Chinese Journal of Animal Nutrition >

2025 , Vol. 37 >Issue 2: 1271 - 1285

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.110

RESEARCH PAPER

Optimization of Extraction Process of Artemisia argyi Polysaccharide by Response Surface Methodology and Analysis of Its Components and in Vitro Antioxidant Activity

  • ZHANG Xuekai ,
  • JIANG Min ,
  • XING Zhongyun ,
  • HAN Zhipeng ,
  • LI Jiaying ,
  • JIN Xiao , *
Expand
  • College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China
*associate professor, E-mail:

Received date: 2024-08-01

  Online published: 2025-02-16

Fold

Abstract

This experiment was conducted to optimize the extraction process of Artemisia argyi polysaccharides (AAP), and investigated it components and in vitro antioxidant activity. Based on single-factor experiments, the extraction yield of AAP was taken as the response value, and the optimal extraction conditions were determined through response surface methodology. The shape, structure, monosaccharide composition and molecular weight of the purified AAP were analyzed. Additionally, its antioxidant activity of AAP was evaluated by measuring the scavenging rates of 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radicals (DPPH·), hydroxyl radicals (·OH) and superoxide anion radicals ($O_{2}^{-}$·) as well as its iron reducing power. The results showed as follows: 1) the best extraction process of AAP was optimized by response surface with liquid to material ratio of 35∶1, enzymatic hydrolysis time of 4 h and temperature of 50 ℃. The extraction rate of AAP was 12.46%, and the content of soluble polysaccharides was 297.11 mg/g. 2) The purified AAP exhibited a variety of irregular particle shapes, including rough cubic particles, long-chain flakes and spherical forms. It contained five monosaccharides: arabinose, galactose, glucose, xylose and mannose, with molecular weight ratios of 1.68∶3.54∶80.81∶2.38∶11.59. The average molecular weight was 114.786 ku, and it was classified as a pyranose. 3) At the same concentration, the DPPH· scavenging rate and iron reduction rate at concentrations ranging from 0.05 to 1.0 mg/mL in the AAP group were significantly lower than those in the positive control group (P<0.01), and the ·OH scavenging rate at concentrations ranging from 0.40 to 1.00 mg/mL and the $O_{2}^{-}$· scavenging rate at concentrations ranging from 0.20 to 1.00 mg/mL were also significantly lower than those in the positive control group (P<0.01). The half-maximal inhibitory concentrations (IC50) for DPPH·, ·OH, and $O_{2}^{-}$· scavenging rates were 0.055 2, 0.868 4 and 0.839 2 mg/mL, respectively. In conclusion, this study optimizes the traditional AAP extraction process and demonstrates that AAP exhibits robust antioxidant activity through component analysis and in vitro antioxidant activity determination. This provides a robust theoretical foundation for the development and utilization of AAP as a feed additive.

Key words： Artemisia argyi polysaccharide; response surface; antioxidant activity; molecular weight; free radical scavenging rate; iron reducing power

Cite this article

ZHANG Xuekai , JIANG Min , XING Zhongyun , HAN Zhipeng , LI Jiaying , JIN Xiao . Optimization of Extraction Process of Artemisia argyi Polysaccharide by Response Surface Methodology and Analysis of Its Components and in Vitro Antioxidant Activity[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2025 , 37(2) : 1271 -1285 . DOI: 10.12418/CJAN2025.110

