Chinese Journal of Animal Nutrition >

2024 , Vol. 36 >Issue 12: 7725 - 7741

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2024.659

RESEARCH PAPER

Effects of Different Combinations of Dietary Acidifiers on Growth Performance, Immune Function, Intestinal Morphology and Cecal Microbiota of Yellow-Feathered Broilers

  • YE Jinling ,
  • WANG Yibing ,
  • GOU Zhongyong ,
  • LIN Xiajing ,
  • FAN Qiuli ,
  • LUO Qili ,
  • CHEN Limin ,
  • JIANG Shouqun , *
Expand
  • Guangdong Provincial Key Laboratory of Animal Breeding and Nutrition, Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science in South China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, State Key Laboratory of Swine and Poultry Breeding Industry, Institute of Animal Science, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China
*professor, E-mail:

Received date: 2024-05-30

  Online published: 2024-12-12

Fold

Abstract

This experiment was conducted to study the effects of different combinations of dietary acidifiers on growth performance, immune function, intestinal morphology and cecal microbiota of yellow-feathered broilers. A total of 640 one-day-old healthy male fast-growing yellow-feathered broilers with the same body weight were randomly divided into 4 groups with 8 replicates per group and 20 chickens per replicate. Broilers in the control group were fed a basal diet, those in the antibiotic group were fed the basal diet+100 mg/kg enramycin, those in γ-aminobutyric acid+citric acid group were fed the basal diet+100 mg/kg γ-aminobutyric acid+200 mg/kg citric acid, and those in plant essential oil+citric acid group were fed the basal diet +200 mg/kg plant essential oil+200 mg/kg citric acid. The experiment lasted for 50 days and was divided into three stages as 1 to 21, 22 to 42 and 43 to 50 days of age. The results showed as follows: 1) compared with the control group, the body weight of broilers in γ-aminobutyric acid+citric acid group and plant essential oil+citric acid group at 42 and 50 days of age was significantly increased (P<0.05), and the average daily gain from 22 to 42 days of age was significantly increased (P<0.05). Compared with the antibiotic group, the average daily gain in γ-aminobutyric acid+citric acid group and plant essential oil+citric acid group from 1 to 50 days of age was significantly increased (P<0.05), and the ratio of feed to gain was significantly decreased (P<0.05). 2) Compared with the control group and the antibiotic group, the contents of total protein, interleukin-10, immunoglobulin G and immunoglobulin M in plasma of broilers in γ-aminobutyric acid+citric acid group and plant essential oil+citric acid group were significantly increased (P<0.05), and the plasma uric acid content was significantly decreased (P<0.05). 3) Compared with the control group and the antibiotic group, the villus height in ileum and the ratio villus height to crypt depth in jejunum and ileum of broilers in γ-aminobutyric acid+citric acid group and plant essential oil+citric acid group were significantly increased (P<0.05), the crypt depth in jejunum and ileum was significantly decreased (P<0.05), the number of goblet cells in jejunum and ileum was significantly increased (P<0.05), and the mRNA relative expression levels of claudin-1, occludin, zonula occludens-1 (ZO-1), junction adhesion molecule 2 (JAM2) in jejunum and ZO-1 in ileum were significantly increased (P<0.05); the secreted immunoglobulin A content in jejunal mucosa, and the mRNA relative expression levels of mucin 2 (MUC2) in jejunum as well as claudin-1 and MUC2 in ileum in plant essential oil+citric acid group were significantly increased (P<0.05). 4) Compared with the control group, the relative abundances of Helicobacter, Enterococcus and Escherichia-Shigella in cecum of broilers in the antibiotic group were increased; the Methanobrevibacter relative abundance in cecum in γ-aminobutyric acid+citrate group was increased; the relative abundances of Synergistes and Mucispirillum in cecum in plant essential oil+citric acid group was decreased, and the function of cecum microbiota was mainly enriched in human diseases and organismal systems. In conclusion, the combination of plant essential oil and citric acid can improve the growth performance, enhance the immune function and intestinal mucosal barrier function, improve intestinal morphology, reduce the number of harmful bacteria in cecum, and improve intestine health of yellow-feathered broilers, and the effect is better than that of compound acidifiers.

Key words： yellow-feathered broilers; acidifiers; plant essential oil; growth performance; immune function; intestine health

Cite this article

YE Jinling , WANG Yibing , GOU Zhongyong , LIN Xiajing , FAN Qiuli , LUO Qili , CHEN Limin , JIANG Shouqun . Effects of Different Combinations of Dietary Acidifiers on Growth Performance, Immune Function, Intestinal Morphology and Cecal Microbiota of Yellow-Feathered Broilers[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2024 , 36(12) : 7725 -7741 . DOI: 10.12418/CJAN2024.659

我国饲料禁抗已过4年,养殖禁抗也提上日程,酸化剂和植物精油的抑菌、抗病毒及促生长等作用已得到广泛认可。柠檬酸作为天然、无毒的有机酸化剂,其可以直接穿透细菌的细胞壁,破坏细菌的生理结构;可以提高生长性能,对改善肉仔鸡的肠道健康和微生态环境具有重要作用[1⇓-3]。γ-氨基丁酸是一种中枢神经系统抑制性神经递质[4],对于提高动物的采食量、生长性能、抗氧化能力和抗应激能力具有良好的效果[5-6]。植物精油作为新一代绿色安全型饲料添加剂的代表,在畜禽生产中具有巨大的应用潜力,并有研究指出复合植物精油的功效优于单一种类[7]。大量研究结果显示,酸化剂和植物精油组合使用能提高白羽肉鸡[8-9]和麻黄肉鸡[10-11]生长性能,改善肠道健康[12]和肉品质[11]。但在实际生产中,由于易挥发、刺激性等问题限制了两者在家禽饲养上的广泛应用。此外,酸化剂存在功能单一、添加剂量大、适口性差以及对动物胃肠道刺激性强等缺点。复合型酸化剂的作用效果虽优于单一酸化剂的作用效果[6,13-14],但仍存在稳定性不高,易损失营养价值的缺点,同时也会对环境产生污染。因此,人们尝试根据实际生产的功能需求,将酸化剂与其他种类的饲料添加剂组合,这不仅能够改善酸化剂存在的问题,而且能使各成分相互间起到很好的协同增效作用,从而极大地提高产品的作用功能。基于此,本研究首次尝试将柠檬酸与γ-氨基丁酸以及柠檬酸与复合植物精油(主要成分为百里香酚和香芹酚)进行联合添加,并与抗生素相比,研究不同组合的酸化剂对快速型黄羽肉鸡生长性能、血浆生化指标、免疫功能、肠道形态和肠道菌群的影响,为两者在家禽生产中的联合应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1日龄快速型黄羽肉公鸡,购自佛山市高明区新广农牧有限公司。8%恩拉霉素产品购自河北某药业集团有限公司。柠檬酸产品为白色晶体,有效成分为一水柠檬酸,纯度99.9%,购自林州某生物肽有限公司;γ-氨基丁酸产品购自山东某生物科技有限公司,纯度99.6%;植物精油产品为固体颗粒,主要成分为百里香酚和香芹酚,其含量均为25%,其他为载体,购自湖南某生物资源股份有限公司。

