Chinese Journal of Animal Nutrition >

2025 , Vol. 37 >Issue 3: 1715 - 1726

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.145

RESEARCH PAPER

Effects of Dietary Supplementation of Organic Manganese, Zinc and Nano-Selenium Alginate Oligosaccharides on Occurrence of Eggshell Dark Spots in Eggs

  • CAI Chunyan ,
  • ZHANG Keying ,
  • ZENG Qiufeng ,
  • BAI Shiping ,
  • DING Xuemei ,
  • PENG Huanwei ,
  • LIU Yan ,
  • WANG Jianping , *
Expand
  • Key Laboratory of Animal Disease Resistance Nutrition, Ministry of Education, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Institute of Animal Nutrition, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China
*professor, E-mail:

Received date: 2024-07-07

  Online published: 2025-03-13

Fold

Abstract

The aim of this study was to explore the effects of dietary supplementation with organic manganese, zinc, nano-selenium alginate oligosaccharides on the occurrence of egg shell dark spots in laying hens with a high incidence of such spots. A total of 150 Roman pink laying hens at 288 days of age were selected, among which 30 had a low incidence of dark spots and 120 had a high incidence. They were divided into the NC group (low dark spot+basal diet), the PC group (high dark spot+basal diet), the MnG group (high dark spot+basal diet+60 mg/kg manganese hydroxymethionine+60 mg/kg MnSO4), the ZnG group (high dark spot+basal diet+55 mg/kg zinc hydroxymethionine+55 mg/kg ZnSO4), and the SeG group (high dark spot+basal diet+0.3 mg/kg nano-selenium alginate oligosaccharides), with 10 replicates per group and 3 chickens per replicate. The experiment lasted for 12 weeks. The results showed as follows: 1) compared with the NC group, the eggshell strength, eggshell moisture content, and mastoid layer thickness in the PC group were significantly increased (P<0.05), while the eggshell calcium content, the crude protein content of the eggshell membrane, and the total amino acid content were significantly decreased (P<0.05). The relative mRNA expression of eggshell gland calcium-binding protein-D28K (CaBP-D28k) was significantly reduced (P<0.05). 2) Compared with the PC group, the egg dark spot score mean in all the supplemented groups was significantly decreased (P<0.05). 3) Compared with the PC group, the thickness of the eggshell mastoid layer in the MnG and SeG groups was significantly decreased (P<0.05), and the content of crude protein in the eggshell membrane was significantly increased (P<0.05). Additionally, the contents of essential amino acids and total amino acids of the eggshell membrane in the MnG and ZnG groups were significantly increased (P<0.05). 4) Compared with the PC group, the relative mRNA expression levels of carbonic anhydrase (CA) and CaBP-D28k in the eggshell gland in the MnG group were significantly up-regulated (P<0.05), and the relative mRNA expression levels of estrogen receptor α (ERα) in the eggshell gland in the ZnG and SeG groups were significantly up-regulated (P<0.05). In conclusion, feeding laying hens with a high incidence of dark spots with diets supplemented with 120 mg/kg manganese (60 mg/kg manganese hydroxymethionine+60 mg/kg MnSO4), 110 mg/kg zinc (55 mg/kg zinc hydroxymethionine+55 mg/kg ZnSO4), or 0.3 mg/kg nano-selenium alginate oligosaccharides could improve the eggshell structure, reduce water accumulation in the eggshell by increasing the eggshell calcium content and the crude protein content of the eggshell membrane, and enhance the function of the eggshell gland by increasing the expression of genes related to calcium metabolism in the eggshell gland, thereby reducing the occurrence of eggshell dark spots.

Key words： dark spots; egg quality; eggshell quality; uterine function; laying hens

Cite this article

CAI Chunyan , ZHANG Keying , ZENG Qiufeng , BAI Shiping , DING Xuemei , PENG Huanwei , LIU Yan , WANG Jianping . Effects of Dietary Supplementation of Organic Manganese, Zinc and Nano-Selenium Alginate Oligosaccharides on Occurrence of Eggshell Dark Spots in Eggs[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2025 , 37(3) : 1715 -1726 . DOI: 10.12418/CJAN2025.145

