Chinese Journal of Animal Nutrition >

2025 , Vol. 37 >Issue 2: 1340 - 1353

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.115

RESEARCH PAPER

In Vitro Probiotic Properties and Antioxidant Activity of Lactobacillus crispatus DY38 from Goats

  • XIAO Chunjin , 1 ,
  • YUE Xiuying 2 ,
  • WU Xiaolan 2 ,
  • YE Zhongming 3 ,
  • YANG Falong , 1, *
Expand
  • 1 College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China
  • 2 Sichuan Veterinary Drug Inspection Institute, Chengdu 610041, China
  • 3 Animal Husbandry Science Research Institute of Ganzi Tibetan Autonomous Prefecture, Kangding 626000, China
*professor, E-mail:

Received date: 2024-07-12

  Online published: 2025-02-16

Fold

Abstract

This study aimed to investigate the in vitro probiotic properties and antioxidant activity of Lactobacillus crispatus DY38 from goats, providing a foundation for its development as a probiotic supplement for goats. The acid production ability, antibacterial ability, acid and bile salt tolerance, cell adhesion property, and antioxidant capacity of the Lactobacillus crispatus DY38 from goats were measured to evaluate its probiotic properties and antioxidant activity. The results showed as follows: 1) Lactobacillus crispatus DY38 from goats exhibited strong inhibitory effects against pathogenic Escherichia coli, Salmonella enteritis and Clostridium perfringens isolated from goats; 2) the survival rate of Lactobacillus crispatus DY38 from goats under pH 2.0 was 62.73%, and 66.85% in 0.3% bile salts, and it had good gastrointestinal tolerance; 3) it was sensitive to commonly used antibiotics and showed no hemolytic activity; 4) the auto-aggregation ability, co-aggregation ability and surface hydrophobicity of Lactobacillus crispatus DY38 from goats were 64.83%, 62.81% and 80.69%, respectively; 5) it exhibited strong adhesion to Caco-2 cells without cytolytic effect; 6) the intracellular extract of Lactobacillus crispatus DY38 from goats demonstrated strong superoxide anion radical scavenging ability, and its fermentation supernatant exhibited high 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical and hydroxyl radical scavenging ability, and high reducing capacity. These findings indicate that Lactobacillus crispatus DY38 from goats has good probiotic properties and potential for development as a probiotic supplement to prevent and treat diarrhea and other diseases in goats.

Key words： goats; Lactobacillus crispatus; probiotic properties; antioxidant

Cite this article

XIAO Chunjin , YUE Xiuying , WU Xiaolan , YE Zhongming , YANG Falong . In Vitro Probiotic Properties and Antioxidant Activity of Lactobacillus crispatus DY38 from Goats[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2025 , 37(2) : 1340 -1353 . DOI: 10.12418/CJAN2025.115

随着世界人口的增加,人们对动物蛋白质的需求也随之增大,肉类和乳品等的需求预计在2024年增长约70%以上[1]。羊肉和羊乳因其高蛋白质、低脂肪等优点深受消费者喜爱。因此,全球范围内肉羊养殖规模不断扩大[2]。但在规模化养殖中,由于细菌感染机会增加,特别是一线抗生素耐药的革兰氏阴性菌(如沙门氏菌、大肠杆菌等)的感染[3],导致肉羊发生腹泻、肠炎等疾病,甚至造成羔羊死亡,严重影响经济效益[4]。目前针对羊细菌性疾病,使用抗生素仍然是首选方法,而不合理使用抗生素会导致病原菌产生耐药性,并增加乳、肉产品中药物残留的风险[5]。因此,寻找抗生素替代品十分重要。在此背景下,益生菌、新型天然抗菌药物等“替抗”产品的开发和应用成为近年来畜禽养殖产业中的研究热点[6]。乳酸菌因具有良好稳定的益生特性而已成为目前使用最为广泛的饲用益生菌,在病害防控等方面倍受关注[7]。由于益生菌的治疗和应用效果会因为菌株宿主来源表现出明显的差异[8],挖掘新型本动物源的益生菌具有重要意义。
规模化肉羊养殖过程中,沙门氏菌等病原菌的感染十分普遍,其导致的疾病不断发生,开发应用于养羊业的微生态制剂十分必要且具有广泛的应用前景。本实验室前期在进行羊源益生菌的开发和利用研究期间,从山羊盲肠内容物中成功筛选出1株具有良好益生性能的卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)DY38。卷曲乳杆菌是一种革兰氏阳性的兼性厌氧益生菌,其在猪和鸡的生产养殖中应用较多,但在牛、羊等反刍动物中研究甚少[9-10]。本研究对该株羊源卷曲乳杆菌DY38的生物学特性进行分析,对其益生性能和抗氧化活性进行评价,旨在为该菌株的进一步开发和利用以及探索和研究防治肉羊腹泻疾病的新方法和新策略提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株及来源

羊源卷曲乳杆菌DY38分离自四川省某羊场大耳山羊的空肠内容物;山羊产肠毒素大肠杆菌SWUN3801、山羊肠炎沙门氏菌SWUN3802、山羊金黄色葡萄球菌SWUN3803和山羊A型产气荚膜梭菌SWUN3804、山羊B型产气荚膜梭菌SWUN3805和山羊D型产气荚膜梭菌SWUN3806均由西南民族大学动物医学四川省高校重点实验室分离、鉴定和保存。