1.2 试验设计

本试验严格遵循广东省农业科学院动物科学研究所实验动物伦理委员会制定的规则(GAASISA-2024-007)执行。饲养试验在广东省农业科学院动物科学研究所动物营养研究试验场进行。选用640只1日龄健康、体重一致的快速型黄羽肉公鸡,随机分为4组,每组8个重复,每个重复20只鸡。对照组饲喂基础饲粮,抗生素组饲喂基础饲粮+100 mg/kg恩拉霉素,γ-氨基丁酸+柠檬酸组饲喂基础饲粮+100 mg/kg γ-氨基丁酸+200 mg/kg柠檬酸,植物精油+柠檬酸组饲喂基础饲粮+200 mg/kg植物精油+200 mg/kg柠檬酸。试验期50 d,分为1~21日龄、22~42日龄和43~50日龄3个阶段。

1.3 试验饲粮

试验采用玉米-小麦型基础饲粮,根据《中国饲料成分及营养价值表(2022年第33版)》和《黄羽肉鸡营养需要量》(NY/T 3645—2020)科学配制,各组饲粮营养水平保持一致,基础饲粮组成及营养水平见表1。抗生素、酸化剂和复合植物精油按照添加水平等重量替代预混料中的沸石粉。
表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) %

项目
Items		 1~21日龄
1 to 21 days of age		 22~42日龄
22 to 42 days of age		 43~50日龄
43 to 50 days of age
原料Ingredients
玉米Corn (7.6% CP) 19.20 21.00 22.00
豆粕Soybean meal (46.27% CP) 15.00 11.00 8.60
大豆油Soybean oil 2.40 3.30 3.50
小麦Wheat (10.02% CP) 38.00 41.50 45.00
花生仁饼Peanut meal (45.36% CP) 12.80 11.80 11.00
菜籽粕Rapeseed meal (36.89% CP) 7.50 6.50 5.50
L-赖氨酸盐酸盐L-Lys·HCl(79.2%) 0.51 0.50 0.36
DL-蛋氨酸DL-Met (99.0%) 0.29 0.28 0.23
石粉Limestone 1.04 1.08 1.05
磷酸氢钙CaHPO4 1.75 1.45 1.20
氯化钠NaCl 0.30 0.30 0.30
沸石粉Zeolite powder 0.21 0.29 0.26
预混料Premix1) 1.00 1.00 1.00
合计Total 100.00 100.00 100.00
营养水平Nutrient levels2)
氮校正表观代谢能AMEn/(MJ/kg) 11.92 12.34 12.55
粗蛋白质CP 21.50 19.50 18.00
赖氨酸Lys 1.29 1.15 0.96
蛋氨酸Met 0.52 0.48 0.40
蛋氨酸+胱氨酸Met+Cys 0.80 0.71 0.71
钙Ca 1.00 0.92 0.84
总磷TP 0.81 0.73 0.62
非植酸磷NPP 0.47 0.41 0.36

1)预混料为1~21日龄阶段每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of the diet for 1 to 21 days of age:VA 8 000 IU,VB1 2 mg,VB2 8 mg,烟酸 nicotinic acid 35 mg,VB6 3.5 mg,VB12 0.01 mg,VD3 1 000 IU,VE 20 IU,VK 0.5 mg,生物素 biotin 0.18 mg,泛酸钙 calcium pantothenate 10 mg,叶酸 folic acid 0.55 mg,胆碱 choline 1 300 mg,Fe 100 mg,Cu 8 mg,Mn 120 mg,Zn 100 mg,I 0.7 mg,Se 0.3 mg。预混料为22~42日龄阶段每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of the diet for 22 to 42 days of age:VA 6 000 IU,VB1 2 mg,VB2 5 mg,烟酸 nicotinic acid 30 mg,VB6 3 mg,VB12 0.01 mg,VD3 750 IU,VE 10 IU,VK 0.5 mg,生物素 biotin 0.15 mg,泛酸钙 calcium pantothenate 10 mg,叶酸 folic acid 0.55 mg,胆碱 choline 1 000 mg,Fe 80 mg,Cu 8 mg,Mn 100 mg,Zn 80 mg,I 0.7 mg,Se 0.3 mg。预混料为43~50日龄阶段每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of the diet for 43 to 50 days of age:VA 6 000 IU,VB1 1 mg,VB2 4 mg,烟酸 nicotinic acid 20 mg,VB6 0.6 mg,VB12 0.008 mg,VD3 500 IU,VE 25 IU,VK 1.7 mg,生物素 biotin 0.02 mg,泛酸钙 calcium pantothenate 8 mg,叶酸 folic acid 0.3 mg,胆碱 choline 750 mg,Fe 80 mg,Cu 7 mg,Mn 55 mg,Zn 75 mg,I 0.5 mg,Se 0.15 mg。

2)氮校正表观代谢能、氨基酸和非植酸磷为计算值,均是参照《中国饲料成分及营养价值表(2022年第33版)》各原料数值进行计算;粗蛋白质、钙和总磷为实测值,分别参照GB/T 6432—2018、GB/T 6436—2018和GB/T 6437—2018方法进行测定。AMEn, amino acids and NPP were calculated values, the calculation was made according to the values of each feed material in the Tables of Feed Composition and Nutritive Values in China (33rd edition, 2022); CP, Ca and TP were measured values, and methods in GB/T 6432—2018, GB/T 6436—2018 and GB/T 6437—2018 were used for determination, respectively.

