巴胺(ractopamine,RAC)是一种β-肾上腺素受体激动剂,主要用于治疗肺部疾病和充血性心力衰竭。研究表明,β-受体激动剂可影响营养物质在动物体内的流向和重新分配,有效促进肌肉组织生长,降低胴体脂肪含量,提高瘦肉率和增加瘦肉产量[1-2]。在畜牧业中,RAC被用作生长促进剂。然而,消费者食用了含有β-受体激动剂残留的动物组织后可能会引起头痛、心动过速和肌肉震颤等中毒症状[3-4]。因此,RAC已被欧盟、中国等许多国家禁止添加到动物饲料中,其相关的检测方法和技术引起高度重视。
RAC的检测方法可分为常规检测方法和快速检测方法。其中,常规方法包括气相色谱-质谱(GC-MS)法[5]、高效液相色谱(HPLC)法[6]、液相色谱-串联质谱(HPLC-MS)法[7]和酶联免疫吸附试验(ELISA)法[8]等。这些方法灵敏度高、准确性高,但存在操作相对复杂、耗时长、所需仪器价格昂贵及体积较大等问题,不适合现场检测和大规模筛选。在此基础上,研究工作者开发了一系列快速检测方法。例如,横向流动免疫分析法[9-10]、比色传感器[11-12]和电化学生物传感器[13]等已用于快速检测RAC。虽然这些方法相对快速和简便,但大多数方法前期仍然需要复杂的标记过程或者需要昂贵的抗体作为识别和捕获分子,因此开发简便、快速、免标记、低成本的RAC快速检测方法仍然是研究的热点。
金属有机框架材料(metal-organic frameworks,MOFs)是由金属离子或金属离子簇与有机配体自组装形成的一种多孔材料,在气体储存、分离和催化等多个领域有重要应用[14]。近年来,由于其独特的光电特性,MOFs被认为是构建检测/传感平台的理想材料。其中,由于镧系金属有机框架材料具有Stokes位移大、荧光寿命长以及发射光谱窄等优异的光学性能,其在荧光传感器领域引起广泛关注[15]。鲁聪等[16]以3,4’,5-联苯三羧酸和六水合硝酸铽为反应原料构筑了具有多孔结构的MOFs,实现了对三价铬离子(Cr3+)的荧光检测。张亚如等[17]使用三羧酸柔性配体为有机配体,铕离子(Eu3+)为金属节点,合成了同时具有高稳定性和双发射特性的柔性镧系金属有机框架材料,并采用比例荧光法检测了样品中的三价铁离子(Fe3+)。钱文浩等[14]指出,MOFs一方面通过调整孔道的大小来实现选择性,另一方面具有巨大的可调节性和功能化潜力,有利于特定物质的检测,应用MOFs可以检测多种离子、挥发性有机物和气体、生物毒素、抗生素以及生物大分子等。
本研究选择三联苯三羧酸作为配体,铽离子(Tb3+)为中心离子,合成了基于铽的镧系金属有机框架材料(lanthanide series metal-organic framework based on terbium,Tb-MOF),同时发现RAC能够诱导Tb-MOF发生荧光猝灭。基于此,本研究旨在探究Tb-MOF在RAC荧光检测方面的应用,为饲料、动物血液及尿液等样品中RAC的快速检测提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 主要试剂
试验用班布特罗(BAM)、溴布特罗(BRO)、西布特罗(CIM)、克仑特罗(CLE)、克伦丙罗(CLO)、非诺特罗(FEN)、马布特罗(MAB)、异丙肾上腺素(ISO)、RAC、[1,1':3',1″-三联苯]-4,4″,5'-三羧酸(H3L1)、2-氟苯甲酸、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、六水合硝酸铽、乙腈、甲醇,来自Sigma-Aldrich公司。试验用水为超纯水(实验室自制)。
猪尿样为不含β-受体激动剂的空白尿样,于本实验室养殖基地采集。
1.1.2 主要仪器