1.1.2 指示菌及细胞系

肠炎沙门菌ATCC13076、大肠杆菌ATCC25922、产气荚膜梭菌ATCC13124和金黄色葡萄球菌ATCC25923由四川省兽药监察所提供。人克隆结肠腺癌细胞Caco-2购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 生长曲线及产酸能力测定

将羊源卷曲乳杆菌DY38划线接种于MRS琼脂上,挑取单菌落接种于MRS肉汤,37 ℃培养24 h,随后取菌液按照1%的量接入200 mL的MRS肉汤中,37 ℃培养,每间隔2 h取1次样,测定菌液在600 nm处的吸光度值,绘制生长曲线;同时,用酸度计测量pH,构建产酸曲线[11]。

1.2.2 抑菌能力评价

为了评价羊源卷曲乳杆菌DY38对4种指示菌(肠炎沙门氏菌ATCC13076、大肠杆菌ATCC25922、产气荚膜梭菌ATCC13124和金黄色葡萄球菌ATCC25923)和临床分离的6种病原菌(山羊产肠毒素大肠杆菌SWUN3801、山羊肠炎沙门氏菌SWUN3802、山羊金黄色葡萄球菌SWUN3803和山羊A型产气荚膜梭菌SWUN3804、山羊B型产气荚膜梭菌SWUN3805和山羊D型产气荚膜梭菌SWUN3806)的抑菌效果,首先,取羊源卷曲乳杆菌DY38菌液,10 000×g离心10 min,上清液用0.22 μm滤器过滤除菌后备用;随后,将指示菌和临床分离菌株悬液浓度调整至1×108 CFU/mL,分别取100 μL涂布于LB固体培养基上;将牛津杯轻置在LB固体培养基内,取200 μL上述制备的羊源卷曲乳杆菌DY38上清液加入牛津杯内,4 ℃条件下放置12 h;待上清液充分扩散后,于37 ℃恒温箱中培养24 h,测量抑菌圈直径[12]。试验重复3次。

1.2.3 抗生素敏感性试验

为了评价羊源卷曲乳杆菌DY38对抗生素的敏感性,从而评估其是否存在传播耐药基因的风险,以大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923为质控菌株,将羊源卷曲乳杆菌DY38和质控菌株分别在37 ℃培养12 h,将各培养液菌体浓度调整至1×108 CFU/mL,2株质控菌株分别取100 μL涂布在MH琼脂上,羊源卷曲乳杆菌DY38取100 μL涂布在MRS琼脂上,随后贴上药敏纸片,37 ℃培养24 h后,测量抑菌圈直径[13]。试验重复3次。

1.2.4 溶血性试验

为进一步评价羊源卷曲乳杆菌DY38的安全性,将其划线接种于血琼脂平板上,37 ℃培养24 h,以金黄色葡萄球菌ATCC25923为阳性对照菌株,观察是否有溶血现象[14]。

1.2.5 耐酸耐胆盐试验

分别用盐酸标准滴定液和牛胆盐将MRS肉汤调整成pH为2.0、3.0和0.3%胆盐浓度的MRS肉汤培养液,121 ℃高压灭菌15 min,待用。将羊源卷曲乳杆菌DY38接种于未添加胆盐和未进行酸处理的MRS肉汤中,37 ℃培养24 h,再将培养好的菌液按照1%的量分别接入pH为2.0、3.0和0.3%胆盐浓度的MRS肉汤中,上述MRS肉汤先在培养0 h后取样,随后在37 ℃恒温振荡培养3 h后取样,采用稀释涂布平板法计算活菌数。试验重复3次。按照式(1)计算细菌存活率,从而评价羊源卷曲乳杆菌DY38对酸或者胆盐的耐受性[15]。
存活率(%)=(C1/C2)×100。
式中:C1为在添加胆盐或进行酸处理MRS肉汤中培养3 h后所测得的活菌数(CFU/mL);C2为在添加胆盐或进行酸处理MRS肉汤中培养0 h后所测得的活菌数(CFU/mL)。

1.2.6 人工胃肠液耐受性试验

1.2.6.1 人工胃肠液制备

将0.32%的胃蛋白酶、0.18%的NaCl加入至10 mL灭菌磷酸盐缓冲溶液(PBS)中,用盐酸标准滴定液将PBS的pH调至2.5,制成人工胃液,过滤除菌备用。
将1%的胰蛋白酶、0.68%的KH2PO4加入至10 mL的无菌PBS中,用氢氧化钠标准滴定液将PBS的pH调至7.5,制成人工肠液,过滤除菌备用。

1.2.6.2 人工胃肠液耐受性测定

参照Nikolic等[16]的方法,略作修改。取羊源卷曲乳杆菌DY38菌液按照1%的量接入10 mL的MRS肉汤中,37 ℃培养24 h后,10 000×g离心10 min,弃上清,加入10 mL灭菌PBS,混匀制成菌悬液;取1 mL菌悬液于9 mL人工胃液中混匀,先在0 h取样,随后在37 ℃恒温振荡培养3 h后取样,采用稀释涂布平板法计算活菌数。在羊源卷曲乳杆菌DY38于人工胃液中培养3 h时,取1 mL接种至人工肠液中混匀(此时是人工肠液的0 h),先在0 h取样,随后在37 ℃恒温振荡培养3 h后取样,采用稀释涂布平板法计算活菌数。试验重复3次。按照式(2)计算羊源卷曲乳杆菌DY38在人工胃液和人工肠液中的存活率。
存活率(%)=(人工胃液或人工肠液中培养3 h后测得的活菌数/人工胃液或人工肠液中培养0 h后测得的活菌数)×100。

