围产期奶牛通常伴随强烈的代谢适应以及病理生理状况和疾病的发生。在此期间,由于非酯化脂肪酸(non esterified fatty acid,NEFA)的大量涌入,肝脏会明显发生代谢应激。机体发生严重的能量负平衡(negative energy balance,NEB)时,这些脂肪酸就会从甘油三酯(triacylglycerol,TG)储存中动员出来供能。当全身大量的NEFA进入到肝脏中并超过其氧化能力时,就会促进脂肪肝和酮病的发展[1]。酮病奶牛血清中高浓度的β-羟丁酸(β-hydroxybutyrate,BHBA)可诱导肝脏发生脂毒性和氧化应激,在一定程度上造成肝脏损伤,使肝脏代谢发生紊乱,进而影响机体健康[2-3]。泌乳期奶牛肝脏脂质沉积仍然是奶牛健康和福利的主要问题。脂质沉积不仅会造成奶牛泌乳性能和繁殖性能的下降,同时还会诱发代谢健康疾病的发生(如奶牛酮病)。因为脂肪过度分解、肝脏脂肪酸氧化能力受限以及TG的大量输出是导致肝脏脂质沉积和酮病发生的主要原因[4]。
内质网应激与奶牛健康紧密相关,在泌乳早期肝脏中存在的内质网应激会引起许多生化适应和症状[5],因为内质网应激诱导的未折叠蛋白质反应(unfolded protein response,UPR)可能会导致泌乳早期奶牛肝脏发生病理生理变化,如脂肪肝、酮病、胰岛素抵抗、炎症[5],这些病理生理症状都与内质网应激条件下的症状相似。当不利因素刺激肝脏时,会引起肝脏合成和代谢功能障碍,引发内质网应激,进而引发一系列级联反应,对肝脏造成不同程度地损害,严重威胁奶牛机体健康。研究表明,围产期奶牛肝脏中内质网应激相关分子表达上调,且内质网应激被激活会加剧奶牛肝脏脂质沉积[6-7]。综上所述,内质网应激与奶牛肝脏损伤和代谢紊乱密切相关。因此,本文分别从奶牛酮病、脂肪肝和胰岛素抵抗3个方面阐述内质网应激对奶牛肝脏损伤的作用机制及影响,为奶牛肝脏损伤的预防和治疗提供了新的见解。
1 内质网应激
内质网是蛋白质生物合成、折叠、组装、修饰和运输的特定细胞位点,具有多种生物学功能,如分泌蛋白质和膜蛋白质的合成、折叠和转运,脂质生物合成,钙离子(Ca2+)储存和信号传导等[8]。内质网应激被定义为蛋白质负荷和蛋白质折叠能力之间的不平衡,导致内质网腔中未折叠或错误折叠的蛋白质积累[9]。即在各种病理生理因素下,如基因突变、缺氧、营养缺乏、一般蛋白质合成增加、氧化还原平衡改变和钙稳态变化,都可能导致内质网中未折叠或错误折叠的蛋白质积累,发生内质网应激[10]。在正常生理学中,通过葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)与内质网应激传感器激活转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)、内质网跨膜激酶1α(inositol-requiring protein 1α,IRE1α)和蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)结合来维持内质网稳态,使内质网处于与重链结合蛋白结合的非激活状态[11]。UPR是一种在压力期间恢复内质网功能适应性的保护反应,通过促进错误折叠的蛋白质降解和下调整体蛋白质合成来维持内质网稳态[12]。当外部不利因素刺激机体发生应激条件下,由于蛋白质折叠和加工不当会导致未折叠蛋白质错误折叠在内质网腔内积累,导致内质网稳态发生紊乱,最终发生内质网应激[13],并触发UPR激活内质网应激传感器介导的细胞内信号通路:IRE1α、PERK和ATF6,并增强了其中GRP78的释放,最终导致它们的激活[12]。在氧化还原失衡和炎症循环期间,活性氧(reactive oxygen species,ROS)也可以靶向内质网驻留蛋白质、酶和伴侣蛋白质,导致内质网应激反应[14]。
2 肝脏稳态
肝脏是最大的代谢器官,富含酶系统,承载着新陈代谢和分泌等功能,并且作为调节能量和蛋白质代谢的关键器官起着重要作用[15]。此外,肝脏作为体内蛋白质合成的主要场所,其肝细胞中存在发达的内质网系统,可以帮助肝脏发挥其生理功能[16]。特别是在高产奶牛中,肝脏的功能长期处于超负荷状态,这可能导致各种炎症或退行性过程的发展,从而损害其整体功能[15]。NEFA作为奶牛机体能量来源满足其能量需求,在肝脏中NEFA可以被线粒体氧化或重酯化,在内质网内形成TG[17]。脂肪酸氧化是维持肝脏脂质稳态的重要机制,脂肪酸氧化受损导致TG在肝脏中异常积聚,并导致肝脏脂肪变性[18]。当肝脏无法通过脂肪酸氧化和脂质分泌来适应NEFA的过度摄取时,奶牛就会发生过酮病或脂肪肝[19]。
3 内质网应激对奶牛肝脏损伤的影响