Nicolet Magna-IR 760型红外光谱仪,美国尼高力仪器公司;Rigaku Mini 600型粉末X射线衍射仪,日本Riguka公司;LAMBDA 950型紫外分光光度计,美国珀金埃尔默公司;Supernova单晶衍射仪,美国安捷伦公司;NETZSCH STA 449C型热重分析仪,德国耐驰机械公司;Synergy 4型多功能酶标仪,美国BioTek公司;Biofiige22R型高速离心机,德国Heraeus公司;KQ-500DE型超声仪,中国昆山市超声仪器有限公司;Milli-Q纯化系统超纯水仪,美国Millipore公司。
1.2 试验方法
1.2.1 Tb-MOF的制备
将30 mg六水合硝酸铽、10 mg H3L1、280 mg 2-氟苯甲酸分散于3 mL DMF和1 mL水的混合溶液中,在120 ℃下反应48 h,自然冷却至室温后离心收集沉淀,并用DMF和超纯水进行洗涤,干燥后得到的无色结晶即为Tb-MOF。化学式为:[DMA+]2[Tb9(μ3-OH)8(μ2-OH)3(H2O)3(C21H11O6)6]·11DMF·23H2O。元素分析为:碳元素(C),38.10%(38.13%);氮元素(N),3.74%(3.55%);氢元素(H),3.91%(4.28%)(括号外为实际值,括号内为理论值)。
1.2.2 RAC的荧光检测
分别将3和15 mg合成的Tb-MOF研磨后分散在10 mL乙腈中,超声处理20 min,制成0.3和1.5 mg/mL的标准分散液。将所有的β-受体激动剂标准品(包括BAM、BRO、CIM、CLE、CLO、FEN、MAB、ISO和RAC)溶解于适量甲醇中,用超纯水定容制备成0.15 mmol/L的标准溶液。
在条件优化试验中,首先分别取1.5 mg/mL Tb-MOF分散液3、6、12、15和18 μL,稀释至60 μL,分别加入RAC标准溶液,使反应体系中含有浓度为0.05~0.30 mg/mL的Tb-MOF以及10 μmol/L RAC,20 min后测量荧光发射光谱,通过荧光猝灭效率[Tb-MOF的初始发射峰强度(I0)与RAC存在下Tb-MOF的发射峰强度(I)之间的比值(I0/I)]确定Tb-MOF的反应浓度。然后,使反应体系中含有最优浓度的Tb-MOF及10 μmol/L RAC,在不同反应时间下测量荧光发射光谱,以确定最佳反应时间。
为了评估Tb-MOF对RAC的选择性,取30 μL不同种类的β-受体激动剂标准溶液,分别加入60 μL 0.3 mg/mL Tb-MOF标准分散液中,涡旋混匀10 s,室温静置30 min后,测量Tb-MOF的发射光谱[激发波长(λex)=290 nm]。
在RAC定量检测试验中,用超纯水将RAC标准溶液稀释成一系列浓度的溶液,分别含有0.9、3.0、6.0、10.5、18.0、30.0、45.0、60.0、75.0、90.0、105.0、120.0、135.0、150.0和195.0 μmol/L RAC。分别取上述溶液30 μL加入60 μL 0.3 mg/mL Tb-MOF标准分散液中,涡旋混匀10 s,室温静置30 min后,分别采集发射光谱强度。以RAC浓度的对数为横坐标,以加入RAC后Tb-MOF在550 nm处的荧光强度(I550)为纵坐标绘制标准曲线。检出限(LOD)通过3σ/K计算得到(σ为6次空白样品测量的标准差,K为标准曲线的斜率)。
在实际样品检测中,向原始猪尿样中加入3种浓度(3、15和30 μmol/L)的RAC标准品,稀释5倍后进行检测,以检测回收率来评估方法的准确性,以3个平行样品检测结果的相对标准偏差(RSD)评估方法的精密性。
2 结果与分析
2.1 Tb-MOF表征
2.1.1 红外分析
利用Nicolet Magna-IR 760型红外光谱仪,采用溴化钾(KBr)压片法在400~4 000 cm-1范围内对Tb-MOF和H3L1配体的红外光谱进行分析,结果如图1所示。H3L1配体的特征性羰基伸缩振动位于1 720 cm-1处,在形成Tb-MOF晶体后,羰基的吸收峰发生了红移,移动到1 580 cm-1处,说明Tb与H3L1中的羧酸进行了配位。