鸡蛋蛋壳暗斑会降低鸡蛋外观品质,影响消费者购买欲望,带来严重经济损失。此外,也有研究表明,鸡蛋暗斑会增加细菌渗透的风险,引发食品安全问题[1]。如何改善鸡蛋蛋壳暗斑问题已成为当前亟待解决的重要产业问题之一。然而,目前对于暗斑形成的机理尚不完全清楚,目前普遍认同的观点是蛋壳乳突层和蛋壳膜结构的变化引起内外部水分在蛋壳聚集,从而导致暗斑的形成。相关研究表明,饲粮中添加有机微量矿物质(锌、锰、铜、硒)可提高蛋鸡生产性能,改善蛋品质[2],并且有机微量矿物质在改善超微结构和蛋品质方面比无机微量矿物质更具优势[3⇓-5],然而研究结果并不一致,内在机制也有待进一步揭示。
锰是动物机体的必需微量元素之一,参与能量代谢、酶的活化和调节、氧化磷酸化过程,同时也能够增强细胞的免疫功能[6],可作为半乳糖-β-1,3-葡萄糖醛酸基转移酶的辅因子,调控蛋壳腺内蛋白质的糖基化和聚糖代谢[6]。Swiatkiewiz等[6]研究表明,在产蛋后期添加氨基酸螯合锰可以改善老龄化蛋鸡的蛋壳质量。Zhang等[7]进一步研究表明,饲粮中添加80 mg/kg氨基酸复合锰增加了蛋壳的成核部位和乳头节密度,降低了乳头层厚度。锌会对多种酶的活性和结构产生影响,不仅参与蛋白质的合成过程,还在碳水化合物和能量代谢等生理化学反应中发挥着重要作用,可作为碳酸酐酶的辅因子(CA),为蛋壳的形成过程提供碳酸盐离子[7]。有机锌在增强老龄蛋鸡的蛋壳厚度和蛋壳强度方面也表现出显著效果,可改善蛋壳的微观结构[8]。在蛋鸡饲粮中添加80 mg/kg羟基蛋氨酸锌至62~72周龄,可显著增加其蛋壳强度和蛋壳钙含量[9],提升蛋壳腺中的钙离子浓度,优化蛋壳横切面的钙沉积结构,同时有效降低乳突体的宽度[8]。易鑫[10]研究结果表明,壳聚糖纳米硒可延缓产蛋后期蛋鸡生产性能下降,并且硒添加量越高,延缓效果越佳,还能改善产蛋后期及储存期蛋品质。邱盛坚[11]研究发现,纳米硒-褐藻寡糖能提高22~42日龄热应激肉鸡的肠道抗氧化性能和调控肠道Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap l)/抗氧化反应元件(ARE)通路相关分子的表达,从而缓解热应激肉鸡的肠道机械屏障氧化损伤。纳米硒在提升蛋鸡与肉鸡的生产效能方面展现出了一定的促进作用,然而,当前在鸡蛋蛋壳暗斑领域针对纳米硒的相关研究相对匮乏,仍有待进一步深入探索与挖掘。不过,杨玉等[12]研究发现,酵母硒的添加可以通过提升鸡蛋的抗氧化能力,并调节蛋壳的矿化过程,进而增强蛋壳的强度,有效减少蛋壳暗斑的发生,在Liu等[13]研究中也观察到同样的结果。以上研究表明,有机微量矿物质能改善蛋壳质量,但在改善鸡蛋蛋壳暗斑方面的研究甚少。蛋壳腺是形成蛋壳的场所,当鸡蛋进入子宫部(蛋壳腺)时,子宫部会快速分泌子宫液,子宫液中含有构成蛋壳的所有无机矿物质前体物质(钙和碳酸氢盐)和有机基质(形成蛋壳基质的蛋白质),可促进蛋壳的形成[13]。此外,研究表明蛋壳腺功能紊乱会形成个别或轻微的暗斑[14],这可能是因为蛋壳腺功能发生紊乱时,蛋壳在蛋壳腺的矿化过程受到影响,影响蛋壳结构进一步形成暗斑。基于此,本试验旨在探究暗斑发生率高和暗斑发生率低的蛋鸡蛋壳腺(子宫)功能的差异,并在暗斑发生率高的蛋鸡饲粮中添加有机锰、锌和纳米硒-褐藻寡糖,探讨有机锰、锌和纳米硒-褐藻寡糖对蛋壳暗斑的影响,从而为改善蛋鸡蛋壳暗斑的发生提供理论基础和试验支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用的有机锰和有机锌分别为羟基蛋氨酸锰(锰含量为18%)和羟基蛋氨酸锌(锌含量为20%)。试验所用的纳米硒-褐藻寡糖为使用褐藻寡糖作为聚合物模板,然后用抗坏血酸还原亚硒酸钠合成的生物硒纳米颗粒,粒径为80 nm,其中褐藻寡糖含量为84.5%,硒含量为8%,其余成分不影响纳米硒-褐藻寡糖的主要功效。