艾蒿(Artemisia argyi)是一种常见的多年生草本植物,属于菊科(Asteraceae)中的艾蒿属(Artemisia)。它是起源于亚洲的一种植物,在中国、日本、朝鲜半岛等地广泛分布,并在许多国家也有栽培和使用。艾蒿的叶片常被用于药用或香料用途,具有独特的芳香味道。在传统草药学中,艾蒿还被广泛用于中医药和民间草药中,它的叶子富含挥发油、黄酮类化合物和苦味成分,具有消炎、抗菌、驱虫和舒筋活络的功效[1],可作为天然的饲料添加剂。
多糖(polysaccharide)是复杂的生物大分子,由多个单糖分子通过糖苷键以多样化的方式连接而成,分子式可用通式(C6H10O5)n表示。艾蒿多糖(Artemisia argyi polysaccharide,AAP)是艾蒿粉末以水为溶剂溶解,加入纤维素酶酶解破坏细胞结构,浓缩得到结构完整的含有活性成分的提取物,经过醇沉过滤得到AAP。AAP中的多酚、多糖和黄酮类化合物等生物活性成分具有抗炎、抗衰老、调节免疫、抗氧化和促生长等作用[2-3],可作为动物饲料添加剂。牛壮[4]研究发现,爱拔益加(AA)肉仔鸡饲粮中添加AAP可增加肠道消化酶活性,改善小肠黏膜形态,调节肠道微生态系统,并可降低粪便中氨气的排放量。近年来,AAP因其复杂的化学结构和生理活性,且对动物机体较小的副作用以及高安全性等诸多优点而备受研究者关注[5]。
AAP的提取方法主要有醇沉法、酶解醇沉法和超声波辅助法等,其中醇沉法多用于工业但杂质较多[6];超声波辅助法可以破坏细胞结构,增加提取率,缩短提取时间,但目前的超声仪容量太小[7];酶解醇沉法是一种低温提取的方法,具有提取条件温和、反应速度快、杂质容易被除去等优势,并且此法通过酶解破坏细胞结构而增加提取率[8]。此外,可根据实际情况利用不同方法对其提取工艺的参数进行优化,以达到最佳提取率的目的。常见的优化方法有响应面法和正交设计法,正交设计法并不能完全表明整体因素的交互作用,具有局限性[9];响应面法可以进行多项拟合,以响应面模型方式更直观地观察多因素与提取率的交互关系。综合考虑以上方法的优缺点,本研究采用酶解醇沉法对AAP进行提取,以单因素分析为基础,采用响应面法对提取工艺进行优化,通过分离纯化去除粗多糖中的杂质,分析单糖组成和分子质量等,并对AAP抗氧化活性进行分析,旨在为开发应用具有抗氧化、促生长功效的AAP饲料添加剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 艾蒿

试验艾蒿于2022年5月采自内蒙古和林格尔县。

1.1.2 试剂

纤维素酶(绿色木霉)购自上海源叶生物科技有限公司,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)购自福州飞净生物科技有限公司,溴化钾购自美国Sigma公司,维生素C(vitamin C,VC)、磷酸盐缓冲液、正丁醇、三氟乙酸、氢氧化钠、醋酸钠、甲醇、氯仿、无水乙醇、硝酸钠、二甲基亚砜(DMSO)、邻苯三酚、盐酸、苯酚、浓硫酸、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、过氧化氢、硫酸亚铁和水杨酸等购自国药集团化学试剂有限公司。除DPPH外其余试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器

主要仪器包括I-2000电子天平(德清拜杰电器有限公司)、HWS-28电热恒温水浴锅(上海-恒科学仪器有限公司)、HZQ-X160恒温振荡培养箱(太仓市华美生化仪器公司)、RE-5298旋转蒸发仪器(上海雅荣生化仪器设备有限公司)、SHB-3循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、ALPHA 1-2LDplus真空冷冻干燥机(德国Marin Christ公司)、TD4-Z电动离心机(德国Marin Christ公司)、V-1000紫外分光光度计(上海翱艺仪器有限公司)、HITACHI Regulus-8100高分辨场发射扫描电子显微镜(日本日立公司)、Nicolet iZ-10傅里叶变换红外光谱仪(美国Thermo公司)、XH-T漩涡混合器(新宝仪器公司)、ICS-5000+离子色谱仪(美国Thermo公司)、高效液相色谱仪(美国Thermo公司)、激光光散射检测器(美国Wyatt公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 艾蒿植株处理

将采集的艾蒿平铺于地面在室温环境下阴干,再用研磨机粉碎,然后过40目筛以获得粉末备用。

1.2.2 AAP的制备

根据张凌会[1]的方法稍作修改,采用酶解醇沉法制备AAP。称取艾蒿粉于烧杯中,加入定量酶[10]与蒸馏水,恒温振荡后在70 ℃水浴锅中加热1 h使酶失活,过滤浓缩后,按1∶4的比例加入无水乙醇,充分混合沉降24 h后分离冻干粉,存于4 ℃冰箱备用,冻干粉即为AAP。试验所用AAP均以冻干粉为标准进行计算。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 液料比对AAP提取率的影响