1.4 饲养管理

饲养采用地面平养的养殖模式,地面铺放干燥稻壳,每个重复试验栏采用不锈钢框架和铁丝网分隔。试验鸡自由采食和饮水,各组饲养管理和环境条件均一致,按照黄羽肉鸡常规操作程序和免疫流程进行饲养和免疫。

1.5 样品采集与制备

试验结束(50日龄)当天20:00断料供水,次日08:00每重复随机挑选1只接近平均体重的试验鸡,翅静脉采集全血5 mL于抗凝管中,2 000×g离心10 min分离血浆,于-80 ℃保存备测血浆生化指标;试验鸡采血后屠宰,取空肠和回肠组织样,用载玻片刮取空肠和回肠黏膜各2份分别装于2 mL灭菌管中,常规制备组织匀浆液,置于-80 ℃保存备用,后续进行RNA提取,测定肠道黏膜屏障功能相关基因表达;同时取空肠和回肠中段1~2 cm肠段各1份,用生理盐水冲洗干净,置于4%多聚甲醛中保存过夜,用于制作石蜡包埋切片,并进行苏木精-伊红(HE)和过碘酸-雪夫(PAS)染色;取2条盲肠肠段,分别装入2个封口袋中,液氮速冻,置于-80 ℃保存,备测肠道菌群。

1.6 测定指标及方法

1.6.1 生长性能

每个饲养阶段开始和结束时,以重复为单位对试验鸡进行空腹称重,记录各阶段试验鸡的初重和末重,计算各组的平均日增重;统计各阶段耗料量,计算各组的平均日采食量,并计算料重比。试验期间,每天观察试验鸡健康状况,根据每个重复栏的死亡数目,统计存活率。

1.6.2 血浆生化指标及血浆和肠道免疫指标

血浆总蛋白(TP)、球蛋白(GLB)、白蛋白(ALB)、尿素氮(UN)和尿酸(UA)含量采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定,测定步骤和结果计算严格按照说明书进行。空肠和回肠黏膜样品10%匀浆液的制备以及总蛋白质含量的测定参考叶金玲等[15]的方法。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M(IgM)和分泌型免疫球蛋白A(sIgA)含量采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定,试剂盒购自广州步前生物科技有限公司,具体测定方法和结果计算严格按照说明书进行。以上指标均使用多功能酶标仪(SYNERGY H1,BioTek,美国)检测。

1.6.3 肠道形态

使用Pannoramic DESK/MIDI/250/1000全景切片扫描仪(3DHISTECH,匈牙利)将肠道组织HE染色切片进行扫描成像。然后使用CaseViewer 2.2软件(3DHISTECH,匈牙利)选取组织目的区域进行200倍成像,成像时让组织充满整个视野,并使用Image-Pro Plus 6.0软件(Media Cybemetics,美国)测量4张切片的5根最完整的绒毛,分别测量绒毛高度和隐窝深度,并计算绒隐比(绒毛高度/隐窝深度);同时,测量每张切片中5处绒毛上皮长度,并测量对应的杯状细胞数目,计算单位长度杯状细胞数目(杯状细胞数目/绒毛上皮长度)。

1.6.4 肠道黏膜屏障功能相关基因表达

空肠和回肠黏膜屏障功能相关基因表达测定方法参考叶金玲等[15]。从GenBank中获得所测基因的序列,取保守区域设计引物,并选用管家基因β-肌动蛋白(β-actin)作为内参基因。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)所需引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列见表2,采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA相对表达量。
表2 qRT-PCR引物序列

Table 2 Primer sequences for qRT-PCR

基因
Genes		 引物序列
Primer sequences (5'—3')		 退火温度
Annealing temperature/℃
连接黏附分子2 JAM2 F:AGACAGGAACAGGCAGTGCT
R:TCCAATCCCATTTGAGGCTA		 60
黏蛋白2 MUC2 F:CATTCAACGAGGAGAGCTGC
R:TTCCTTGCAGCAGGAACAAC		 56
闭锁小带蛋白-1 ZO-1 F:CCAAAGACAGCAGGAGGAGA
R:TGGCTAGTTTCTCTCGTGCA		 56
封闭蛋白-1 Claudin-1 F:GAGGATGACCAGGTCAAGAAG
R:TGCCCAGCCAATGAAGAG		 56
闭合蛋白Occludin F:TCATCCTGCTCTGCCTCATCT
R:CATCCGCCACGTTCTTCAC		 56
β-肌动蛋白β-actin F:GAGAAATTGTGCGTGACATCA
R:CCTGAACCTCTCATTGCCA		 60

1.6.5 盲肠菌群

采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法对盲肠样品的基因组DNA进行提取,使用琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和浓度;随后取适量DNA于离心管中,并用无菌水稀释至1 ng/μL。以稀释后的基因组DNA为模板,根据V3~V4扩增区域选择使用带Barcode的特异性引物(上游引物341F,5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3';下游引物为806R,5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3')、New England Biolabs公司的Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix和高效高保真酶进行PCR。PCR产物采用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测,并根据PCR产物浓度进行等量混样,充分混匀后使用2%琼脂糖凝胶电泳再次进行检测,使用QIAGEN公司提供的胶回收试剂盒对目的条带进行回收。使用NEBNext® UltraTM IIDNA Library Prep Kit建库试剂盒进行文库构建,将构建好的文库进行Qubit和qPCR定量,然后使用NovaSeq6000系统进行上机测序。随后对得到的有效数据进行物种注释以及丰度分析,从而揭示样本物种构成;而后进一步进行α和β多样性分析,得到样本内物种丰富度和均匀度信息,并探究不同样本或组别间群落结构的差异。