2.1.2 晶体结构分析
在Rigaku Mini 600 X射线衍射仪上用Cu-Kα射线(λ = 1.540 6 Å)采集了配合物样品的衍射数据,如表1所示。对晶体学数据进行分析可知,Tb-MOF结晶为六方晶系,P63/mmc空间群,相邻的9个Tb3+离子由8个μ3-OH和3个μ2-OH基团连接形成一个九核单元,再由18个配体连接形成一个18连接的三维结构。Tb-MOF具有一维通道,沿c轴的直径约为1.1 nm,空隙率约为59.1%。利用氮气吸附法(77 K)推算出Tb-MOF的表观BET(Brunauer-Emmett-Teller)比表面积、Langmuir比表面积和孔体积分别为760 m3/g、1 100 m3/g 和0.39 cm3/g。采用密度泛函理论(DFT)模型计算得到Tb-MOF在1.2 nm左右呈现出较高的孔径分布,这与孔道的内部结构性质非常吻合。Tb-MOF的高度稳定性和开放孔径使其对RAC具有很大的富集和检测潜力。
表1 Tb-MOF的晶体结构分析Table 1 Crystal structure analysis of Tb-MOF |
| 项目Items | 参数Parameter | 项目Items | 参数Parameter | |
|---|---|---|---|---|
| 分子式 Empirical formula | C42H22Tb3O16.67 | 单位晶胞中所含分子个数 Unit number of molecules contained in a crystal cell (Z) | 6 | |
| 相对分子质量 Relative molecular mass | 1 270.02 | 晶体密度计算值 Calculated crystal density (Dc)/(g/cm3) | 1.228 | |
| 晶系 Crystal system | 六方 | 吸收系数 Absorption coefficient (μ)/mm-1 | 15.308 | |
| 空间群 Space group | P63/mmc | 晶胞中的电子数目 Number of electrons in a crystal cell [F(000)] | 3 614 | |
| 晶胞棱边长a Crystal cell edge length a/nm | 2.257 68(3) | 数据收集的θ范围 θ range for data collection/° | 3.786~73.723 | |
| 晶胞棱边长b Crystal cell edge length b/nm | 2.257 68(3) | 基于F2的拟合优度值 Goodness-of-fit on F2 | 1.078 | |
| 晶胞棱边长c Crystal cell edge length c/nm | 2.334 91(3) | 权重一致性因子[I>2σ(I)] R1,w(R2) [I>2σ(I)] | 0.035 5/0.092 6 | |
| 晶胞体积 Crystal cell volume/nm3 | 10.306 8(3) | 权重一致性因子[所有数据] R1,w(R2) [all data] | 0.042 1/0.096 2 |
2.1.3 热重分析
2.2 Tb-MOF的发光性质
Tb-MOF的固态荧光光谱于室温下测试完成,结果如图3所示。当激发波长为290 nm时,Tb-MOF的荧光发射峰分别位于488、550、582和623 nm,与Tb3+特征荧光光谱保持一致,分别为5D4→7F6、5D4→7F5、5D4→7F4和5D4→7F3跃迁。
将RAC逐渐加入到Tb-MOF分散液时,Tb3+的特征发射峰逐渐减弱,此时用紫外灯照射Tb-MOF可用肉眼观察到绿色荧光的猝灭,利用这一性质可以定量分析溶液中的RAC含量。
2.3 Tb-MOF荧光法检测RAC
2.3.1 试验条件优化