准确称取5 g艾蒿和0.5 g纤维素酶(艾蒿质量与纤维素酶质量比为10∶1,下同)倒入500 mL锥形瓶中,分别按液料比20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1(蒸馏水的体积与艾蒿质量比)加入蒸馏水,保鲜膜封口后,在50 ℃恒温振荡培养箱中振荡3 h。每组设定3个重复。

1.2.3.2 酶解时间对AAP提取率的影响

称取艾蒿和纤维素酶,依据1.2.3.1选择最优液料比30∶1加入蒸馏水(下同),保鲜膜封口后,在50 ℃恒温振荡培养箱中分别振荡1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0 h。每组设定3个重复。

1.2.3.3 温度对AAP提取率的影响

称取艾蒿和纤维素酶,以液料比30∶1加入蒸馏水,保鲜膜封口后,控制恒温振荡培养箱温度分别为40、45、50、55、60 ℃,依据1.2.3.2选择最优酶解时间振荡3 h。每组设定3个重复。

1.2.4 响应面试验设计

参照张晶等[11]的方法,在单因素试验结果上,以液料比(A)、酶解时间(B)和温度(C)为自变量,响应值选择AAP提取率,进行3×3正交试验,-1、0和1分别代表3个水平,每个试验重复3次,响应面试验分析因素水平见表1。
表1 响应面试验分析因素水平

Table 1 Response surface test analysis factor level

因素
Factors		 水平Levels
-1 0 1
液料比Liquid solid ratio (A) 25∶1 30∶1 35∶1
酶解时间Enzyme digestion time/h(B) 2 3 4
温度Temperature/℃(C) 45 50 55

1.2.5 可溶性总糖含量测定

采用苯酚-硫酸法[12]测定AAP的可溶性总糖含量[10],不同浓度梯度的葡萄糖标准溶液如表2所示,以葡萄糖溶液为标准品绘制标准曲线。其线性回归方程为y=0.010 2x-0.002 6(R2=0.9901)。将处理好的样品溶液与浓硫酸于试管中混合,在490 nm处测定吸光值。根据标准曲线计算AAP的可溶性总糖含量。
可溶性总糖含量(mg/g)=C×V÷M。
式中:C为根据标准曲线计算出的结果;V为提取液总体积;M为实际称量质量。
表2 葡萄糖标准溶液

Table 2 Glucose standard solution

项目
Items		 管号Tube No.
1 2 3 4 5 6 7
母液Mother solution/mL 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
蒸馏水Distilled water/mL 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
葡萄糖浓度Glucose concentration/(μg/mL) 0 10 20 30 40 50 60

1.2.6 AAP的分离纯化

1.2.6.1 Sevage法去蛋白

称取500 mg的AAP粉末,以蒸馏水配制成5 mg/mL的多糖溶液,加入Sevage试剂(正丁醇∶氯仿,1∶4)脱蛋白,剧烈振荡后移入分液漏斗静置30 min,弃去中间与下层物质,多次重复上述步骤到无明显的中间蛋白,浓缩-冷冻干燥后得到脱蛋白的AAP。

1.2.6.2 AAP的分离纯化

参照张凌会[1]的方法,采用DEAE-52洗脱法对AAP进行纯化,浓缩-冷冻干燥后得到一次纯化后的艾蒿多糖(AAP-Ⅰ);再采用Sephadex G-100凝胶层析法对AAP-Ⅰ进一步分离纯化,浓缩-冷冻干燥后得到二次纯化后的艾蒿多糖(AAP-Ⅱ),-20 ℃保存备用。

1.2.6.3 扫描电镜分析多糖外貌

参照邢媛媛[13]的方法,使用高分辨场发射扫描电子显微镜对AAP-Ⅱ扫描拍照,放大倍率为500~10 000倍。

1.2.6.4 紫外全波长扫描分析

参照邢媛媛[13]的方法,采用赛默飞多功能酶标仪对多糖液进行定量分析。

1.2.6.5 单糖组成和分子质量分析

参照邢媛媛[13]的方法,以岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖等为单糖标准糖,采用电化学检测器检测AAP-Ⅱ的单糖组成。根据色谱图计算AAP-Ⅱ的重均分子质量(Mw)、数均分子质量(Mn)、Z均分子质量(Mz)、峰值分子质量(Mp)、多分散度(Mw/Mn)和均方根半径(R)。