1.2.7 表面疏水性试验

参照Rosenberg等[17]的方法,略作修改。将羊源卷曲乳杆菌DY38划线接种于MRS琼脂上,挑取单菌落接种于MRS肉汤,37 ℃培养24 h,取菌液按照1%的量接入10 mL的MRS肉汤中,37 ℃培养24 h,10 000×g离心10 min,弃上清后收集菌体,用无菌PBS洗涤菌体3次,并调整菌液浓度为1×108 CFU/mL,在600 nm处测定吸光度值;取2 mL菌悬液,加入相同体积的二甲苯,涡旋3 min后混匀,室温静置1 h,吸取下层水相后,在600 nm处测定吸光度值。试验重复3次。按照式(3)计算表面疏水性。
表面疏水性(%)=[(A0-A)/A]×100。
式中:A0为加入二甲苯萃取前的菌液吸光度值;A为加入二甲苯萃取后的下层水相吸光度值。

1.2.8 自聚集试验

参照Collado等[18]的方法进行。采用与1.2.7相同的方法,用无菌PBS制备浓度为1×108 CFU/mL的羊源卷曲乳杆菌DY38菌悬液;取6 mL菌悬液静置于37 ℃的恒温箱中培养,分别在0和3 h时取样,在600 nm处测定吸光度值。试验重复3次。按照式(4)计算自聚集能力。
自聚集能力(%)=[(A0-At)/A0]×100。
式中:A0为0 h下的吸光度值;At为3 h下的吸光度值。

1.2.9 共聚集试验

参照Del Re等[19]的方法进行。采用与1.2.7相同的方法,用无菌PBS制备浓度为1×108 CFU/mL的羊源卷曲乳杆菌DY38菌悬液,在600 nm处测定吸光度值;将山羊肠炎沙门氏菌SWUN3802作为指示菌,在600 nm处测定吸光度值;取羊源卷曲乳杆菌DY38菌悬液和指示菌菌液各2 mL,混匀后37 ℃培养5 h,在600 nm处测定吸光度值。试验重复3次。按照式(5)计算共聚集能力。
共聚集能力(%)={[(A2+A3)/2-A(2+3)]/(A2+A3)}×100。
式中:A2为羊源卷曲乳杆菌DY38菌悬液的吸光度值;A3为指示菌菌悬液的吸光度值;A(2+3)为混合菌悬液的吸光度值。

1.2.10 对Caco-2细胞的黏附性能试验

采用与1.2.7相同的方法,用无菌PBS制备浓度为1×108 CFU/mL的羊源卷曲乳杆菌DY38菌悬液,待用。对Caco-2细胞的黏附性能试验在6孔细胞培养板中进行,即将灭菌后的细胞爬片放至6孔板中,按1×105个/mL的浓度将Caco-2细胞接种到6孔板中,于37 ℃和5% CO2条件下培养,隔天更换培养液1次,待细胞长至单层,用无菌PBS洗涤3次,第1孔用胰酶消化,并用血球计数板法计算细胞浓度[20];另外孔中加入先前制备好的1×108 CFU/mL的羊源卷曲乳杆菌DY38菌悬液和不完全DMEM培养基各0.5 mL,孵育2 h,用灭菌PBS洗涤5次,除去未黏附的细菌,取1 mL 1% Triton X-100裂解细胞10 min,采用稀释涂布平板法计算黏附的活菌数,并按照式(6)计算细菌黏附数。将细胞爬片从6孔板中取出,用0.4%的多聚甲醛固定20 min,自然晾干后,使用增强革兰氏染色液进行染色,在光学显微镜下观察羊源卷曲乳杆菌DY38对Caco-2细胞的黏附情况[21]。试验重复3次。
黏附数(CFU/个Caco-2细胞)=黏附细胞数(CFU/孔)/Caco-2细胞数/(个/孔)。

1.2.11 细胞毒性试验

将羊源卷曲乳杆菌DY38和肠炎沙门氏菌SWUN3802划线后,分别挑取单菌落接种于MRS和TSB肉汤,37 ℃培养24 h,10 000×g离心10 min。收集菌体后用无菌PBS洗涤3次,最后重悬于无菌PBS中,分别调节羊源卷曲乳杆菌DY38和肠炎沙门氏菌SWUN3802的菌悬液浓度为1×108 CFU/mL,待用。按1×105个/mL的浓度将Caco-2细胞接种到96孔板中,在37 ℃和5% CO2条件下培养,隔天更换培养液1次,待细胞长至单层,用无菌PBS洗涤3次,分别加入上述制备好的羊源卷曲乳杆菌DY38、肠炎沙门氏菌SWUN3802菌悬液和不完全DMEM培养基各100 μL,孵育2 h,加入CCK-8试剂分别孵育2、4、6、8和12 h[22],分别在450和630 nm处测定96孔板中液体的吸光度值,具体操作参照CCK-8试剂说明书,按照式(7)计算细菌黏附的Caco-2细胞活力。试验重复3次。
Caco-2细胞活力(%)=[OD(加菌孔)630 nm-OD(加菌孔)450 nm-OD(无细胞孔)空白]/[OD(未加菌孔)630 nm-OD(未加菌孔)450 nm-OD(无细胞孔)空白]×100。