1.7 数据统计分析

试验数据采用SPSS 21.0软件中的one-way ANOVA过程进行单因素方差分析,当处理效应显著时进行Duncan氏法多重比较,P<0.05为差异显著,试验结果数据均用“平均值±标准误(mean±SE)”形式表示。

2 结果与分析

2.1 饲粮添加不同组合酸化剂对1~50日龄黄羽肉鸡生长性能的影响

由表3可知,饲粮添加不同组合酸化剂对黄羽肉鸡1~21日龄生长性能无显著影响(P>0.05)。与对照组相比,γ-氨基丁酸+柠檬酸组和植物精油+柠檬酸组42和50日龄体重显著提高(P<0.05),22~42日龄平均日增重显著提高(P<0.05)。与抗生素组相比,γ-氨基丁酸+柠檬酸组和植物精油+柠檬酸组1~50日龄平均日增重显著提高(P<0.05),料重比显著降低(P<0.05)。
表3 饲粮添加不同组合酸化剂对1~50日龄黄羽肉鸡生长性能的影响

Table 3 Effects of different combinations of dietary acidifiers on growth performance of yellow-feathered broilers from 1 to 50 days of age

项目
Items		 对照组
Control group		 抗生素组
Antibiotic group		 γ-氨基丁酸+
柠檬酸组
γ-aminobutyric
acid+citric
acid group		 植物精油+
柠檬酸组
Plant essential
oil+citric acid
group		 P值
P-value
1~21日龄1 to 21 days of age
1日龄体重BW at 1 day of age/g 36.65±0.01 36.63±0.01 36.63±0.01 36.64±0.01 0.278
21日龄体重BW at 21 days of age/g 454.24±8.51 451.66±12.62 453.36±15.74 462.08±12.25 0.938
平均日采食量ADFI/(g/d) 30.98±0.47 30.21±0.87 31.76±1.83 30.88±0.77 0.807
平均日增重ADG/(g/d) 19.89±0.41 19.76±0.60 19.84±0.75 20.26±0.58 0.938
料重比F/G 1.56±0.01 1.53±0.02 1.60±0.06 1.53±0.01 0.395
存活率Survival rate/% 99.38±0.63 100.00±0.00 99.38±0.63 98.75±0.82 0.550
22~42日龄22 to 42 days of age
42日龄体重BW at 42 days of age/g 1 182.74±18.62b 1 195.49±22.16b 1 253.65±10.82a 1 251.44±14.36a 0.009
平均日采食量ADFI/(g/d) 90.58±1.89 91.50±2.65 95.03±2.45 92.34±2.88 0.625
平均日增重ADG/(g/d) 34.69±0.87b 35.42±1.06ab 38.11±1.03a 37.59±0.71a 0.039
料重比F/G 2.62±0.08 2.60±0.09 2.52±0.12 2.46±0.09 0.635
存活率Survival rate/% 97.47±0.96 97.47±0.96 97.47±0.96 97.47±0.96 0.864
43~50日龄43 to 50 days of age
50日龄体重BW at 50 days of age/g 1 563.09±30.33b 1 557.21±33.34b 1 660.12±24.24a 1 668.51±24.73a 0.012
平均日采食量ADFI/(g/d) 115.17±3.48 116.65±3.02 118.29±3.60 118.37±1.89 0.879
平均日增重ADG/(g/d) 43.73±3.22 42.46±1.43 47.06±1.10 49.12±1.33 0.153
料重比F/G 2.53±0.12 2.69±0.05 2.56±0.06 2.45±0.06 0.208
存活率Survival rate/% 99.38±0.63 100.00±0.00 99.38±0.63 99.38±0.63 0.801
1~50日龄1 to 50 days of age
平均日采食量ADFI/(g/d) 69.98±1.19 70.34±1.40 72.59±1.49 71.58±1.15 0.490
平均日增重ADG/(g/d) 30.19±0.80bc 29.82±0.65c 31.83±0.48ab 32.00±0.47a 0.034
料重比F/G 2.32±0.03ab 2.36±0.04a 2.25±0.04b 2.24±0.03b 0.029
存活率Survival rate/% 96.88±1.32 96.88±1.32 96.88±1.32 96.25±1.83 0.987

同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05),相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

In the same row,values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 饲粮添加不同组合酸化剂对黄羽肉鸡血浆生化指标的影响

由表4可知,饲粮添加不同组合酸化剂对50日龄黄羽肉鸡部分血浆生化指标有显著影响(P<0.05)。与对照组和抗生素组相比,γ-氨基丁酸+柠檬酸组和植物精油+柠檬酸组血浆总蛋白含量显著提高(P<0.05),血浆尿酸含量显著降低(P<0.05)。
表4 饲粮添加不同组合酸化剂对黄羽肉鸡血浆生化指标的影响

Table 4 Effects of different combinations of dietary acidifiers on plasma biochemical indices of yellow-feathered broilers

项目
Items		 对照组
Control group		 抗生素组
Antibiotic group		 γ-氨基丁酸+
柠檬酸组
γ-aminobutyric
acid+citric acid
group		 植物精油+
柠檬酸组
Plant essential
oil+citric acid
group		 P值
P-value
总蛋白TP/(g/L) 30.52±0.33b 30.28±0.44b 35.67±1.93a 37.63±2.53a 0.005
球蛋白GLB/(g/L) 19.25±0.66 18.96±1.58 20.78±2.61 23.25±2.45 0.408
白蛋白ALB/(g/L) 11.28±0.69 11.23±1.24 15.09±1.44 14.87±1.68 0.062
尿素氮UN/(mmol/L) 7.44±0.39 7.40±0.38 7.03±0.27 6.79±0.26 0.518
尿酸UA/(μmol/L) 286.54±13.78a 321.81±16.48a 226.74±15.39b 224.91±16.38b <0.001

2.3 饲粮添加不同组合酸化剂对黄羽肉鸡血浆和肠道免疫指标的影响

由表5可知,饲粮添加不同组合酸化剂对50日龄黄羽肉鸡血浆、空肠黏膜和回肠黏膜部分免疫指标有显著影响(P<0.05)。与对照组和抗生素组相比,γ-氨基丁酸+柠檬酸组和植物精油+柠檬酸组血浆IL-10、IgG和IgM含量显著提高(P<0.05)。与对照组相比,γ-氨基丁酸+柠檬酸组和植物精油+柠檬酸组血浆和空肠黏膜IL-6含量显著降低(P<0.05),血浆IgG含量显著提高(P<0.05),空肠黏膜sIgA含量显著提高(P<0.05)。
表5 饲粮添加不同组合酸化剂对黄羽肉鸡血浆和肠道免疫指标的影响