1.2.6.6 傅里叶变换红外光谱扫描分析

参照Fu等[14]的方法,采用Nicolet iZ-10傅里叶变换红外光谱扫描分析AAP-Ⅱ,扫描范围为4 000~450 cm-1。

1.2.7 AAP体外抗氧化活性测定

1.2.7.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)清除能力

参照毛跟年等[15]的方法,配制0.05、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL的AAP样品溶液(以维生素C作为阳性对照,下同),利用紫外分光光度计于517 nm波长处测定吸光值,测定DPPH·清除率。每个浓度重复3次取平均值。

1.2.7.2 羟自由基(·OH)清除能力

参照杨电增等[16]的方法,配制不同AAP样品溶液,利用紫外分光光度计于517 nm波长处测定吸光值,测定·OH清除率。每个浓度重复3次取平均值。

1.2.7.3 超氧阴离子自由基($\mathrm{O}_{2}^{-} \cdot$)清除能力

根据欧燕香等[17]的方法,配制不同AAP样品溶液,利用紫外分光光度计于325 nm波长处测定吸光值,测定 O 2 -·清除率。每个浓度重复3次取平均值。

1.2.7.4 铁离子还原能力的测定

根据张立娟[18]的方法,配制不同AAP样品溶液,利用紫外分光光度计于700 nm波长处测定吸光值,测定铁离子还原能力。每个浓度重复3次取平均值。

1.3 数据处理

使用Excel 2021进行数据的初步统计和整理,Design-Expert V8.0.6 BoxBehnken进行响应面表格的制作,GraphPad Prism 8绘制各单因素间的互作图并进行概率分析,得出半数抑制浓度(IC50),最后利用SAS 9.2对全部数据进行单因素方差分析。试验数据采用“平均值±标准差”表示,P<0.01为差异极显著,P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 液料比对AAP提取率的影响

由图1-a可知,液料比在20∶1~30∶1时,AAP提取率随着液料比增加而升高,在30∶1时达到最高峰;当液料比大于30∶1时,AAP提取率下降。因此,选择30∶1为最佳液料比。
图1 液料比(a)、酶解时间(b)和温度(c)对艾蒿多糖提取率的影响

Fig.1 Effects of liquid-liquid ratio (a), enzymatic hydrolysis time (b) and temperature (c) on extraction rate of AAP

2.1.2 酶解时间对AAP提取率的影响

由图1-b可知,酶解时间在1.5~3.0 h时,AAP提取率随着酶解时间的增加而升高,在3.0 h时达到最高峰。当酶解时间延长至3.5 h时,AAP提取率下降,在3.5~5.0 h时出现一定的上升趋势并逐渐平稳。因此,选择3.0 h为最佳酶解时间。

2.1.3 温度对AAP提取率的影响

由图1-c可知,温度在40~50 ℃时,AAP提取率随着温度增加而升高,在50 ℃时达到最高峰;当温度大于50 ℃时,AAP提取率随着温度升高而降低。因此,选取50 ℃为最佳温度。

2.2 响应面法优化AAP

2.2.1 试验优化模型

在单因素结果的基础上,以液料比(A)、酶活时间(B)、温度(C)为试验条件,用Design-Expert V8.0.6 BoxBehnken进行响应面试验设计,表3为响应面优化模型结果。
表3 响应面优化模型结果

Table 3 Response surface optimization model results

项目
Items		 液料比
Liquid-solid
ratio (A)		 酶解时间
Enzymatic hydrolysis
time/h(B)		 温度
Temperature/
℃(C)		 AAP提取率
AAP extraction
rate/%
1 0 1 1 12.10
2 0 0 0 14.12
3 0 0 0 14.20
4 1 1 0 13.03
5 -1 0 -1 9.40
6 -1 0 1 11.73
7 0 1 -1 11.33
8 0 0 0 13.89
9 0 -1 -1 11.03
10 -1 -1 0 11.80
11 1 -1 0 12.65
12 0 -1 1 12.13
13 0 0 0 13.67
14 0 0 0 13.40
15 -1 1 0 12.07
16 1 0 -1 10.60
17 1 0 1 12.60

2.2.2 拟合模型分析

对表3的数据进行回归拟合分析,得到AAP提取率与各因素影响的二次方程:AAP提取率(%)=13.86+0.49A+0.12B+0.78C+0.027AB-0.083AC-0.083BC-1.02A2-0.45B2-1.76C2。表4为回归模型方差分析,当F=17.030时,P<0.01,表明该模型是极显著的。A差异显著(P<0.05),C、A2和C2差异极显著(P<0.01)。不同提取条件对AAP提取率的影响由大到小依次为:温度、液料比、酶解时间。失拟项P=0.206 6,失拟项不显著,说明该模型与试验拟合较好。
表4 回归模型方差分析