1.2.12 羊源卷曲乳杆菌DY38抗氧化试验

1.2.12.1 菌悬液、胞内提取物及发酵上清液的制备

将羊源卷曲乳杆菌DY38划线接种于MRS琼脂上,挑取单菌落接种于MRS肉汤,37 ℃培养24 h,取羊源卷曲乳杆菌DY38株菌液按照1%的量接入10 mL的MRS肉汤中,37 ℃培养24 h,10 000×g离心10 min,分别收集上清液和菌体。上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后得到发酵上清液。所得的菌体用无菌PBS洗涤3次,并调整菌悬液浓度为1×108 CFU/mL,将其平均分为2份,一份作为菌悬液;另一份冰浴条件下超声破碎(300 W,超声5 s,间隔5 s,共15 min),10 000×g离心15 min,0.22 μm微孔滤膜过滤,收集上清液,得到胞内提取物。

1.2.12.2 2,2-二苯基-1-苦酰肼(DPPH)自由基清除能力测定

参照Lin等[23]的方法,对羊源卷曲乳杆菌DY38的DPPH自由基清除能力进行测定。准确称取7.8 mg DPPH溶于无水乙醇,定容至100 mL,配制成0.2 mmol/L的DPPH溶液。吸取羊源卷曲乳杆菌DY38的菌悬液、胞内提取物或发酵上清液1 mL,加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH,在室温下避光反应30 min,在4 ℃条件下10 000×g离心10 min。在517 nm处测定吸光度值。试验重复3次。按照式(8)计算DPPH自由基清除率。
DPPH自由基清除率={[1-(A1-A0)]/A2}×100。
式中:A1为1 mL样品(菌悬液、胞内提取物或发酵上清液)+1 mL DPPH溶液的吸光度值;A2为1 mL样品+1 mL无水乙醇的吸光度值;A0为1 mL样品+1 mL PBS的吸光度值。

1.2.12.3 羟自由基(·OH)清除能力测定

参照He等[24]的方法,对羊源卷曲乳杆菌DY38的羟基自由基清除能力进行测定。反应液混合物包括羊源卷曲乳杆菌DY38的菌悬液、胞内提取物或发酵上清液0.5 mL,1 mL 0.1%邻-菲罗琳,1 mL无菌PBS,0.5 mL无菌超纯水,1 mL 2.5 mmol/L FeSO4,1 mL 20 mmol/L H2O2,混匀,37 ℃恒温孵育1.5 h。在536 nm处测定吸光度值,可反映出各组分对此氧化还原反应的抑制程度。试验重复3次。按照式(9)计算羟自由基清除率。
羟自由基清除率(%)={[1-(A3-A4)]/(A5-A4)}×100 。
式中:A3为样品(菌悬液、胞内提取物或发酵上清液)反应液混合物的吸光度值;A4为将反应液混合物中的H2O2更换成同体积无菌超纯蒸馏水的吸光度值;A5为将样品(菌悬液、胞内提取物或发酵上清液)更换成同体积无菌超纯蒸馏水的反应液混合物吸光度值。

1.2.12.4 超氧阴离子自由基(O2-·)清除能力测定

参照Liu等[25]的方法,对羊源卷曲乳杆菌DY38的超氧阴离子自由基清除能力进行测定。在25 ℃分别水浴0.05 mol/L Tris-HCl、羊源卷曲乳杆菌DY38各组分(菌悬液、胞内提取物、发酵上清液)、无菌PBS和0.05 mmol/L的邻苯三酚20 min。将0.1 mL羊源卷曲乳杆菌DY38的样液(菌悬液、胞内提取物或发酵上清液)或0.1 mL无菌PBS,2.8 mL Tris-HCl缓冲液和0.1 mL的邻苯三酚混匀,在25 ℃下避光反应4 min。在536 nm处测量各反应液吸光度值,检测各组分对邻苯三酚自氧化能力的抑制程度,即对超氧阴离子自由基的清除能力。试验重复3次。按照式(10)计算超氧阴离子自由基清除率。
超氧阴离子自由基清除率(%)=[(A参-A样)/A参]×100。
式中:A样为2.8 mL Tris-HCl缓冲液+0.1 mL样液+0.1 mL邻苯三酚反应4 min后的吸光度值;A参为2.8 mL Tris-HCl缓冲液+0.1 mL样液+0.1 mL无菌PBS反应4 min后的吸光度值。

1.2.12.5 还原能力测定

参照Lin等[26]的方法,测定羊源卷曲乳杆菌DY38的还原能力。取0.5 mL 1% 铁氰化钾,0.5 mL羊源卷曲乳杆菌DY38的菌悬液、胞内提取物或发酵上清液,0.5 mL无菌PBS,混匀后置于50 ℃水浴20 min,冰浴急速冷却;加入0.5 mL 10%三氯乙酸,10 000×g离心10 min。吸取1 mL各反应液的上清液,在上清液中加入1 mL 0.1% FeCl3溶液或1 mL 超纯蒸馏水后,与超纯蒸馏水等体积混合均匀,静置10 min。在700 nm处测定各反应液的吸光度值。羊源卷曲乳杆菌DY38各组分将Fe[(CN)6]3还原为Fe[CN)6]2的能力可反映其还原能力。试验重复3次。按式(11)计算还原能力。
还原能力(%)={[1-(A样-A参)]/A参}×100 。
式中:A样为加入1 mL 0.1% FeCl3静置10 min后各组分反应液的吸光度值;A参为加入1 mL超纯蒸馏水静置10 min后各组分反应液的吸光度值。