1.2 试验设计

所有试验操作遵守四川农业大学实验动物操作规范与福利管理委员会制定的“实验动物操作规范”(川农大校发[2014]18号)。试验选用400只(288日龄)罗曼粉蛋鸡进行单笼饲养,每日记录产蛋量,待稳定后隔1 d留1次蛋,放置5 d后进行暗斑评分,留蛋2周后根据暗斑评分的平均值选出30只暗斑程度低的蛋鸡和120只暗斑程度高的蛋鸡。试验将120只暗斑程度高的蛋鸡根据产蛋率和暗斑评分平均值分到5个组中,分别为NC组(低暗斑+基础饲粮)、PC组(高暗斑+基础饲粮)、MnG组(高暗斑+基础饲粮+60 mg/kg羟基蛋氨酸锰+60 mg/kg MnSO4)、ZnG组(高暗斑+基础饲粮+55 mg/kg羟基蛋氨酸锌+55 mg/kgZnSO4)和SeG组(高暗斑+基础饲粮+0.3 mg/kg纳米硒-褐藻寡糖),每组10个重复,每个重复3只鸡。待产蛋率稳定后,继续留蛋观察暗斑评分,看每组是否有差异,进行调整,开始试验。预试期2周,正试期12周。

1.3 试验饲粮

本试验使用玉米-豆粕型基础饲粮,参考NRC(1994)和《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)配制,其组成及营养水平见表1。试验在四川农业大学试验教学科研基地蛋鸡试验舍进行单笼饲养,按照常规饲养管理进行。
表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

项目Items 含量Content
原料Ingredients
玉米Corn 61.92
豆粕Soybean meal (CP, 48%) 25.48
小麦麸Wheat bran 1.26
大豆油Soybean oil 1.00
碳酸钙CaCO3 8.01
磷酸氢钙CaHPO4 1.39
DL-蛋氨酸DL-methionine (99%) 0.15
苏氨酸Threonine (30%) 0.02
食盐NaCl 0.30
碳酸氢钠NaHCO3 0.20
氯化胆碱Choline chloride (50%) 0.10
维生素预混料Vitamin premix1) 0.02
微量元素预混料Trace mineral premix2) 0.15
合计Total 100.00
营养水平Nutrient levels3)
代谢能ME/(MJ/kg) 11.34
粗蛋白质CP 16.50
钙Ca 3.50
总磷TP 0.65
有效磷AP 0.32
可消化赖氨酸DLys 0.77
可消化蛋氨酸DMet 0.38
可消化苏氨酸DThr 0.55
可消化色氨酸DTrp 0.17

1)维生素预混料为每千克基础饲粮提供 Vitamin premix premix provided the following per kg of the diet:VA 9 750 IU,VB1 2.6 mg,VB2 6 mg,VB6 4 mg,VB12 0.03 mg,VD33 750 IU,VE 25 IU,VK3 3 mg,生物素 biotin 0.2 mg,叶酸 folic acid 1.0 mg,D-泛酸 D-pantothenic acid 8.5 mg,烟酸 nicotinic acid 35 mg。

2)微量元素预混料为每千克基础饲粮提供 Trace mineral premix provided the following per kg of the basal diet:Cu (CuSO4) 10 mg,Fe (FeSO4) 80 mg,Mn (MnSO4) 120 mg,Zn (ZnSO4) 110 mg,I (KI) 1.40 mg,Se (Na2SeO3) 0.30 mg。

3)代谢能、有效磷和可消化氨基酸为参考《中国饲料成分及营养价值表(2020年第31版)》所得计算值,粗蛋白质(GB/T 6432—2018)、总磷(GB/T 6437—2018)和钙(GB/T 6436—2018)为实测值。ME, AP and digestible amino acids were calculated with reference to the Tables of Feed Composition and Nutritional Values in China (3lst edition, 2020), while CP (GB/T 6432—2018), TP (GB/T 6437—2018) and Ca (GB/T 6436—2018) were measured values.