Table 4 Regression model analysis of variance

变异来源
Source of
variation		 平方和
Sum of
squares		 自由度
Degree of
freedom		 均方
Mean square		 F值
F-value		 P值
P-value		 显著性
Significant
模型Model 26.590 9 26.590 17.030 0.000 6 **
A 1.880 1 1.880 10.840 0.013 2 *
B 0.110 1 0.110 0.610 0.460 5
C 4.800 1 4.800 27.690 0.001 2 **
AB 0.003 1 0.003 0.017 0.898 7
AC 0.027 1 0.027 0.160 0.703 8
BC 0.027 1 0.027 0.160 0.703 8
A2 4.350 1 4.350 25.080 0.001 6 **
B2 0.860 1 0.860 4.950 0.061 4
C2 12.990 1 12.990 74.890 <0.000 1 **
残差Residual 1.210 7 0.170
失拟项Omission item 0.780 3 0.260 2.420 0.206 6
纯误差Pure error 0.430 4 0.110
总离差Total dispersion 27.810 16
R2=0.956 3 R2adj=0.900 2

A:液料比;B:酶活时间;C:温度。*表示显著(P<0.05),**表示极显著(P<0.01)。R2表示决定系数,R2adj表示调整后的决定系数。

A: liquid-liquid ratio; B: enzymatic hydrolysis time; C: temperature. * indicated significant (P<0.05), and ** indicated extremely significant (P<0.01). R2 indicated the coefficient of determination, and R2adj indicated the adjusted coefficient of determination.

2.2.3 因素交互作用分析

利用响应面三维立体图分析各因素间的交互作用,各提取条件对响应值的影响如图2~图4,图3与图4的3D曲面图与图2相比较陡,但无显著差异(P>0.05)。如图2-a、图3-a和图4-a所示,等高线为椭圆形与表4所得结果一致,各条件之间交互作用均不显著(P>0.05)。
图2 液料比与酶解时间交互作用的等高线图(a)和响应面图(b)

Fig.2 Contour plot (a) and response surface plot (b) of interaction between liquid-feed ratio and enzymatic hydrolysis time

图3 液料比与温度交互作用的等高线图(a)和响应面图(b)

Fig.3 Contour plot (a) and response surface plot (b) of interaction between liquid-feed ratio and temperature

图4 酶解时间与温度交互作用的等高线图(a)和响应面图(b)

Fig.4 Contour plot (a) and response surface plot (b) of interaction between enzymatic hydrolysis time and temperature

2.2.4 提取工艺优化验证

根据DesignExpert 8.0.6分析得到AAP的最佳提取条件为:液料比35∶1、酶解时间4 h、温度50 ℃。对上述提取条件下进行重复试验验证,其平均AAP提取率为12.46%(n=3),与理论预测值(12.27%)基本吻合,说明通过响应面优化后所得参数可靠,该模型具有一定的实际操作价值。

2.3 可溶性总糖含量

利用苯酚-硫酸分光光度法计算AAP中可溶性总糖含量为297.11 mg/g,纯化后总糖纯度大于70%。

2.4 纯化AAP组分检测

2.4.1 扫描电镜分析AAP-Ⅱ外貌

从图5可以看出,在放大倍率为5 000倍的条件下,观察到该AAP-Ⅱ样本表面粗糙,呈现出立方体状颗粒、长链片状、圆球状等多种不规则块状形态。
图5 不同放大倍率下艾蒿多糖的电镜扫描图

Fig.5 Electron microscopy scanning image of AAP at different magnification ratios

a:1 000×;b:5 000×;c:10 000×。

2.4.2 紫外全波长扫描分析

从图6可以看出,与水空白相比,AAP-Ⅱ在波长为200~400 nm内有显著吸收,表明样品中含有少量色素、蛋白质和核酸等杂质,但含量较低,说明去蛋白质效果较好。
图6 AAP-Ⅱ的紫外吸收光谱曲线