围产期奶牛通常与强烈的代谢适应以及病理生理状况和疾病的发展有关。内质网应激参与奶牛各种病理状况的作用和潜在机制受到越来越多的关注。在肝细胞中,内质网是蛋白质合成、解毒、脂质和葡萄糖代谢以及Ca2+调节的关键部位。当内质网稳态被许多干扰如脂毒性和炎症扰乱时,导致未折叠蛋白质积累,发生内质网应激[20]。内质网稳态的破坏被称为内质网应激的一种疾病,可以加剧反刍动物肝脏损伤的发展。因此,了解内质网应激对肝脏损伤的功能影响特别重要。
3.1 内质网应激与奶牛酮病
酮病是高产奶牛从妊娠晚期到泌乳早期的一种常见代谢紊乱,是由于奶牛围产期能量供应不足和泌乳期间大量的能量需求,导致奶牛进入NEB状态引起的以能量代谢障碍为基础的代谢性疾病[21]。高酮血症、游离脂肪酸血症和低血糖是酮病的标志。过量的酮体产生会导致肝脏功能障碍,随后导致脂质沉积、氧化应激和其他损伤,导致螺旋式上升,最终加剧奶牛的肝脏损伤。因此,肝脏损伤是奶牛酮病治疗复杂化的关键致病过程之一。
Ufm1结合蛋白(Ufm1 binding protein,Ufm1)偶联系统对肝脏发育和体内平衡至关重要。在酮病诱导的肝脏损伤中Ufm1结合和PCI域包含蛋白1(Ufm1-binding and PCI domain-containing protein 1,Ufbp1)缺失通过激活内质网应激,然后诱导细胞凋亡导致肝脏损伤[22]。二酰基甘油O-酰基转移酶1(diacylglycerol O-acyltransferase 1,DGAT1)是膜结合的O-酰基转移酶基因家族的成员,是一种多功能内质网膜蛋白质。酮病奶牛中,用肾上腺素(epinephrine,EPI)诱导脂肪分解激活核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信号通路,增加脂肪细胞中炎性因子的mRNA丰度,进一步激活IRE1、PERK和ATF6蛋白质传感器,诱导内质网应激和炎性反应的发生[23]。GRP78是内质网一种主要的伴侣蛋白质,在新生膜结合蛋白质或分泌蛋白质的折叠和加工中发挥关键作用,也是内质网应激反应的主要调节因子,内质网应激由多种干扰内质网中蛋白质折叠的条件触发[24]。在内质网应激时,GRP78会激活UPR,清除未折叠蛋白质并恢复内质网稳态[25]。在患有临床酮病的奶牛中,大量BHBA的产生可以通过加剧内质网应激介导肝细胞损伤;过表达GRP78可以减弱BHBA诱导的内质网应激细胞损伤。由此可见,GRP78在减弱BHBA诱导的肝细胞损伤中的作用对其维持内质网稳态和肝脏功能中的重要性[26]。
3.2 内质网应激与奶牛脂肪肝
脂质代谢的各个方面都依赖于内质网功能,许多参与中间和复杂脂质代谢的酶都存在于内质网中。因此,内质网在控制肝脏脂质稳态中发挥重要的作用[30]。固醇调节元件结合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c,SREBP-1c)是脂肪生成的主要转录调节因子,它在内质网膜内以非活性形式与固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SREBP cleavage-activating protein,SCAP)结合[31-32]。高浓度脂肪酸可诱导内质网传感器(PERK、IRE1α和ATF6)的激活和UPR下游基因GRP78、激活转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)和X-box结合蛋白1(X-box-binding protein 1,XBP1)的上调,增加SREBP-1c的表达和活性,上调脂肪生成基因乙酰辅酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase,ACACA)、脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN)和二酰甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase,DGAT)的表达,促进奶牛肝细胞脂质积累,使高产奶牛脂肪肝频繁发生[7]。