1.3 数据统计与分析

试验数据以平均值±标准差表示,采用SPSS 25.0统计软件对细胞活力数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)后执行Dunnett多项比较检验,P<0.05表示差异显著。采用GraphPad Prism version 10.0.0作图。

2 结果

2.1 羊源卷曲乳杆菌DY38的生长曲线及产酸性能

将羊源卷曲乳杆菌DY38接种至MRS培养液后,测定不同时间点菌液的吸光度值和pH,绘制生长曲线和产酸曲线,结果如图1所示。由图1可知,羊源卷曲乳杆菌DY38在0~4 h时为迟缓期,4~16 h时对数生长期,16 h时为达到稳定期;刚接种羊源卷曲乳杆菌DY38时,MRS培养液的pH是6.8,2 h时培养液的pH明显下降,在6~14 h期间pH迅速下降,在16~22 h趋于平稳,至24 h时,pH为4.32,这说明羊源卷曲乳杆菌DY38产酸性能良好。
图1 羊源卷曲乳杆菌DY38的生长曲线及产酸曲线

Fig.1 Growth curve and acid production curve of Lactobacillus crispatus DY38 from goats

2.2 羊源卷曲乳杆菌DY38对病原菌的抑制效果

如表1和表2所示,羊源卷曲乳杆菌DY38对4种指示菌和临床分离的6种山羊源病原菌均具有良好的抑菌活性,初步说明该菌株对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较强的抑制能力。
表1 羊源卷曲乳杆菌DY38对指示菌的抑制效果

Table 1 Inhibitory effect of Lactobacillus crispatus DY38 from goats on indicator bacteria

指示菌
Indicator bacteria		 抑菌圈直径
Inhibition zone diameter/mm		 抑菌效果
Antibacterial effect
大肠杆菌ATCC25922 Escherichia coli ATCC25922 24.26±0.35 +++
沙门氏菌ATCC13076 Salmonella enteritidis ATCC13076 21.22±0.21 +++
金黄色葡萄球菌ATCC25923 Staphylococcus aureus ATCC25923 22.23±0.25 +++
产气荚膜梭菌ATCC13124 Clostridium perfringens ATCC13124 33.14±0.23 +++

+++:抑菌效果较强。表2同。

+++: the antibacterial effect is stronger. The same as Table 2.

表2 羊源卷曲乳杆菌DY38对山羊源致病菌临床分离株的抑制效果

Table 2 Inhibitory effect of Lactobacillus crispatus DY38 from goats on clinical isolates of pathogenic strains in goats

临床分离株
Clinical isolates		 抑菌圈直径
Inhibition zone diameter/mm		 抑菌效果
Antibacterial effect
山羊产肠毒素大肠杆菌SWUN3801
Enterotoxin-producing Escherichia coli SWUN3801 of goats		 25.12±0.23 +++
山羊肠炎沙门氏菌SWUN3802
Salmonella enteritidis SWUN3802 of goats		 28.28±0.31 +++
山羊金黄色葡萄球SWUN3803
Staphylococcus aureus SWUN3803 of goats		 22.18±0.28 +++
山羊A型产气荚膜梭菌SWUN3804
Clostridium perfringens type A SWUN3804 of goats		 32.15±0.22 +++
山羊B型产气荚膜梭菌SWUN3805
Clostridium perfringens type B SWUN3805 of goats		 35.16±0.27 +++
山羊D型产气荚膜梭菌SWUN3806
Clostridium perfringens type D SWUN3806 of goats		 34.13±0.24 +++

2.3 羊源卷曲乳杆菌DY38对抗生素的敏感性

根据美国临床标准委员会(NCCLS)推荐的K-B纸片扩散法检测羊源卷曲乳杆菌DY38对多种药物的敏感性,结果如表3所示,羊源卷曲乳杆菌DY38对常用的8种常用抗生素敏感。
表3 羊源卷曲乳杆菌DY38对抗生素的敏感性

Table 3 Antibiotic susceptibility of Lactobacillus crispatus DY38 from goats mm

抗生素
Antibiotics		 抑菌圈直径Inhibition zone diameter
羊源卷曲乳杆菌DY38
Lactobacillus crispatus
DY38 from goats		 大肠杆菌ATCC25922
Escherichia coli ATCC25922		 金黄色葡萄球菌ATCC25923
Staphylococcus aureus
ATCC25923
氯霉素Chloromycetin 33.80±0.69(S) 22.38±0.66(S) 25.04±0.14(S)
四环素Tetracycline 32.04±0.88(S) 28.84±0.50(S) 31.17±0.79(S)
红霉素Erythromycin 27.96±0.68(S) 19.47±0.84(S) 22.53±0.92(S)
头孢曲松Ceftriaxone 29.11±0.22(S) 23.20±0.45(S) 20.16±0.76(S)
阿莫西林Amoxicillin 33.13±0.45(S) 18.91±0.41(S) 22.69±0.40(S)
氨苄西林Ampicillin 31.03±0.64(S) 20.89±0.50(S) 25.75±0.60(S)
米诺环素Minocycline 35.13±0.90(S) 28.11±0.14(S) 24.98±0.56(S)
利福平Rifampicin 21.95±0.77(S) 20.95±0.75(S) 20.22±0.35(S)