影响Tb-MOF与RAC反应的试验条件有Tb-MOF标准分散液浓度及反应时间。在评价Tb-MOF对RAC的检测能力之前,在室温下对以上条件进行优化。首先,向不同浓度的Tb-MOF分散液中加入一定量的RAC,20 min后测量荧光发射光谱。如图4-a所示,当Tb-MOF标准分散液的浓度高于0.2 mg/mL时,Tb-MOF的初始发射峰强度较大,使得初始发射峰强度与RAC存在下Tb-MOF的发射峰强度之间的比值减小,因此后续试验均控制Tb-MOF的浓度为0.2 mg/mL。利用0.2 mg/mL的Tb-MOF标准分散液优化反应时间,发现荧光猝灭效率随着反应时间的延长而提高,但在反应30 min后荧光强度变化趋缓,需要较长的时间来换取较高的猝灭效率(图4-b)。考虑时间效率和猝灭效率,确定Tb-MOF标准分散液浓度为0.2 mg/mL、反应30 min作为最佳反应条件。
图4 Tb-MOF与RAC反应条件优化I0/I表示荧光猝灭效率,即Tb-MOF初始发射峰强度(I0)与RAC存在下Tb-MOF的发射峰强度(I)之间的比值。图8同。 a:Tb-MOF浓度对I0/I的影响 effects of Tb-MOF concentration on I0/I;b:反应时间对I0/I的影响 effects of reaction time on I0/I。 Fig.4 Optimization of reaction conditions between Tb-MOF and RAC I0/I mean fluorescence quenching efficiency, which was the ratio of initial peak emission intensity (I0) of Tb-MOF and peak emission intensity (I) of Tb-MOF in presence of RAC. The same as Fig.8. |
2.3.2 RAC定量分析
2.3.3 选择性和干扰分析
为了评估方法的选择性,本试验研究了不同种类β-受体激动剂对Tb-MOF荧光猝灭效率的影响。将9种β-激动剂分别加入Tb-MOF标准分散液中,如图6所示,RAC引起了Tb-MOF显著的荧光猝灭,BAM、BRO、CLO、FEN、MAB和ISO的荧光几乎没有发生变化,CLE和CIM引起了微弱的荧光猝灭,相比于RAC引起的猝灭可忽略不计。通过计算荧光猝灭效率,可得RAC的猝灭效率为70%,远高于其他分析物。以上研究结果表明,Tb-MOF对溶液中的RAC具有良好的选择性。
图6 RAC选择性和干扰分析I/I0表示向Tb-MOF标准分散液中加入50 μmol/L不同β-激动剂与未加入β-激动剂情况下550 nm处最高峰荧光强度比值。 Control:对照;BAM:班布特罗 bambuterol;BRO:溴布特罗 brombuterol;CIM:西布特罗 cimbuterol;CLE:克仑特罗 clenbuterol;CLO:克伦丙罗 clenproperol;FEN:非诺特罗 fenoterol;MAB:马布特罗 mabuterol;ISO:异丙肾上腺素 isoprenaline;RAC:莱克多巴胺 ractopamine。 Fig.6 Selectivity and interference analysis for RAC I/I0 mean ratio of ratio of peak fluorescence intensity at 550 nm when 50 μmol/L different β-agonists were added to Tb-MOF standard suspension and when no β-agonist was added. |
此外,本试验制备了含有多种β-受体激动剂的混合溶液以研究Tb-MOF的抗干扰能力。将不含RAC的β-受体激动剂混合溶液加入Tb-MOF分散液后,仅对Tb-MOF的发光光谱有轻微影响;而加入含有RAC的β-受体激动剂混合溶液后,发光光谱特征峰显著降低。因此,其他β-激动剂对RAC的干扰可以忽略不计。