脂肪酸激活钙释放激活钙调节因子1(calcium release-activated calcium modulator 1,ORAI1)、内质网应激,上调脂肪生成基因ACACA、FASN和转录调节因子固醇调节元件结合蛋白1(sterol regulatory element-binding protein 1,SREBP1)的表达,从而导致脂质积累。因此,在脂肪酸刺激条件下,通过沉默或药物抑制降低ORAI1的表达,可以降低内质网应激及ACACA、FASN和转录调节因子SREBP1的表达,从而减少脂质积累[33]。脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)可以诱导ROS的过量产生,导致内质网应激[34-35]。蒲公英甾醇(taraxasterol,Tara)作为药用植物中的一种天然化合物,可以通过减少肝细胞中的免疫和氧化应激来帮助减少肝脏脂质的积累[36]。在Tara通过减少ROS产生和内质网来缓解脂肪酸诱导的犊牛肝细胞脂质沉积研究中发现,Tara可以缓解肝细胞中LPS引起的ROS水平增加,减少GRP78和ATF6的mRNA转录,促进犊牛肝细胞的脂质稳态,缓解脂肪肝的发生,进而发挥其保护作用[36]。XBP1作为内质网的调节因子,可以缓解内质网应激并预防肝脏脂肪变性,而在XBP1敲除小鼠中,长期未缓解的内质网应激可以促进肝脏脂肪变性[37]。因此,内质网主要参与转录因子缺乏引起的肝脏脂肪变性,可以通过调节UPR及其下游因子的表达来治疗脂肪肝疾病[38]。
3.3 内质网应激与奶牛胰岛素抵抗
胰岛素抵抗是胰岛素靶向组织(骨骼肌、肝脏和脂肪组织等)对胰岛素生理水平反应性降低的状态,在生理学上被定义为某种类型的组织无法对正常的胰岛素水平做出反应[39]。胰岛素抵抗是许多代谢性疾病的关键致病成分,在反刍动物生理病理具有诱发或自发性肝脏脂肪沉积和酮病的发生[40]。胰岛素抵抗和低胰岛素血症是围产期奶牛顺势适应的关键组成部分。内质网应激在肝胰岛素抵抗中起着至关重要的作用,酮病奶牛肝脏中内质网应激激活可能是胰岛素抵抗的致病因素。在内质网应激时,IRE1α磷酸化激活IRE1α激酶活性,并激活募集蛋白肿瘤坏死因子受体相关因子2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2,TRAF2)以间接激活JNK和kappa B抑制因子激酶(inhibitor of kappa B kinase,IKK),并通过磷酸化特定丝氨酸残基上的胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1,IRS1)减少与其他信号蛋白磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的相互作用来影响胰岛素信号传导,从而发生胰岛素抵抗[41]。
肝脏中IRS1、AKT、丝氨酸/苏氨酸激酶(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)磷酸化水平的降低,导致脂肪肝奶牛表现出肝脏胰岛(insulin,INS)耐药性[42]。BHBA处理使奶牛肝细胞中IRE1α、PERK的磷酸化水平升高,诱发内质网应激。此外,细胞中IRS1、AKT和GSK-3β磷酸化水平降低进一步证实了肝脏INS信号传导的损害。因此,减少内质网应激可以改善BHBA诱导的奶牛肝细胞INS信号传导损伤[43]。大量NEFA进入肝细胞会诱发内质网应激并导致胰岛素抵抗。NEFA激活奶牛肝细胞中内质网应激传感器(PERK、IRE1α和ATF6)的激活及UPR下游基因XBP1、ATF4等的表达。敲除IRE1α后,IRS1磷酸化水平减少,AKT和GSK-3β磷酸化水平增加,糖异生基因磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(phosphoenolpyruvate carboxy kinase,PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G6-Pase)表达下调,表明IRE1α有助于NEFA诱导的胰岛素抵抗[44]。Tribbles同源蛋白3(Tribbles-like protein 3,TRB3)是一种假激酶,通过抑制IRS1下游靶标AKT来促进胰岛素抵抗[45]。阻断TRB3的mRNA表达可以降低NEFA处理的奶牛肝细胞中的PERK表达水平。因此,UPR的IRE1α和PERK分支是调控内质网应激介导NEFA诱导的胰岛素抵抗的主要途径[44]。
4 小结与展望
内质网作为一种高度保守的信号转导途径,在生理活动和病理损伤中发挥重要作用,在体内具有双重调节作用。可以通过UPR恢复内质网稳态,促进细胞存活;但当外部刺激超过内质网的调节能力时,下游UPR信号被激活以诱导细胞死亡。
综上所述,奶牛肝脏相关疾病的发生至关重要,因为它会损害肝脏的代谢功能、整体健康状况以及生产和繁殖性能。内质网应激对肝脏损伤的功能影响特别重要,内质网应激和相关的自噬、细胞凋亡、氧化应激和炎症损伤对奶牛肝脏损伤的研究取得了一定进展,但仍存在诸多挑战。基于此,在前人研究的基础上,仍需要深层次探究内质网应激在奶牛肝脏损伤中的功能和作用机制,以实现奶牛肝脏损伤预防和治疗的新靶点。