Fig.6 AAP-Ⅱ ultraviolet absorption spectrum curve

2.4.3 单糖组成和分子质量分析

根据图7和图8的标准曲线信息和峰面积,计算AAP-Ⅱ的单糖组成,主要包括阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖,其分子质量比为1.68∶3.54∶80.81∶2.38∶11.59。
图7 标准品离子色谱图

Fuc:岩藻糖 fucose;Rha:鼠李糖 rhamnose;Ara:阿拉伯糖 arabinose;Gal:半乳糖 galactose;Glc:葡萄糖 glucose;Xyl:木糖 xylose;Man:甘露糖 mannose;Fru:果糖 fructose;Rib:核糖 ribose;Gal-UA:半乳糖醛酸 galacturonic acid;Glc-UA:葡萄糖醛酸 glucuronic acid;Man-UA:甘露糖醛酸 mannuronic acid;Gul-UA:古罗糖醛酸 guluronic acid。图8同 the same as Fig.8.

Fig.7 Standard ion chromatograms

图8 AAP-Ⅱ的离子色谱图

Fig.8 AAP-Ⅱ ion chromatograms

从图9可以看出,AAP-Ⅱ的出峰时间在31~37 min,出现最高峰在34~36 min,并根据马克·霍温克方程(Mark-Houwink equation)计算出每个组分对应的分子质量为:Mn:44.266 ku,R=62.398;Mp:21.208 ku;Mw:67.393 ku,R=84.383;Mz:114.786 ku;Mw/Mn为1.522。
图9 AAP-Ⅱ绝对分子质量分析图

Fig.9 Plot of AAP-Ⅱ absolute molecular weight analysis

2.4.4 傅里叶变换红外光谱扫描分析

从图10可以看出,吸收带在3 600~3 200 cm-1是-OH的伸缩振动吸收峰,这个区域的吸收峰是糖类的特征峰。3 418.58 cm-1是O—H的伸缩振动吸收峰,是糖类的特征峰。在2 934.58cm-1处的吸收峰归属于C—H伸缩振动。在1 069.57cm-1处有1个吸收峰,归属于吡喃环(1 100~1 010cm-1)C—O的伸缩振动对应吸收峰,表明AAP-Ⅱ属于吡喃糖,也属于C—H、C—O和O—H的多糖特异性基团。
图10 AAP-Ⅱ的红外光谱分析图

Fig.10 AAP-Ⅱ infrared spectrum analysis

2.5 AAP的体外抗氧化活性测定

2.5.1 AAP对DPPH·的清除能力

如表5所示,不同浓度的AAP组和阳性对照组的DPPH·清除率随浓度的增加而增强,但差异均不显著(P>0.05)。相同浓度下,AAP组的DPPH·清除率在0.05~1.00 mg/mL浓度下均极显著低于阳性对照组(P<0.01)。AAP的IC50为0.055 2 mg/mL,AAP具有一定的DPPH·清除能力。
表5 艾蒿多糖体外抗氧化活性测定结果

Table 5 Results of in vitro antioxidant activity of AAP

项目
Items		 组别
Groups		 样品浓度Sample concentration/(mg/mL) P值
P-value
0.05 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00
1,1-二苯基-2-三
硝基苯肼自由基
DPPH·/%		 AAP 49.79±1.34B 52.77±3.34B 54.51±3.28B 55.74±1.33B 55.81±2.59B 56.42±0.95B 0.112
VC 92.62±7.05A 93.92±2.28A 96.14±3.77A 96.09±1.89A 94.40±2.16A 98.29±2.20A 0.709
羟自由基
·OH/%		 AAP 27.58±8.13d 31.56±6.39d 40.77±8.47cB 47.62±5.45bB 41.62±0.63cB 59.93±2.19aB 0.002
VC 16.74±5.39c 52.23±9.17b 100.11±0.30aA 100.28±0.29aA 99.97±0.09aA 100.01±0.30aA <0.001
超氧阴离子自由基
O 2 -·/%		 AAP 2.47±0.79e 9.21±2.85dB 26.76±4.05cB 33.35±1.54bB 47.03±4.54aB 45.03±3.65aB <0.001
VC 6.51±2.05d 42.51±9.68cA 59.05±3.35bA 74.58±1.71aA 78.13±3.44aA 63.33±0.39bA <0.001
铁还原力
Iron reducing power		 AAP 0.13±0.03dB 0.25±0.03cB 0.26±0.02cB 0.39±0.02bB 0.50±0.03aB 0.55±0.00aB <0.001
VC 0.45±0.03cA 1.02±0.05bA 1.95±0.02aA 1.94±0.01aA 1.93±0.05aA 1.97±0.02aA <0.001