S:敏感 sensitivity。

2.4 羊源卷曲乳杆菌DY38的溶血性

羊源卷曲乳杆菌DY38经血琼脂平板划线接种后,未在血平板上出现溶血圈(图2-A),对照菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923有溶血现象(图2-B)。
图2 羊源卷曲乳杆菌DY38(A)和金黄色葡萄球菌ATCC25923(B)的溶血性

Fig.2 Haemolytic activity of Lactobacillus crispatus DY38 from goats (A) and Staphylococcus aureus ATCC25923 (B)

2.5 羊源卷曲乳杆菌DY38对酸、胆盐及人工胃肠液的耐受性

为了验证羊源卷曲乳杆菌DY38的对人工胃肠液体环境下的耐受能力,对其对酸、胆盐及人工胃肠液的耐受性进行了分析,结果如表4所示。羊源卷曲乳杆菌DY38在pH为2.0和3.0的环境下有不同的耐受性,在pH 2.0条件下的存活率为62.73%,在pH 3.0条件下的存活率达到80.49%;羊源卷曲乳杆菌DY38在0.3%的胆盐浓度下培养3 h,其存活率为66.85%,在人工胃液中3 h的存活率为80.34%,在人工肠液中3 h的存活率为70.34%,说明羊源卷曲乳杆菌DY38对胃肠道环境的耐受性良好。
表4 羊源卷曲乳杆菌DY38对酸、胆盐及人工胃肠液的耐受性

Table 4 Tolerance of Lactobacillus crispatus DY38 from goats to acid, bile salts and artificial gastrointestinal fluid

条件
Conditions		 细菌浓度Bacterial concentration/(CFU/mL) 存活率
Survival rate/%
处理0 h Treated 0 h 处理3 h Treated 3 h
pH 2.0 (1.61±0.44)×108 (1.01±0.15)×108 62.73±0.86
pH 3.0 (1.64±0.58)×108 (1.32±0.25)×108 80.49±0.84
0.3%胆盐0.3% bile salts (1.81±0.50)×107 (1.21±0.30)×107 66.85±0.46
人工胃液Artificial gastric fluid (1.78±0.57)×108 (1.43±0.43)×108 80.34±0.26
人工肠液Artificial bowel fluid (1.18±0.62)×108 (0.83±0.23)×108 70.34±0.68

2.6 羊源卷曲乳杆菌DY38的自聚集能力、共聚集能力和表面疏水性

为了评价羊源卷曲乳杆菌DY38能否黏附于肠道发挥作用,对其进行自聚集能力、共聚集能力和表面疏水性分析,结果如表5所示。羊源卷曲乳杆菌DY38的自聚集能力为64.83%,共聚集能力为62.81%,表面疏水性为80.69%。上述结果初步说明羊源卷曲乳杆菌DY38的肠道黏附能力强,可能形成抑制病原体定植在宿主的屏障。
表5 羊源卷曲乳杆菌DY38的自聚集能力、共聚集能力和表面疏水性

Table 5 Auto-aggregation ability, co-aggregation ability and surface hydrophobicity of Lactobacillus crispatus DY38 from goats %

项目
Item		 自聚集能力
Auto-aggregation ability		 共聚集能力
Co-aggregation ability		 疏水性
Surface hydrophobicity
羊源卷曲乳杆菌DY38
Lactobacillus crispatus DY38 from goats		 64.83±0.17 62.81±0.38 80.69±0.43

2.7 羊源卷曲乳杆菌DY38对Caco-2细胞的黏附性能

对羊源卷曲乳杆菌DY38的细胞黏附性能试验结果见图3。羊源卷曲乳杆菌DY38可黏附于Caco-2细胞(图3-A),经平板计数,每个Caco-2细胞黏附的细菌数平均为(20.23±1.63)CFU,说明其具有较强的黏附能力。Caco-2细胞与羊源卷曲乳杆菌DY38共培养24 h后,与未与羊源卷曲乳杆菌DY38共培养的Caco-2细胞(图3-B)相比,Caco-2细胞形态均正常,无裂解现象。
图3 羊源卷曲乳杆菌DY38对Caco-2细胞的黏附性能

A:与羊源卷曲乳杆菌DY38共培养的Caco-2细胞(1 000×);B:未与羊源卷曲乳杆菌DY38共培养的Caco-2细胞(1 000×)。

Fig.3 Adhesion property of Lactobacillus crispatus DY38 from goats to Caco-2 cells

A: Caco-2 cells co-cultured with Lactobacillus crispatus DY38 form goats (1 000×); B: Caco-2 cells did not co-cultured with Lactobacillus crispatus DY38 from goats (1 000×).

