肠道不仅是畜禽食物消化和营养物质吸收的重要场所,还具有激素分泌和免疫调节等重要功能。在养殖过程中,饲粮和环境中的病原菌、霉菌毒素、氧化油脂和致敏蛋白等多种应激源容易引发肠道形态改变,造成肠道物理屏障损伤,降低养殖效益。完整的物理屏障、特异的化学环境、稳定的微生物区系、适度的黏膜免疫和强劲的消化吸收是评价畜禽肠道健康的5个重要体系[1-2]。杯状细胞分泌黏蛋白形成的黏液屏障,位于肠道上皮细胞和肠道微生物之间,是机体抵御肠腔中病原菌、毒素和抗原物质等入侵和抵抗消化道应激的第一道屏障[3-4]。研究显示,肠道黏膜屏障失调容易引起肠道通透性增加,造成病原菌和真菌的易位,诱发系统性炎症和代谢性疾病[5-6]。肠道微生物是一个复杂和动态的生态系统,微生物之间常以交叉喂养(cross-feeding)等互作方式形成微生物生态群,进而调控宿主的肠道健康[7⇓-9]。研究显示,肠道共生菌可以通过调控杯状细胞分泌黏蛋白及其糖基化等方式改善肠道黏膜屏障功能,有助于维持肠道稳态[5]。综上可知,肠道微生物是促进家禽肠道黏膜屏障形成和功能发挥的重要靶点,保护肉鸡消化道黏膜屏障具有重要的科学理论意义和实践指导价值。本文围绕改善肠道黏膜屏障的意义、肠道微生物对肠道黏膜屏障的调控作用以及肠道微生物互作对肠道黏膜屏障的影响,综述了肠道微生物生态系统改善消化道黏膜屏障的重要作用。
1 完整的肠道黏膜屏障是家禽健康养殖的重要保障
1.1 肠道黏液屏障的形成
肠道黏液层主要由水(90%~95%)、电解质、脂质(1%~2%)和蛋白质等物质组成,其中蛋白质决定黏液层的结构和功能[5]。目前研究发现的黏液层核心蛋白有29种,其中主要成分是黏蛋白,能够维持黏液层的结构和功能[10]。黏蛋白是一种糖基化蛋白,其核心结构由脯氨酸(Pro)、苏氨酸(Thr)和丝氨酸(Ser)3个氨基酸残基构成的PTS序列组成,形成“黏蛋白结构域”[5]。黏蛋白的合成与糖基化主要发生在杯状细胞的内质网和高尔基体中。大量的黏蛋白合成容易造成内质网的功能负担,“未折叠蛋白质应激反应”介导的内质网应激通路是内质网保障分泌大量黏蛋白的基础,其包含3种途径:1)减缓蛋白质错误折叠;2)减少蛋白质合成;3)增强未折叠蛋白质降解[11]。如果错误折叠的蛋白质数量很多且无法恢复,细胞会启动凋亡信号来实现自我保护[11]。黏蛋白的糖基化主要分为N-和O-糖基化。脯氨酸能够维持黏蛋白在高尔基体中呈现展开的状态,从而利于黏蛋白的糖基化。N-糖基化主要通过β1-糖苷键将N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc)连接到天冬酰胺侧链的氮原子上,天冬酰胺连接的核心结构包含2个GlcNAc残基和3个甘露糖残基,其余的GlcNAc、半乳糖、唾液酸和岩藻糖等单糖可添加至核心结构上,延伸糖基链[5]。O-糖基化主要在N-乙酰半乳糖基转移酶的催化下,苏氨酸和丝氨酸的羟基(—OH)上氧原子与N-乙酰半乳糖胺上的α-1-O-糖苷键共价连接构成黏蛋白的基本结构[12]。然后在20种不同糖基转移酶的催化下,延长形成不同类型的黏蛋白糖链[13]。糖基化修饰后的黏蛋白在杯状细胞(goblet cells)进一步加工,以胞吐的方式分泌到黏液层,分泌的黏蛋白在pH、钙离子(Ca2+)以及碳酸氢根离子(HCO3-)等的作用下结合水扩张形成黏液层[5]。
1.2 改善肠道黏膜屏障的意义