AAP:AAP组;VC:阳性对照组。同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同或无小写字母表示差异不显著(P>0.05)。同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01),无字母表示差异不显著(P>0.05)。

AAP: AAP groups; VC: positive control group. In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). In the same column, values with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), while with no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

2.5.2 AAP对·OH的清除能力

如表5所示,0.40、0.60、0.80和1.00 mg/mL的AAP组和阳性对照组的·OH清除率显著高于0.05和0.20 mg/mL的AAP组和阳性对照组(P<0.05)。相同浓度下,AAP组的·OH清除率在0.40~1.00 mg/mL浓度下极显著低于阳性对照组(P<0.01)。AAP的IC50为0.868 4 mg/mL,AAP具有一定的·OH清除能力。

2.5.3 AAP对$\mathrm{O}_{2}^{-} \cdot$的清除能力

如表5所示,0.40、0.60、0.80和1.00 mg/mL的AAP组和阳性对照组的 O 2 -·清除率显著高于0.05和0.20 mg/mL的AAP组和阳性对照组(P<0.05)。同浓度下,AAP组的 O 2 -·清除率在0.20~1.00 mg/mL浓度下极显著低于阳性对照组(P<0.01)。AAP的IC50为0.839 2 mg/mL,AAP具有一定的 O 2 -·清除能力和抗氧化活性。

2.5.4 AAP的铁还原力

如表5所示,0.60、0.80和1.00 mg/mL的AAP组和阳性对照组的铁还原力显著高于0.05和0.20 mg/mL的AAP组和阳性对照组(P<0.05)。相同浓度下,AAP组的铁还原力在0.05~1.00 mg/mL浓度下均极显著低于阳性对照组(P<0.01)。AAP具有一定的铁还原能力。