2.3.4 实际样品分析
由于在养殖业中存在非法使用β-受体激动剂的现象,因此动物尿样中可能存在RAC残留。本研究通过RAC在猪尿样中的加标回收率来评价该方法的实用性。由表2可知,RAC的加标回收率为87.3%~108.7%,RSD<10.4%,表明所建立的方法具有较好的准确性和精密度,在实际样品检测中具有较好的实用性。
表2 RAC在猪尿样品中的加标回收率Table 2 Adding standard recovery rates of RAC in pig urine samples (n=3) |
| 项目 Item | 添加值 Adding value/(μmol/L) | 检出值 Measured value/(μmol/L) | 回收率 Recovery rate/% | 相对标准偏差 RSD/% |
|---|---|---|---|---|
莱克多巴胺RAC | 3 | 2.8 | 93.3 | 8.9 |
| 15 | 13.1 | 87.3 | 5.3 | |
| 30 | 32.6 | 108.7 | 10.4 |
2.3.5 可重复使用性
3 讨论
3.1 荧光猝灭效率研究
荧光猝灭效率可以用Stern-Volmer(S-V)方程来量化,S-V方程为:
I0/I=1+KSV[M]。
式中:I0为Tb-MOF的初始发射峰强度,I为RAC存在下Tb-MOF的发射峰强度,[M]为分析物(猝灭剂)的摩尔浓度,KSV为猝灭常数(mol/L-1)。
如图8所示,在低浓度下,S-V曲线呈近似线性相关系,可以用I0/I=1.042+0.114 9[M](R2=0.985 1)来表示。在0.3~3.5 μmol/L范围内,RAC的Ksv值为1.1×105 mol/L-1,表明对Tb-MOF具有较高的淬灭效率。随着浓度的升高,曲线逐渐从线性偏离到非线性,这可能是由于自吸收或能量传递造成的。
3.2 Tb-MOF与RAC之间的荧光识别机理
引起镧系金属有机框架材料荧光猝灭的机理主要有4种[19],分别是:1)光电子转移(photoelectron transfer,PET)。一般认为当MOFs的最低未占据分子轨道(lowest unoccupied molecular orbital,LUMO)能级高于目标分析物的LUMO能级时,光电子就有可能从激发态MOFs转移到基态目标分析物,进而引起荧光猝灭,实现目标分析物的选择性检测[20]。2)共振能量转移(resonance energy transfer,RET)。处于激发态的MOFs将能量传递给目标分析物,导致供体的荧光猝灭。MOFs和目标分析物近距离(10 nm以内)靠近且MOFs的荧光发射光谱与目标分析物的吸收光谱有重叠时才可能发生RET现象[21]。3)竞争吸收(competitive absolution,CA)。当MOFs的激发光谱与目标分析物的紫外-可见吸收光谱存在重叠时,MOFs与目标分析物对激发光的能量产生竞争吸收,减弱了MOFs的光吸收效率,进而引发荧光猝灭[22]。4)结构转变(structure transition,ST)。目标分析物进入MOFs孔道后与骨架发生主客体作用,诱导金属离子配位环境甚至结构发生变化,导致MOFs发光的显著变化[23]。
为了更好地理解Tb-MOF对RAC反应的高选择性,本文对检测机理进行了研究。首先,利用密度泛函理论(density functional theory,DFT)计算了9种β-受体激动剂的LUMO能级,发现所有β-受体激动剂的LUMO能级均非常接近,因此排除了PET引起荧光猝灭的可能。然后,对Tb-MOF的荧光发射光谱、激发光谱和9种β-受体激动剂的紫外-可见吸收光谱进行比较,发现Tb-MOF的发射光谱与所有β-受体激动剂的吸收光谱之间的重叠可以忽略不计,且Tb-MOF的激发光谱与所有β-受体激动剂的吸收光谱之间均有重叠,故RET与CA机理不能解释仅有RAC高效引起Tb-MOF荧光猝灭的现象。