黏蛋白与水结合赋予了肠道黏液层保湿和润滑的特性,黏液层可保护上皮细胞在肠腔内容物和肠道蠕动的过程中免受脱水和机械摩擦[14]。润滑的特性使黏液层可结合并收集肠道中的细菌和大分子物质,通过肠道的流动性清除肠道表面杂质。肠道黏液屏障还是扩散的屏障,水、离子和营养物质等小分子很容易穿过黏液屏障并扩散至肠上皮细胞,肠道黏膜屏障的完整性也是畜禽营养物质吸收的重要保证[5]。养殖过程中,当机体遭受病原菌、寄生虫的入侵时,肠道增加黏蛋白的分泌以便于消除病原体;而养殖过程中的热应激、断奶应激等会引起肠道减少黏蛋白分泌,造成肠道黏液屏障的损伤。当饲粮中缺乏膳食纤维时,肠道微生物群会求助于宿主分泌的黏液糖蛋白作为营养物质来源,导致结肠黏液屏障的侵蚀,消化道黏液层变薄,通透性增加,对病原菌的抵抗降低[15]。膳食多糖的添加可增加杯状细胞的数量和黏蛋白的分泌,并改善黏膜屏障[16]。在家禽养殖中,可通过丁酸、纤维和甜菜碱等营养添加剂改善家禽肠道黏膜屏障,保护肠道损伤,抵御沙门氏菌等的入侵[17⇓-19]。因此,维持或改善黏液屏障功能有助于机体缓解肠道应激反应,增强肠道抵抗病原菌和有害物质的入侵能力。
2 肠道微生物参与调控肠道黏膜屏障
2.1 家禽肠道微生物图谱特征
家禽肠道微生物的数量高达1011个[20],随着测序技术的发展,越来越多的细菌基因组被组装,其中肉鸡盲肠微生物可被组装的细菌基因组数目高达469个[21],且大量的微生物[梭菌目(Clostridiales)和拟杆菌门(Bacteroidetes)等]被分离鉴定[22]。家禽的肠道随着生理阶段和营养状态等的改变呈现不同的特征性微生物区系。在胚期,家禽有独特的肠道微生物特征,变形菌门(Proteobacteria)的丰度高达86%,其中嗜盐单胞菌属(Halomonas)占79%;在孵化后期,肠球菌属(Enterococcus)等好氧菌在氧气的刺激下逐渐定植[23]。出壳之后,在环境、氧气和饮食的刺激下,厚壁菌门(Firmicutes)成为肉鸡肠道的优势菌门[24]。随着日龄的增加,肉鸡的前肠道微生物相对稳定,厚壁菌门是丰度最高的优势菌门,在空肠和回肠中定植大量的乳酸杆菌;在后肠道,厚壁菌门的丰度逐渐降低,而拟杆菌门的丰度随着日龄增加而增加,在14日龄时逐渐形成以厚壁菌门和拟杆菌门为丰度最高的优势菌门[24]。拟杆菌门的细菌大多为厌氧菌,在肠道中具有厌氧发酵和产短链脂肪酸(short-chain fatty acid,SCFA)的功能,其在后肠道的定植可提高营养物质的利用能力[25]。嗉囊中主要有大肠杆菌(Escherichia coli)和乳杆菌属(Lactobacillus)定植;相比于嗉囊,肌胃的微生物多样性更高,除了大肠杆菌之外,乳酸杆菌、肠球菌和肠杆菌等也有定植[20,26]。
2.2 肠道微生物对肠道黏膜屏障的调控作用
肠道微生物与肠道黏膜屏障存在双向互作,肠道黏液层为微生物提供营养物质与定植位点,脱落的黏蛋白是多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)等细菌重要的营养来源。黏液层外层的黏蛋白为共生菌提供定植生态位,每种共生菌在肠道中都有特定的生态位,并且该生态位具有一定的承载能力,生态位上定植的共生菌对相同的菌种具有定植抗性[27]。与黏液层相关的微生物也被称为“黏液相关微生物”,如毛螺菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)及嗜黏蛋白阿克曼氏菌[28]。肠道微生物是肠道黏液屏障功能的保障,尽管无菌小鼠肠道黏液屏障的组成与常规小鼠相似,但是无菌小鼠的肠道黏液层无法抵御微生物的入侵[29]。给无菌小鼠定植肠道微生物5周后,肠道才能形成正常的黏液屏障和稳定的微生物区系[29]。Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是介导肠道微生物与宿主互作的重要受体家族,肠道中TLR的衔接蛋白髓样分化因子88(MyD88)敲除小鼠的黏蛋白2(MUC2)基因表达降低,肠道黏液层变薄,细菌易位增加,这表明细菌可通过TLR受体家族参与黏液层的形成并维护肠道黏膜屏障[30]。饲粮添加阿拉伯木聚糖和抗性淀粉可改变肉鸡肠道微生物结构组成,分别靶向富集瘤胃球菌属(Ruminococcus)和拟杆菌属(Bacteroides),是改善膳食纤维缺乏诱发的肠道黏膜屏障损伤的重要机制[31]。鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)可以刺激肠道上皮细胞黏蛋白3(MUC3)和MUC2的合成与分泌,增加黏液层的厚度,缓解葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的肠道屏障的损伤[32-33]。嗜黏蛋白阿克曼氏菌可以降解黏蛋白,但其还可以增加肠道杯状细胞的数量,刺激黏蛋白的合成与分泌[34-35]。微生物对消化道黏膜屏障的影响更体现在其对黏蛋白糖基化的调控,微生物在消化道中的定植还可激活细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信号通路,通过上调活化复制因子2(ATF2)和c-Jun转录因子的表达,提高α-1,2/3岩藻糖转移酶的表达,进而影响消化道黏膜的糖基化[36]。研究发现,Bacteroides dentium可诱导肠道上皮细胞的岩藻糖基化的表达,提高酸性黏蛋白的表达[12]。因此,肠道微生物与肠道黏膜屏障的功能、黏蛋白的糖基化修饰密切相关,通过靶向调控肠道微生物改善肠道黏膜屏障可缓解畜禽肠道应激。
2.3 微生物衍生的代谢产物——微生物与肠道黏膜屏障互作的“桥梁”
SCFA是微生物发酵膳食纤维和蛋白质产生的代谢产物,主要有乙酸、丙酸和丁酸(比例约为3:1:1)[37]。SCFA主要以3种途径调控肠道黏膜屏障:1)为肠道上皮细胞提供能量。研究显示,丁酸可作为能量促进细胞的增殖和分化,增加肠道杯状细胞的数量,刺激黏蛋白的合成与分泌,从而增强肠道黏膜屏障功能[19]。2)SCFA作为信号分子可以激活G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPR)并改善肠道的通透性和肠道炎症,其中GPR41、GPR43和GPR109A是SCFA 3个重要的G蛋白偶联受体,GPR41和GPR43可以感知乙酸和丙酸,丁酸的受体主要是GPR109A[25,38]。3)丁酸和丙酸还可以作为组蛋白去乙酰化酶的抑制剂改变染色质结构和基因的转录活性,进而调控肠道功能稳态[25]。不同的肠道微生物携带不同的酶而产生不同的SCFA,改变微生物结构和组成可以调节肠道中SCFA的含量,进而改善宿主肠道健康。
胆汁酸是肠道微生物另一重要的代谢产物,对宿主的生理功能具有重要的调节作用。胆汁酸有2个重要的受体蛋白,一个是法尼醇X受体(Farnesoid X receptor,FXR),另外一个是Takeda G蛋白偶联受体5(Takeda G protein-coupled receptor 5,TGR5),胆汁酸可以通过激活这2个受体调节肠道的功能稳态。例如,一些疏水性的胆汁酸[如石胆酸(lithocholic acid,LCA)和去氧胆酸(deoxycholic acid,DCA)]与肠道上皮细胞的凋亡相关,而熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)作为一种亲水性的胆汁酸,可以抵抗肠道上皮细胞的凋亡[39]。