3 讨论

不同提取方法对AAP进行提取所得成分和提取率均不同。研究表明,利用超声波提取工艺提取AAP的提取率为6.44%[19];利用水蒸汽蒸馏法对艾叶多糖进行提取,提取率为2.72%[20];利用超声波-酶法对艾叶多糖进行提取,提取率为1.72%[21]。本试验选用酶解醇沉法,以液料比、酶解时间和温度为提取条件,以AAP提取率为响应值,进行AAP响应面优化试验,得出最佳提取工艺。通过响应面法可以实现提取工艺参数优化,利用影响因素之间的交互作用,以图形方式展示自变量与因变量之间的函数关系,使数据更加直观明确[11]。本试验结果表明,响应面优化后AAP的平均提取率为12.46%。据报道,传统水浸提艾叶多糖提取率仅为3.02%[22],而本课题组前期研究中测得的最高提取率也只是10.19%[23],所以本试验所得的AAP的平均提取率为目前文献报道AAP提取工艺方面较高的,为实现工业化大规模生产AAP饲料添加剂提供参考依据。
在多糖提取过程中,由于原料中可能含有蛋白质、色素及其他小分子物质,因此需要纯化除杂提高总糖含量[24]。本研究采用苯酚-硫酸法测得AAP中可溶性多糖含量为297.11 mg/g,经分离纯化后的AAP-Ⅱ的可溶性多糖总纯度大于700 mg/g。这一结果与Zhang等[25]和张凌会[1]的研究相吻合,他们检测到多糖分离纯化后的主要多糖组分(水洗组分)含量较高(51.8%和76.2%)。这说明多糖分离纯化后能有效去除粗多糖中的蛋白质、色素及其他小分子物质,提高总糖含量。此外,AAP的多糖含量存在一定差异,这可能与其单糖组成和分子质量有关。本试验进一步分析了除杂后AAP-Ⅱ的单糖组成,发现其由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖组成,分子质量比为1.68∶3.54∶80.81∶2.38∶11.59,其中葡萄糖是占比最高;Mz为114.786 ku,Mw/Mn为1.522。前人研究发现艾叶多糖各单糖组成的摩尔比中葡萄糖占比也是最高;其中Mw、Mn和Mw/Mn分别为5.41 ku、4.63 ku和1.168[26]。张凌会[1]研究表明,AAP、AAP-Ⅰ分别所含的单糖主要由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖组成;AAP的Mz为16 ku,纯化后AAP-Ⅰ的Mz为18 ku。由上述结果表明,AAP是一种均一性多糖,其生物活性与分子质量、单糖组成等因素密切相关。尽管不同AAP之间存在一定的差异,但它们的单糖组成基本一致,并且多糖的分子质量越大,其抗氧化和免疫刺激活性越强[25]。
本试验通过扫描电镜观察发现,AAP表面结构粗糙,在低倍电镜下,呈现出松散海绵絮状结构且有大量的空洞;高倍镜下,AAP-Ⅱ呈现出立方体状颗粒、长链片状、圆球状等多种不规则块状形态,这与张凌会[1]的AAP电镜扫描结果相似。还通过紫外全波长扫描分析发现,AAP-Ⅱ在200~400 nm出现较小的吸收峰,表明AAP中可能含有少量色素、核酸和蛋白质等杂质[27],但整体含量较低,说明去蛋白效果较好。另外红外光谱分析AAP-Ⅱ发现,在O—H、C—H和O—H处有伸缩振动的吸收峰,所以AAP-Ⅱ属于C—H、C—O和O—H的多糖特异性基团。有报道称表明,1 100-1 010 cm-1处的吸收峰为吡喃环C—O的伸缩振动[28]。因此,AAP-Ⅱ在1 069.57 cm-1处强吸收峰可能是糖基残吡喃环基归属于C—O的伸缩振动对应吸收峰的伸缩振动,从而初步推测AAP-Ⅱ为一种吡喃糖。
本实验室在研究不同蒿属植物对畜禽抗氧化活性的影响方面已取得一定成果。研究表明,饲粮中添加适宜的艾蒿水提物(AAE)可显著提高肉仔鸡的抗氧化能力[29-30],AAE中所含的多糖在肉仔鸡中也发挥着抗氧化、免疫和抗炎活性作用[31]。张凌会[1]研究表明,AAP不仅能促进肉仔鸡的生长,改善其免疫和抗氧化功能,而且肉仔鸡的免疫和抗氧化功能在AAP诱导的Toll样受体(TLR)/核因子-κB(NF-κB)信号通路调控下有一定程度的增强。本试验检测AAP体外抗氧化活性发现,AAP对DPPH·清除能力随浓度的增加呈缓慢增强趋势,其清除能力(IC50=0.055 2 mg/mL)比AAE(IC50=0.102 0 mg/mL)高约200倍,比代代花(IC50=0.692 2 mg/mL)和白扁豆花(IC50=0.701 5 mg/mL)高约140倍[11,32];但是AAP对DPPH·清除率低于黄花蒿多糖[33]。IC50越低,则清除率越高[16],表明AAP具有一定DPPH·清除能力,且清除能力略强。随着AAP溶液浓度的增加,AAP对·OH和 O 2 -·的清除率也随浓度逐渐增加,与枸杞多糖对·OH和 O 2 -·清除能力非常相似,其清除率优于传统水提法所得AAP的清除率[7],仍然高于AAE的清除能力(IC50=0.311 0 mg/mL);AAP在0.4 mg/mL时的 O 2 -·清除率与5月份采收的黄花蒿多糖0.5 g/L(清除率=20.91%)的相近[33],表明AAP具有较强的·OH和 O 2 -·清除率能力,且略高于普通水提法的AAP和AAE的清除率。铁还原力与AAP浓度呈正相关,本试验中1.0 mg/mL时AA的铁离子还原力与0.16 mg/mL时AEE相当,且与AAE的铁还原力趋势相似,远弱于黑沙蒿水提物和水芹菜多糖铁还原力[34-35],表明AAP具有一定的铁还原能力,但相对微弱。因此,AAP具有一定的抗氧化活性。

4 结论

本研究通过响应面法优化AAP提取工艺,得出最佳提取条件为:液料比35∶1、温度50 ℃、酶解时间4 h,此条件下的AAP提取率为12.46%,可溶性多糖含量为297.11 mg/g。纯化后AAP呈不规则块状聚集,葡萄糖分子占比最高,属于吡喃糖。此外,体外抗氧化试验表明铁还原力与AAP浓度呈正相关,且AAP对DPPH·、·OH和 O 2 -·有较强的清除作用。由此可见,AAP可作为天然抗氧化剂应用于食品、饲料和医药工业中,具有广泛潜在价值。

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