1.4 饲养管理

严格控制室内温度和光照时间,温度控制在22 ℃左右,光照16 h(05:00—21:00),自由采食、饮水,在每天09:00和15:00喂料,同时下午喂料过后进行鸡蛋数量和重量的记录,同时观察鸡只和圈舍内是否有异常情况,发现异常,及时处理。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 蛋品质测定

在试验的4、8、12周的周末,每个重复的鸡蛋全部采集,常温放置5 d后进行蛋品质的测定。测定指标主要包括:蛋壳强度、蛋黄颜色、蛋白高度、哈氏单位、蛋壳厚度。蛋壳强度采用蛋壳强度测定仪(ETG-1601A,Robotmation公司,日本)进行测定;蛋白高度、蛋黄颜色、哈氏单位采用蛋品质自动分析仪(EMT-5200型,Robotmation公司, 日本)进行测定。在试验的4、8和12周的周末,每个重复采集3个重量、体积、颜色相近的鸡蛋常温保存并做好记录,常温放置5 d后测定暗斑蛋发生率(暗斑蛋评分)。本次试验采用6等级评分系统对暗斑进行评分,暗斑具体评分标准见图1。
图1 暗斑等级评价

Fig.1 Dark spot grade evaluation

1.5.2 蛋壳质量测定

试验结束时(12周的周末)采集蛋壳赤道部蛋壳碎片(10个/组,1个/重复),储存3 d以后,使用扫描电镜测定蛋壳微观品质(蛋壳厚度、乳突层厚度、有效层厚度)。具体方法:首先选取蛋壳碎片,在超纯水中清洗后,在样品座上粘一层导电胶,然后将蛋壳碎片粘在导电胶上并使用离子溅射仪进行喷镀处理,再采用日本电子生产的JSM-IT700HR扫描电镜在150倍视野下观察蛋壳横断面超微结构。参照文献[15]的方法测定蛋壳总厚度、有效层厚度、乳突层厚度。
总厚度=乳突层厚度+有效层厚度;
有效层厚度=栅栏层厚度+垂直晶体层厚度+胶护膜厚度。
此外,试验还测定了蛋壳(无蛋壳膜部分)水分、粗灰分、钙、磷的含量,以及蛋壳膜水分、粗蛋白质和氨基酸含量。水分含量参考GB/T 6435—2014的方法测定,粗蛋白质、粗灰分含量分别参考GB/T 6432—2018和GB/T 6438—2007的方法测定,蛋壳钙、磷含量分别参考GB/T 6436—2018和GB/T 6437—2018的方法测定。蛋壳膜水解氨基酸含量使用氨基酸全自动分析仪L-8080(Hitachi,日本)测定。

1.5.3 蛋壳腺(子宫)钙代谢相关基因测定

采集4管蛋鸡子宫基因样于无菌EP管中,于-80 ℃保存。使用实时荧光定量PCR法测定蛋壳腺钙代谢基因以及激素受体基因的表达。试验中所需的RNA提取试剂盒(RNAiso)、mRNA反转录试剂盒(prime ScriptRT)及实时荧光定量PCR试剂盒(SYBR Premix Ex Taq)均购买于TaKaRa公司(中国大连),按照说明书进行操作。使用ABI-7900HT Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems,美国)和SYBR Green PCR Mix(TaKaRa,中国)进行实时荧光定量PCR反应。PCR反应体系为10 μL,包括5 μL SYBR Premix Ex Taq (2×),上、下游引物各1 μL、2 μL ddH2O和1 μL cDNA。反应程序为:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,40个循环;95 ℃ 15 s,65 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。引物序列交予成都生工生物工程有限公司合成,以β-肌动蛋白为内参基因,目的基因的mRNA相对表达量采用2-ΔΔCt法计算,基因引物序列见表2。
表2 基因引物序列

Table 2 Gene primer sequence

基因
Genes		 引物序列
Primer sequences (5'—3')		 登录号
Accession number		 产物大小
Product size/bp
β-肌动蛋白β-actin F:GCTACAGCTTCACCACCACA
R:TCTCCTGCTCGAAATCCAGT		 NM_205518.1 90
钙ATP酶CaATP F:TGAACGAAAGCGTCGGGCTGAGC
R:CTCAAACCACGCCAGCACGAAGG		 M26064 185
钙结合蛋白D28k CaBP-D28k F:GACTTCATGCAGACATGGAGA
R:CTTGATCGTACATCTCAAAGGC		 NM_205513 299
碳酸酐酶CA F:AGACTTCATGCAGACATGGAGA
R:CTTGATCGTACATCTCAAAGC		 NM_205317 250
雌激素受体α ERα F:TTCAAGGGGAGGAATTTGTG
R:TGTCCAGAACACGGTGGATA		 NM_205183.2 123

1.6 统计分析

使用SAS 9.2统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),当方差分析显著时,采用Tukey或Duncan氏法进行多重检验。所有数据均以平均值和均值标准误(SEM)表示。P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 有机锰、锌和纳米硒-褐藻寡糖对蛋鸡蛋品质的影响