2.8 羊源卷曲乳杆菌DY38的细胞毒性

为了验证羊源卷曲乳杆菌DY38是否有细胞毒性且能否拮抗肠炎沙门氏菌SWUN3802对细胞的破坏,进行了CCK-8细胞毒性试验。由表6可知,感染12 h后,肠炎沙门氏菌SWUN3802组Caco-2细胞活力为68.91%,羊源卷曲乳杆菌DY38组为95.38%,肠炎沙门氏菌SWUN3802+羊源卷曲乳杆菌DY38组为84.96%,且各组间差异显著(P<0.05)。上述结果说明羊源卷曲乳杆菌DY38无细胞毒性且在一定程度上能拮抗肠炎沙门氏菌SWUN3802对Caco-2细胞的破坏。
表6 感染羊源卷曲乳杆菌DY38和肠炎沙门氏菌SWUN3802后的Caco-2细胞活力

Table 6 Viability of Caco-2 cells after infected with Lactobacillus crispatus DY38 form goats and Salmonella enteritidis SWUN3802 %

感染菌株
Infected strains		 感染不同时间后Caco-2细胞活力
Viability of Caco-2 cells at different time after infection
2 h 4 h 6 h 8 h 12 h
肠炎沙门氏菌SWUN3802
Salmonella enteritidis SWUN3802		 85.04±0.36c 84.39±0.49c 78.89±0.12c 72.37±0.22c 68.91±0.38c
羊源卷曲乳杆菌DY38
Lactobacillus crispatus DY38 form goats		 98.66±0.13a 97.89±0.23a 95.88±0.32a 95.48±0.21a 95.38±0.15a
肠炎沙门氏菌SWUN3802+
羊源卷曲乳杆菌DY38
Salmonella enteritidis SWUN3802+
Lactobacillus crispatus DY38 form goats		 88.82±0.23b 87.91±0.21b 86.85±0.18b 85.38±0.16b 84.96±0.24b

同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Values in the same column with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

2.9 羊源卷曲乳杆菌DY38的抗氧化能力

由表7可知,羊源卷曲乳杆菌DY38的各组分均表现出一定的DPPH自由基清除能力,发酵上清液对DPPH自由基的清除率为89.43%,菌悬液及胞内提取物对DPPH自由基的清除率在11.52%~30.38%,各组分差异较大;羊源卷曲乳杆菌DY38的各组分均有一定的超氧阴离子自由基清除能力,其发酵上清液对超氧阴离子自由基的清除率为10.85%,菌悬液及胞内提取物对超氧阴离子自由基的清除率在15.71%~28.34%,表明其清除超氧阴离子自由基的活性物质大部分存在于细胞内;羊源卷曲乳杆菌DY38的各组分均有一定的羟自由基清除能力,其发酵上清液对羟自由基的清除率为62.54%,菌悬液及胞内提取物对羟自由基的清除率在18.53%~23.52%,表明其发酵上清液的羟自由基清除能力较高;羊源卷曲乳杆菌DY38发酵上清液的还原能力为8.67%,菌悬液及胞内提取物的还原能力在2.38%~4.52%,表明羊源卷曲乳杆菌DY38具有还原能力的活性物质主要存在于细胞表面或代谢产物中,胞内提取物中还原活性物质最少。
表7 羊源卷曲乳杆菌DY38对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基的清除率及其还原能力

Table 7 DPPH·, O2-· and·OH savenging rates and reducing capacity of Lactobacillus crispatus DY38 from goats %

羊源卷曲乳杆菌
DY38各组分
Components of
Lactobacillus crispatus
DY38 form goats		 羊源卷曲乳杆菌DY38的抗氧化能力
Antioxidant capacity of Lactobacillus crispatus DY38 from goats
DPPH自由基清除率
DPPH· savenging rate		 超氧阴离子
自由基清除率
O2-· savenging rate		 羟自由基清除率
·OH savenging rate		 还原能力
Reducing capacity
发酵上清液
Fermentation supernatant		 89.43±0.32 10.85±0.08 62.54±0.63 8.67±0.17
菌悬液Bacterial suspension 30.38±0.46 15.71±0.25 18.53±0.52 4.52±0.43
胞内提取物
Intracellular extract		 11.52±0.32 28.34±0.13 23.52±0.12 2.38±0.56