Table 5 Effects of different combinations of dietary acidifiers on plasma and intestinal immune in dices of yellow-feathered broilers

项目
Items		 对照组
Control group		 抗生素组
Antibiotic group		 γ-氨基丁酸+
柠檬酸组
γ-aminobutyric
acid+citric acid
group		 植物精油+
柠檬酸组
Plant essential
oil+citric acid
group		 P值
P-value
血浆Plasma
白细胞介素-1β IL-1β/(ng/L) 84.96±3.20 84.19±2.73 83.76±2.40 81.12±2.19 0.753
白细胞介素-6 IL-6/(ng/L) 20.54±1.30a 17.97±0.85ab 16.53±0.52b 15.50±1.27b 0.013
白细胞介素-10 IL-10/(ng/L) 5.71±0.48b 5.57±0.48b 7.32±0.58a 7.37±0.40a 0.019
免疫球蛋白A IgA/(ng/mL) 3 643.81±130.75b 3 938.35±130.51ab 4 069.96±97.52a 4 232.89±68.28a 0.006
免疫球蛋白G IgG/(μg/mL) 59.69±4.30b 60.36±4.15b 73.44±3.85a 72.53±3.28a 0.022
免疫球蛋白M IgM/(ng/mL) 2 602.85±83.40b 2 902.38±137.07b 3 608.40±247.30a 3 654.76±238.71a 0.001
肿瘤坏死因子-α TNF-α/(ng/L) 41.14±2.36 44.43±3.53 44.38±2.90 44.75±2.43 0.785
空肠黏膜Jejunal mucosa
白细胞介素-1β IL-1β/(ng/g prot) 16.44±1.08 15.68±1.13 16.09±0.91 16.52±1.15 0.944
白细胞介素-6 IL-6/(ng/g prot) 9.80±0.55a 9.14±0.43ab 7.96±0.26b 8.28±0.59b 0.048
白细胞介素-10 IL-10/(ng/g prot) 3.94±0.36 4.44±0.38 5.00±0.27 5.29±0.40 0.064
分泌型免疫球蛋白A
sIgA/(ng/mg prot)		 130.39±6.36c 137.71±9.41bc 158.15±10.78ab 165.14±8.55a 0.030
肿瘤坏死因子-α
TNF-α/(ng/g prot)		 12.46±0.60 12.11±0.59 12.19±41 11.58±0.30 0.648
回肠黏膜Ileal mucosa
白细胞介素-1β IL-1β/(ng/g prot) 17.13±1.30 16.32±1.55 13.42±0.39 13.28±1.21 0.070
白细胞介素-6 IL-6/(ng/g prot) 8.16±0.33 8.28±0.50 7.65±0.55 7.86±0.36 0.743
白细胞介素-10 IL-10/(ng/g prot) 5.25±0.44 5.21±0.50 5.37±0.58 5.38±0.34 0.991
分泌型免疫球蛋白A
sIgA/(ng/mg prot)		 151.70±6.80 161.62±10.57 169.22±12.57 162.76±9.17 0.693
肿瘤坏死因子-α
TNF-α/(ng/g prot)		 11.57±0.80 11.70±0.44 10.95±0.73 10.87±0.50 0.725

2.4 饲粮添加不同组合酸化剂对黄羽肉鸡肠道形态和黏膜屏障功能相关基因表达的影响

由表6、图1和图2可知,与对照组和抗生素组相比,γ-氨基丁酸+柠檬酸组和植物精油+柠檬酸组50日龄黄羽肉鸡回肠绒毛高度以及空肠和回肠绒隐比显著提高(P<0.05),空肠和回肠隐窝深度显著降低(P<0.05),空肠和回肠杯状细胞数目显著提高(P<0.05);植物精油+柠檬酸组空肠绒毛高度显著提高(P<0.05)。由图3可知,与对照组和抗生素组相比,γ-氨基丁酸+柠檬酸组和植物精油+柠檬酸组空肠封闭蛋白-1(claudin-1)、闭合蛋白(occludin)、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)和连接黏附分子2(JAM2)和回肠ZO-1 mRNA相对表达量显著提高(P<0.05);植物精油+柠檬酸组空肠黏蛋白2(MUC2)以及回肠claudin-1和MUC2 mRNA相对表达量显著提高(P<0.05)。
表6 饲粮添加不同组合酸化剂对黄羽肉鸡肠道形态的影响

Table 6 Effects of different combinations of dietary acidifiers on intestinal morphology of yellow-feathered broilers

项目
Items		 对照组
Control group		 抗生素组
Antibiotic group		 γ-氨基丁酸+
柠檬酸组
γ-aminobutyric
acid+citric acid
group		 植物精油+
柠檬酸组
Plant essential
oil+citric acid
group		 P值
P-value
空肠Jejunum
绒毛高度Villus height/μm 1 290.14±75.75c 1 548.99±68.84b 1 764.97±89.26ab 1 884.69±35.57a <0.001
隐窝深度Crypt depth/μm 315.94±2.34a 294.20±1.41b 273.48±7.48c 252.85±5.80d <0.001
绒隐比V/C 3.92±0.26c 5.21±0.29b 6.43±0.43a 7.01±0.41a <0.001
杯状细胞数目
Number of goblet cells/(个/mm)		 100.13±4.94d 118.71±1.73c 136.78±3.55b 160.64±6.17a <0.001
回肠Ileum
绒毛高度Villus height/μm 1 227.80±24.17b 1 423.09±69.08b 1 670.85±91.89a 1 726.70±61.87a 0.001
隐窝深度Crypt depth/μm 287.04±10.33a 307.27±13.38a 247.51±7.52b 254.64±3.41b 0.002
绒隐比V/C 4.30±0.23b 4.64±0.19b 6.74±0.27a 6.79±0.31a <0.001
杯状细胞数目
Number of goblet cells/(个/mm)		 111.96±4.30d 123.96±5.43c 136.83±2.49b 163.11±2.46a <0.001
图1 饲粮添加不同组合酸化剂对黄羽肉鸡肠道形态的影响