胆汁酸还通过直接激活受体参与肠道黏膜屏障功能。鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)通过激活FXR保护脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导的肠道屏障功能的损伤[40],牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)通过激活TGR5改善肠道的屏障功能[41]。而DCA通过减少肠道中杯状细胞和潘氏细胞的数量,降低紧密连接蛋白闭锁小带蛋白-1(ZO-1)和MUC2的表达,进而诱导肠道黏膜屏障受损[39]。在畜牧领域,有研究通过调节蛋白质和碳水化合物的水平(玉米淀粉和水解酪蛋白)能改变肠道微生物的组成及其衍生的胆汁酸谱,进而实现改善肠道黏膜屏障的功能[42];饲粮中的阿拉伯木聚糖和抗性淀粉通过调节肉鸡肠道微生物组成,改变胆汁酸的生物转化,进而改善肉鸡肠道黏膜屏障功能[31]。这些研究结果表明,不同的胆汁酸在参与调节肠道黏膜屏障时扮演不同的角色,而通过调控肠道微生物及其衍生的胆汁酸在改善畜禽肠道黏膜屏障具有重要的意义。
3 “交叉喂养”驱动的“微生物生态群”参与肠道黏膜屏障互作
多糖是消化道微生物优质的能源物质,共生菌通过多糖代谢并以交叉喂养形成微生物生态群是参与宿主互作的重要方式[3,45]。高复合纤维干预可富集碳水化合物代谢能力强的15株菌株,并通过SCFA改善宿主肥胖[8]。罗氏菌属(Roseburia)和粪杆菌属(Faecalibacterium)具有较强的乙酰化半乳葡甘露聚糖代谢能力,在断奶仔猪饲粮中添加乙酰化半乳葡甘露聚糖,罗氏菌属和粪杆菌属表达甘露聚糖特异性多糖利用位点(PUL)代谢相关的酶的能力提高;同时通过交叉喂养提高普氏菌属(Prevotella)的丰度,进而共同促进SCFA的产生,调控仔猪消化道健康[46]。此外,Prevotella copri的基因组编码多个PUL,脂肪堆积高的猪群体中Prevotella copri形成的微生物生态群参与脂肪沉积[47]。普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)通过N-乙酰葡糖胺糖苷酶代谢产生N-乙酰氨基葡糖,N-乙酰氨基葡糖可以促进嗜黏蛋白阿克曼氏菌的生长,进而改善高脂饮食诱导的肠道屏障的损伤[48]。微生物之间的交叉喂养也利于维持肠道的稳态,多形拟杆菌可以代谢产生乙酸,乙酸通过上调Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)基因表达增加杯状细胞的分化,促进黏蛋白的分泌和硫酸化;Faecalibacterium prausnitzii则利用肠道中的乙酸,增加丁酸的产生,使肠道中的细胞分化维持在适当的比例[49]。饲粮添加α-D-葡聚糖和牡蛎多糖等功能性多糖可改善小鼠消化道黏膜屏障[50]。因此,多糖通过被肠道微生物利用,并通过“交叉喂养”驱动“微生物生态群”的形成,影响微生物衍生的代谢产物并参与宿主互作。
4 小结与展望
肠道是一个复杂的微生物生态系统,共生菌之间存在复杂的互作关系,交叉喂养可以使共生菌形成微生物生态群,进而参与肠道黏膜屏障互作。许多研究已经解析了单一的共生菌调控肠道黏膜屏障的机制,但是对微生物之间的互作关系研究较少。以微生物生态群调控宿主健康,有助于肠道微生物在肉鸡健康养殖中的应用。在家禽上研究微生物之间的互作、共生菌的体外培养以及交叉喂养驱动的微生物生态群还很有限,尚待全面、深入和持续地进行探索。