3 讨论

抗生素由于在提高动物机能和预防疾病等方面都具有重要作用而被大量使用,在此全球抗生素滥用的大背景下,畜牧业中病原菌的抗生素耐药性正从农场等多种途径蔓延至餐桌[27],对人类健康造成严重威胁。我国农业农村部针对此种严峻挑战提出了“饲料停抗、养殖减抗”的要求。目前,养殖企业和饲料行业都加紧加快了扩充高效安全饲料原料和饲料添加剂品种的研究与实践[28]。
乳酸菌作为纯天然饲料添加剂,因其具有促进动物生长[29]、改善肠道菌群结构、提高免疫机能[30]等功效,且具有无毒、无害、低耐药性[31]等特点,在集约化和超精细养殖系统中作为控制动物疾病发生的有效预防工具而被广泛应用[32]。卷曲乳杆菌是动物体内黏膜微生物组中的优势菌群。研究显示,卷曲乳杆菌具有调节肠道微生物群[33]、消除感染和减轻结肠炎[34]等作用,是一种安全的、耐受良好且有效的益生菌[35-36]。目前,卷曲乳杆菌的相关报道多见于医学领域,例如,白冰等[37]和张瑞等[38]研究发现卷曲乳杆菌对阴道炎症和子宫疾病有良好的治疗效果。在畜牧养殖业中,有关卷曲乳杆菌应用的报道相对较少,且相关报道多见于禽源及猪源菌株的研究。例如,张家宝等[39]从鸡的盲肠壁分离得到13株益生菌,其分离的卷曲乳杆菌Y68对鸡白痢沙门氏菌ATCC19945和金黄色葡萄球菌USA300有较强的抑制效果。张董燕等[40]在猪饲粮中添加猪源卷曲乳杆菌,发现能提高生长猪的粪便菌群物种丰富度,促进肠道健康。已有研究表明,从特定物种分离的益生菌菌株更适宜在分离宿主的胃肠道中定植并发挥有效的益生作用[41]。但目前,关于反刍动物源卷曲乳杆菌的研究报道甚少。因此,分离鉴定并筛选具有优异益生效果的羊源益生菌极为必要。
益生菌的抗菌活性被认为是其被筛选为微生物源抑菌剂的一项重要标准。在已报道的卷曲乳酸菌中,张宇微等[42]分离的卷曲乳杆菌ZL2和张家宝等[39]分离的卷曲乳杆菌Y68,对沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有良好的抑制效果。本研究对从山羊空肠内容物分离的1株卷曲乳杆菌DY38进行抑菌作用研究,结果显示其对羊源致病微生物有较强的抑菌效果,表明该羊源卷曲乳杆菌DY38具备开发成为新型畜禽微生态制剂的基本条件。
测定细菌在特定培养条件下的生长曲线有助于益生菌制剂研制中对数生长期和稳定期的选择。本试验中,羊源卷曲乳杆菌DY38培养4 h进入对数生长期,16 h进入稳定生长期,具备快速生长能力,发酵上清液的pH可以降至4.32,说明该菌株具有良好的生长特性及较强的产酸能力。
耐酸耐胆盐能力是筛选益生菌的重要指标,优秀的乳酸菌要有耐胃肠道低pH、蛋白酶和胆盐的能力[43],这是乳酸菌定植肠道细胞的关键[44]。梁颖等[45]筛选的卷曲乳杆菌R1在0.2%的胆盐浓度下存活率约为30%,在人工胃肠液中的存活率为20%~40%。本研究中,羊源卷曲乳杆菌DY38在pH为2.0和3.0条件下的存活率分别为62.73%和80.49%,在0.3%胆盐浓度下的存活率为66.85%,在人工胃液、人工肠液中的存活率分别为80.34%和70.34%,说明该菌株的耐酸耐胆盐能力较好,适合在动物胃肠道定植,进一步表明羊源卷曲乳杆菌DY38具备开发为畜禽微生态制剂的潜在条件。
作为益生菌必须有良好的安全性,其中包括溶血性和耐药性。一些乳酸菌属的益生菌株会对某些抗生素具有抗性,这可能与其携带的相关抗性基因有关,但这些抗性可能是内源性或者天然性的,不一定具有转移性[46]。本试验中,抗生素敏感性试验结果显示,羊源卷曲乳杆菌DY38对8种临床上常用抗生素敏感,不具备传播耐药基因风险;溶血性试验结果显示,羊源卷曲乳杆菌DY38在血琼脂平板上不存在溶血现象,说明其具有良好的安全性。
乳酸菌黏附性强弱是益生菌发挥作用的首要指标,乳酸菌肠道黏附能力强代表能在肠道中定植更长时间,是发挥益生作用的先决条件[47]。本试验测得羊源卷曲乳杆菌DY38的自聚集能力为64.83%,共聚集能力为62.81%,表明疏水性为80.69%,表明其具有良好的黏附特性,可通过抢占致病菌黏附位点来抑制其进行细胞黏附,形成动物肠道的保护层[48]。白洁等[49]利用Caco-2细胞对分离的乳酸菌的黏附性能进行体外研究,发现该乳酸菌对肠上皮细胞有较高的黏附率。本研究也利用Caco-2细胞进行了羊源卷曲乳杆菌DY38的黏附性能体外研究,结果显示羊源卷曲乳杆菌DY38对Caco-2细胞的黏附能力较强,每个Caco-2细胞黏附的平均细菌数为(20.23±1.63)CFU;该菌株与Caco-2细胞共培养24 h后,对细胞无裂解作用;此外,羊源卷曲乳杆菌DY38能抑制肠炎沙门氏菌对细胞的破坏。上述结果说明羊源卷曲乳杆菌DY38能充分定植于宿主肠道发挥黏附效果,并能抑制病原菌的侵袭。
动物机体在新陈代谢过程中会产生羟自由基和超氧阴离子自由基等多种活性氧自由基,自由基的产生和内在抗氧化系统的消减不平衡可能会造成畜禽免疫力低下[50],可通过在饲粮中补充抗氧化物质增强畜禽的抗氧化能力,然而许多化学合成的抗氧化物质存在安全隐患。因此,开发可作为抗氧化剂的益生菌株十分必要。本研究显示,羊源卷曲乳杆菌DY38对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除率分别为11.52%~89.43%、18.53%~62.54%、10.85%~28.34%,其还原能力为2.38%~8.67%,相对于菌悬液和发酵上清液,其胞内提取物具有更强的超氧阴离子自由基清除能力,而其发酵上清液则显示出更高的DPPH自由基、羟自由基清除能力和还原能力。上述结果说明羊源卷曲乳杆菌DY38的抗氧化能力较好,但其抗氧化机制还需进一步研究。

4 结论

综上所述,羊源卷曲乳杆菌DY38具有良好的生长特性,在高胆盐和强酸环境下具有良好的耐受性,且具有较高的细胞黏附性能和抗氧化能力,符合饲用微生态制剂的菌种要求,具有进一步开发成为微生态制剂用于防治羊腹泻等疾病的潜在价值。

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