Fig.1 Effects of different combinations of dietary acidifiers on intestinal morphology of yellow-feathered broilers (200×)

图2 饲粮添加不同组合酸化剂对黄羽肉鸡肠道杯状细胞分布和数目的影响

Fig.2 Effects of different combinations of dietary acidifiers on intestinal goblet cell distribution and number of yellow-feathered broilers (200×)

图3 饲粮添加不同组合酸化剂对黄羽肉鸡肠道黏膜屏障功能相关基因表达的影响

数据柱标记不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Fig.3 Effects of different combinations of dietary acidifiers on intestinal mucosal barrier function related gene expression in yellow-feathered broilers

Data columns marked with different letters indicated significant differences (P<0.05).

2.5 饲粮添加不同组合酸化剂对黄羽肉鸡盲肠菌群的影响

2.5.1 α多样性分析

本试验32个盲肠内容物样品共获得3 341 443条高质量序列,平均长度为418.55 nt。由表7可知,各组间黄羽肉鸡盲肠菌群物种丰富度[可观测特征(observed_features)和Chao1指数]、物种均匀度[优势度(dominance)和Pielou_e指数]、测序深度[Goods覆盖度(Goods_coverage)]和群落多样性(Shannon指数和Simpson指数)均无显著差异(P>0.05)。
表7 饲粮添加不同组合酸化剂对黄羽肉鸡盲肠菌群α多样性的影响

Table 7 Effects of different combinations of dietary acidifiers on α diversity of cecal microbiota of yellow-feathered broilers

项目
Items		 对照组
Control group		 抗生素组
Antibiotic group		 γ-氨基丁酸+
柠檬酸组
γ-aminobutyric
acid+citric acid
group		 植物精油+
柠檬酸组
Plant essential
oil+citric acid
group		 P值
P-value
物种丰富度Species richness
可观测特征Observed_features 371.14±30.97 364.00±25.22 380.13±15.80 369.63±18.47 0.966
Chao1指数Chao1 index 376.98±31.42 369.37±24.86 389.05±17.27 375.49±18.93 0.942
物种均匀度Species evenness
优势度Dominance 0.06±0.01 0.06±0.01 0.04±0.00 0.06±0.00 0.104
Pielou_e指数Pielou_e index 0.63±0.02 0.61±0.02 0.62±0.02 0.63±0.01 0.824
测序深度Sequencing depth
Goods覆盖度Goods_coverage/% 99.99±0.01 100.00±0.00 99.99±0.01 100.00±0.00 0.580
群落多样性Community diversity
Shannon指数Shannon index 5.37±0.13 5.16±0.24 5.33±0.16 5.38±0.12 0.792
Simpson指数Simpson index 0.92±0.02 0.91±0.02 0.93±0.02 0.94±0.00 0.725

2.5.2 β多样性分析

如图4所示,基于加权UniFrac和非加权UniFrac距离主坐标分析(PCoA)发现,其中主成分1(PC1)1、主成分2(PC2)对样品差异的贡献值分别为38.44%、15.27%和14.10%、9.66%。各组样本距离接近且倾向于聚集在一起,重叠部分较多,表明各组盲肠菌群组成结构相似。
图4 基于加权UniFrac(左)和非加权UniFrac(右)距离主坐标分析

R1:对照组;R2:抗生素组;R3:γ-氨基丁酸+柠檬酸组;R4:植物精油+柠檬酸组。下图同。

Fig.4 PCoA based on weighted UniFrac (left) and unweighted UniFrac (right) distances

R1: control group; R2: antibiotic group; R3: γ-aminobutyric acid+citric acid group; R4: plant essential oil+citric acid group. The same as below.

2.5.3 盲肠菌群在门和属水平上的组成分析

由图5可知,在门水平上,与对照组相比,抗生素组黄羽肉鸡盲肠菌群中弯曲杆菌门(Campylobacterota)和变形菌门(Proteobacteria)相对丰度提高,但广古菌门(Euryarchaeota)和互养菌门(Synergistota)相对丰度降低;γ-氨基丁酸+柠檬酸组盲肠菌群中广古菌门相对丰度提高;植物精油+柠檬酸组盲肠菌群中厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度提高,但变形菌门、脱铁杆菌门(Deferribacterota)和互养菌门相对丰度降低。
图5 饲粮添加不同组合酸化剂对黄羽肉鸡盲肠菌群在门和属水平上相对丰度的影响

Fig.5 Effects of different combinations of dietary acidifiers on relative abundance of cecal microbiota of yellow-feathered broilers at phylum and genus levels

在属水平上,与对照组相比,各试验组黄羽肉鸡盲肠菌群中厚壁菌门的巨单胞菌属(Megamonas)和粪杆菌属(Faecalibacterium)相对丰度提高,但罕见小球菌属(Subdoligranulum)、副拟杆菌属(Parabacteroides)和肠单胞菌属(Intestinimonas)相对丰度降低;抗生素组盲肠有害菌如螺杆菌属(Helicobacter)以及条件致病菌如肠球菌属(Enterococcus)和埃希氏菌-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)相对丰度提高,但有害菌甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)相对丰度降低;γ-氨基丁酸+柠檬酸组盲肠甲烷短杆菌属相对丰度提高;植物精油+柠檬酸组盲肠有害菌如互养菌属(Synergistes)和黏螺旋藻属(Mucispirillum)相对丰度降低。

2.5.4 盲肠菌群差异物种分析

如图6所示,采用线性判别分析(LDA)效应大小(LEfSe)分析统计LDA值分布柱状图(图6-A)和进化分支图(图6-B),结果显示只有抗生素组盲肠菌群含有差异显著的物种,差异物种包括变形菌门、γ-变形菌纲下的肠杆菌目(Enterobacterales)和巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)。
图6 黄羽肉鸡盲肠菌群差异物种LEfSe分析