考虑β-受体激动剂分子结构的细微差异,结合文献报道[24],推测Tb-MOF与RAC之间的荧光识别机理可能是ST机理。Tb-MOF的孔道对RAC的识别具有筛分作用,RAC分子与Tb-MOF框架结构中的有机配体之间可能存在多重氢键作用,使得Tb-MOF对RAC具有显著的选择性。
3.3 RAC定量检测方法比较
RAC属于苯乙醇胺类化合物,分子结构中含有碱性酚、对羟甲基酚和仲胺3个活性基团,可以和细胞膜上的β2受体结合,提高动物皮下脂肪中环磷酸腺苷浓度,抑制脂肪合成,促进脂肪分解,在畜牧生产上被用作第二代“瘦肉精”[25]。因其代谢较快,RAC检测相对困难,创新并完善RAC的快速检测方法以实现短时间内的大量初步筛查具有重要的现实意义。
目前,国家标准制定的RAC检测方法有4种,分别是HPLC-MS法、GS-MS法、HPLC法和ELISA法,检出限的范围为0.1~2.0 μg/kg。其中,HPLC-MS法、GS-MS法和HPLC法等传统检测方法具有检测精确度高、选择性好、灵敏度高、假阳性率低以及重现性好等优点,但也存在样品前处理周期长、操作复杂、耗时长、费用高、对仪器设备要求较高以及需要专业人士操作等问题,因此这些方法不适用于现场监督检查和大批量样品的快速筛查。与传统方法相比,ELISA法快速、简便、灵敏,但制备检测试剂盒需要RAC半抗原以及抗体,因生物大分子性质不稳定,试验结果的重现性较差,易出现假阴性或假阳性[26]。为了克服国标方法的不足,科研工作者致力于开发新的检测方法。其中,基于纳米材料的光学传感方法是热点方向之一。例如,Hu等[27]合成了一种氨基苯磺酸修饰的金-银纳米颗粒(Au-Ag nanoparticles,Au-AgNPs),当含有Au-AgNPs的溶液中存在RAC时,RAC与氨基苯磺酸基团之间的相互作用诱导Au-AgNPs快速聚集,进而引起溶液颜色的变化。通过测定Au-AgNPs的吸光度比(A600/A435)可以定量检测RAC,检出限为1.5 ng/mL。
本试验开发的基于Tb-MOF荧光性质的RAC检测方法与现有方法相比,具有以下2点优势:1)操作简便、快速。进行检测时只需将优化浓度下的Tb-MOF分散溶液与待测样品混合,不需要加热设备,常温下即可反应。不需要专业技术人员操作,肉眼即可分辨溶液颜色的变化。反应时间只需要30 min,适合于批量检测。2)检测成本低。与抗体等生物大分子相比,Tb-MOF制备过程简单,仅需化学试剂,价格相对低廉。同时,Tb-MOF具有良好的稳定性和可重复使用性,使用过的Tb-MOF经离心、DMF洗涤、分散和乙腈活化处理,荧光强度基本不变,因此可以循环利用,大大降低了检测成本,适合大部分企业实际使用需求。
本试验中Tb-MOF对RAC的检出限为6 nmol/L,折合成质量浓度约为2 μg/L,与国标方法和其他检测方法在同一个数量级上,实际样品中RAC的回收率和RSD也与国标方法相当。本方法的不足之处在于当RAC浓度较低时,工作曲线的线性关系不佳,推测造成此现象的主要原因是在条件优化试验中,选用的RAC浓度较高,因此本文中提到的试验条件适用于高浓度RAC的定量检测。下一步将在不同RAC浓度条件下,进一步优化试验条件,并尝试寻找与RAC具有协同作用的试剂以提高Tb-MOF的荧光猝灭效率,进而提高检测灵敏度。
4 结论
本研究以三羧酸类化合物为有机配体,Tb3+为金属节点,构筑了发射强绿色荧光的Tb-MOF。由于RAC能够引起Tb-MOF荧光的高效猝灭,Tb-MOF可用于RAC的定量检测,线性浓度为0.3~30.0 μmol/L,检出限为6 nmol/L。同时,Tb-MOF对RAC的检测表现出良好的选择性、抗干扰能力和可重复使用性,在实际样品的检测中获得了较高的回收率,为简单、快速、便携检测RAC提供了新的途径。