Fig.6 LEfSe analysis of different species of cecal microbiota of yellow-feathered broilers

2.5.5 盲肠菌群功能注释和聚类分析

如图7-A所示,采用Tax4Fun进行功能预测,在1级水平上,各组黄羽肉鸡盲肠菌群基因经京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库被注释到涉及代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程、人类疾病以及生物体系统等,其中相对丰度最高的功能基因种类与代谢相关。如图7-B所示,聚类分析发现各组盲肠菌群功能富集有明显区分,其中,对照组主要富集在未分类部分,抗生素组主要富集在环境信息处理,γ-氨基丁酸+柠檬酸组主要富集在遗传信息处理,而植物精油+柠檬酸组主要富集在人类疾病和生物体系统。
图7 1级水平上黄羽肉鸡盲肠菌群功能注释(A)和聚类分析(B)

Fig.7 Functional annotation (A) and cluster analysis (B) of cecal microbiota of yellow-feathered broilers at level 1

3 讨论

3.1 饲粮添加不同组合酸化剂对黄羽肉鸡生长性能的影响

研究表明,饲粮添加100 mg/kg γ-氨基丁酸(纯度≥98%)[5]以及300 mg/kg γ-氨基丁酸(纯度20%)+500 mg/kg丁酸钠(纯度50%)[6]分别可以提高黄羽肉鸡和爱拔益加(AA)肉鸡生长性能。刘松柏等[16]研究表明,无抗饲粮添加1.5%复合型酸化剂(35%柠檬酸、5%富马酸和5%甲酸钙)对于改善黄羽肉鸡小鸡阶段的生长性能有一定作用,但对中鸡阶段和大鸡阶段的生长性能均无显著影响。殷继勋[17]研究表明,饲粮添加0.15%复合酸化剂(30%柠檬酸、20%乳酸、10%磷酸和10%甲酸钙)对肉鸡的生长性能无显著影响。本研究结果显示,饲粮添加γ-氨基丁酸+柠檬酸对黄羽肉鸡1~21日龄生长性能无显著影响,但是显著提高了42和50日龄试验鸡体重。以上试验结果均表明,低剂量(0.15%)以柠檬酸为主的复合酸化剂对肉鸡生长性能无显著影响,具体添加剂量以及添加种类对黄羽肉鸡促生长方面产生协同或累加效应仍需进一步研究。
刘新泽等[18]研究发现,饲粮添加0.1%甲酸甲酸铵+精油改善了AA肉鸡7~50日龄生长性能。饲粮添加15 g/t植物精油+250 g/t苯甲酸显著提高了麻黄肉鸡1~84日龄末重,显著降低了22~42日龄料重比;但1~21日龄和43~63日龄末重显著低于抗生素组[11]。本试验结果与前人研究结果相似,饲粮添加植物精油+柠檬酸对黄羽肉鸡1~21日龄生长性能无显著影响;与抗生素组相比,植物精油+柠檬酸组42和50日龄试验鸡体重和1~50日龄平均日增重均显著提高,全期料重比显著降低,该组合有效改善了黄羽肉鸡生长性能。以上结果显示,酸化剂与植物精油联用效果具有阶段效应,且受肉鸡品种的影响,可以提高麻黄肉鸡和黄羽肉鸡生长中期生长性能,提高麻黄肉鸡全期末重以及降低黄羽肉鸡料重比。然而,白俊宇等[10]研究发现,300 mg/kg植物精油+2 000 mg/kg苯甲酸组合虽能有效改善淮北麻鸡生长性能,但与单一添加植物精油或苯甲酸相比,植物精油与苯甲酸组合降低了90日龄淮北麻鸡体重、平均日增重和平均日采食量,本研究与上述研究结果不一致。这可能与植物精油和有机酸添加种类和剂量有关,高剂量的植物精油和γ-氨基丁酸+柠檬酸组合使用可能会对动物造成不利影响。

3.2 饲粮添加不同组合酸化剂对黄羽肉鸡血浆生化指标和免疫功能的影响

齐梦迪等[12]研究发现,饲粮添加150 g/t植物精油+1 500 g/t复合有机酸显著提高了42日龄AA肉鸡血清白蛋白含量。许金根等[19]研究表明,饲粮添加0.1%复合酸化剂(乳酸、磷酸和柠檬酸)可以提高肉鸡血清总蛋白和白蛋白含量。本试验结果显示,饲粮添加γ-氨基丁酸+柠檬酸和植物精油+柠檬酸均能显著提高黄羽肉鸡血浆总蛋白含量,有提高血浆白蛋白含量的趋势,显著降低血浆尿酸含量。这与前人的研究结果不完全一致,推测可能与酸化剂的添加剂量或种类不同有关。但血浆生化指标结果与生长性能结果趋势一致,说明γ-氨基丁酸+柠檬酸以及植物精油+柠檬酸联合添加均有效促进了机体对饲粮中营养物质尤其是对蛋白质的利用率,从而改善了黄羽肉鸡的生长性能。
细胞因子在免疫和炎症反应中起重要作用,也是调节肠道功能的重要介质。在竹丝鸡饲粮中添加参苓白术散并加减配合植物精油能显著提高母鸡血清IgG、IgM和公鸡血清IgM含量,而血清IgA含量也有一定程度的提高[20]。饲粮添加1.5 kg/t植物精油和柠檬酸复合物显著降低了肉鸡血清IL-1β和TNF-α含量,显著提高了血清IL-2含量[8]。本研究发现,饲粮添加植物精油+柠檬酸显著降低了黄羽肉鸡血浆和空肠黏膜IL-6含量,有降低回肠黏膜IL-1β含量的趋势,并显著提高了血浆IL-10、IgG和IgM含量以及空肠黏膜sIgA含量。并且,γ-氨基丁酸+柠檬酸组与植物精油+柠檬酸组之间各种细胞因子含量均无显著差异。以上试验结果表明,饲粮添加γ-氨基丁酸+柠檬酸和植物精油+柠檬酸均可能通过减少促炎刺激并增强抗炎反应,一定程度上改善肉鸡免疫状态,这也与本研究中肠道屏障相关试验结果相一致。

3.3 饲粮添加不同组合酸化剂对黄羽肉鸡肠道形态和黏膜屏障功能的影响

肠道较高的绒毛高度和较浅的隐窝深度说明畜禽的消化吸收功能较强,绒毛高度增高还可以减少有害菌的定殖。众多研究已证实,复合有机酸可以有效改善肠道形态结构,提高动物生长性能[12-13,17,21]。研究发现,植物精油和苯甲酸复合组麻黄肉鸡21和42日龄空肠隐窝深度显著低于对照组,绒隐比显著高于对照组;且复合组42日龄空肠隐窝深度和绒隐比均显著优于抗生素组[11]。类似的,饲粮添加0.20%甲酸甲酸铵酸化剂能显著提高肉鸡空肠绒隐比和回肠绒毛高度;饲粮添加0.10%甲酸甲酸铵+精油能显著降低空肠隐窝深度,提高空肠绒隐比[18]。与上述研究结果基本一致,本试验中,γ-氨基丁酸+柠檬酸组和植物精油+柠檬酸组黄羽肉鸡回肠绒毛高度以及空肠、回肠隐窝深度和绒隐比均显著优于抗生素组。这说明γ-氨基丁酸+柠檬酸以及植物精油+柠檬酸联合添加均对快大型黄羽肉鸡的肠道形态改善有一定促进作用。
小肠上皮细胞之间的杯状细胞与紧密连接蛋白(occludin、claudin-1和ZO-1)的相互作用是肠道机械屏障保持通透性的关键,因此二者是评价肠道发育、肠道屏障功能的重要指标[21]。肠上皮细胞分泌的MUC2形成一道天然保护层,既能阻止毒素渗入,又能防止致病菌入侵;JAM2属于黏附分子家族,可调节紧密连接蛋白的形成和胞间分布。饲粮添加复合酸化剂能一定程度上提高白羽肉鸡空肠黏膜ZO-1、occludin和MUC2的基因表达水平[13]。Stefanello等[22]研究发现,饲粮添加300 g/t酸化剂+植物精油提高了科宝500肉鸡肠道紧密连接蛋白的基因表达。饲粮添加植物精油和柠檬酸后,科宝肉鸡空肠claudin-1的基因表达水平显著高于对照组[8]。研究发现,参苓白术散加减配合植物精油能显著增加竹丝鸡空肠杯状细胞数量,为竹丝鸡的肠道筑成了坚固的屏障[20]。与前人的研究结果相似,γ-氨基丁酸+柠檬酸组和植物精油+柠檬酸组黄羽肉鸡空肠claudin-1、occludin、ZO-1和JAM2的mRNA相对表达量和回肠ZO-1的mRNA相对表达量以及空肠和回肠杯状细胞数目均显著高于抗生素组;植物精油+柠檬酸组空肠MUC2和回肠claudin-1和MUC2的mRNA相对表达量也均显著高于抗生素组。这说明相对于复合酸化剂,饲粮联合添加柠檬酸和植物精油可以更有效地改善黄羽肉鸡回肠肠道发育以及肠道黏膜屏障功能。这可能是由于植物精油与有机酸的联合抑菌作用影响了机体的肠道菌群结构,进而调控肠道紧密连接蛋白的表达,保护肠道屏障[23]。

3.4 饲粮添加不同组合酸化剂对黄羽肉鸡盲肠菌群的影响

在肉鸡盲肠样本中,以厚壁菌门和拟杆菌门为主,二者比值升高可以更好地保护肠道免受细菌侵犯,且与体重呈正相关[24-25]。变形菌门增加会导致肠道菌群失调,引起肠道炎症。已有研究证实,酸化剂和植物精油可以发挥其抑菌作用对家禽肠道菌群如双歧杆菌[26]、乳酸杆菌[27]等有益菌进行正向调节,显著降低回肠大肠杆菌数量[9],并影响肠道菌群的代谢物丰度,进而加速肠道紧密连接的组装,调节肠道屏障功能[28]。本研究结果表明,与对照组相比,抗生素组肉鸡盲肠菌群中弯曲杆菌门和变形菌门相对丰度提高,螺杆菌属、肠球菌属和埃希氏菌-志贺氏菌属相对丰度提高,由此说明抗生素的使用会导致肠道菌群紊乱,进而导致许多疾病。γ-氨基丁酸+柠檬酸组和植物精油+柠檬酸组盲肠菌群结构均优于抗生素组。与对照组相比,植物精油+柠檬酸组黄羽肉鸡盲肠菌群中变形菌门、脱铁杆菌门和互养菌门相对丰度降低,有害菌如互养菌属和黏螺旋藻属相对丰度降低。这可能是由于植物精油中的百里香酚和香芹酚可以提高细胞膜通透性,从而增加细菌对有机酸的敏感性;且在有机酸的酸性条件下,植物精油的疏水性增加,更易通过细菌细胞膜发挥作用[8]。
肠道菌群在调节机体健康方面起着关键作用,菌群失调会导致肠黏膜屏障功能受损,肠道通透性改变,肠源性内毒素过量产生,进而诱导疾病的发生。研究发现,牛至精油和香芹酚能帮助人类抑制造成急性胃肠炎的诺如病毒的数量[29]。植物精油还能舒张血管、降血压、抗心肌缺血、预防和改善动脉粥样硬化、抗血小板聚集以及抗心律失常,对心血管系统具有保护作用[30]。本研究也发现,只有植物精油+柠檬酸组盲肠菌群主要功能富集在人类疾病和生物体系统,这将会为人类健康及疾病的诊治提供新的思路。

4 结论

① γ-氨基丁酸+柠檬酸以及植物精油+柠檬酸联合添加均可有效提高快速型黄羽肉鸡平均日增重并降低料重比,增强机体免疫功能和肠道黏膜屏障功能,从而改善肉鸡生长性能。
② 相较于γ-氨基丁酸+柠檬酸,饲粮添加植物精油+柠檬酸还可更有效改善回肠黏膜屏障功能,同时减少盲肠菌群中有害菌数量。
④ 综合来看,有机酸化剂与植物精油联合添加的作用效果优于抗生素或单纯复合酸化剂的作用效果。

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