由表3可知,与NC组相比,PC组第12周蛋壳强度显著增加(P<0.05),而与PC组相比,各添加组蛋壳强度、蛋壳厚度、蛋白高度、蛋黄颜色和哈氏单位均无显著变化(P>0.05)。
表3 饲粮中添加有机锰、锌和纳米硒-褐藻寡糖对第12周蛋鸡蛋品质的影响

Table 3 Effects of dietary organic manganese, zinc and nano-selenium alginate oligosaccharides supplementation on egg quality of laying hens at week 12

项目
Items		 蛋壳强度
Eggshell strength/
(kg/cm2)		 蛋壳厚度
Eggshell thickness/
mm		 蛋白高度
Albumen height/
mm		 蛋黄颜色
Yolk color		 哈氏单位
Haugh unit
组别Groups
NC 4.14b 0.39 5.70 7.12 72.86
PC 4.80a 0.39 5.34 6.95 69.70
MnG 4.61a 0.40 5.60 6.84 73.70
ZnG 4.47ab 0.39 6.04 6.98 75.02
SeG 4.80a 0.39 6.43 6.79 77.43
SEM 0.134 0.007 0.290 0.104 1.854
P值P-value 0.010 0.667 0.096 0.190 0.064

同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

Different lowercase letters of shoulder label in the same column indicated significant difference (P<0.05). The same as below.

由表4可知,PC组暗斑评分0~2分比例低于NC组,3~5分比例远高于NC组,且第4、8和12周鸡蛋暗斑评分平均值显著高于NC组(P<0.05)。饲粮中添加有机锰、锌和纳米硒-褐藻寡糖在第4、8和12周时,鸡蛋暗斑评分平均值较PC组显著降低(P<0.05),其中在第8周时,ZnG组的暗斑评分平均值是各添加组中最低的,但均显著高于对照组(P<0.05)。并且,与PC组相比,各添加组第4、8和12周暗斑评分3~5分比例均降低,暗斑评分0~2分比例增加。
表4 饲粮中添加有机锰、锌和纳米硒-褐藻寡糖对鸡蛋暗斑评分比例及平均值的影响

Table 4 Effects of dietary organic manganese, zinc and nano-selenium alginate oligosaccharides supplementation on proportion and mean of egg dark spot score

项目
Items		 暗斑评分比例Dark spot score proportion/% 平均值
Mean
0 1 2 3 4 5 0~2 3~5
第4周Week 4
组别Groups
NC 31.03 37.93 13.79 13.79 3.45 0.00 82.76 17.24 1.06d
PC 0.00 0.00 25.93 51.85 22.22 0.00 25.93 74.07 2.98a
MnG 4.00 36.00 40.00 12.00 8.00 0.00 80.00 20.00 1.83bc
ZnG 0.00 35.00 25.00 40.00 0.00 0.00 60.00 40.00 2.07b
SeG 3.45 44.83 44.83 6.90 0.00 0.00 93.10 6.90 1.57c
SEM 0.151
P值P-value <0.001
第8周Week 8
组别Groups
NC 48.15 22.22 14.81 11.11 3.70 0.00 85.19 14.81 1.02c
PC 0.00 0.00 13.64 59.09 27.27 0.00 13.64 86.36 3.10a
MnG 4.17 20.83 33.33 37.50 4.17 0.00 58.33 41.67 2.18b
ZnG 0.00 33.33 23.81 42.86 0.00 0.00 57.14 42.86 1.97b
SeG 0.00 40.74 25.93 29.63 3.70 0.00 66.67 33.33 2.03b
SEM 0.155
P值P-value <0.001
第12周Week 12
组别Groups
NC 31.82 40.91 4.55 22.73 0.00 0.00 77.27 22.73 1.18c
PC 0.00 0.00 20.00 52.00 28.00 0.00 20.00 80.00 3.10a
MnG 4.76 33.33 42.86 14.29 4.76 0.00 80.95 19.05 1.80b
ZnG 0.00 36.84 31.58 31.58 0.00 0.00 68.42 31.58 1.97b
SeG 0.00 35.71 42.86 21.43 0.00 0.00 78.57 21.43 1.87b
SEM 0.167
P值P-value <0.001

比例是指各暗斑评分鸡蛋在总鸡蛋数目中所占的百分比。

Proportion refered to the percentage of eggs scored by dark spot in the total number of eggs.

2.2 有机锰、锌和纳米硒-褐藻寡糖对蛋鸡蛋壳质量的影响

由表5可知,与NC组相比,PC组蛋壳水分含量和蛋壳乳突层厚度显著增加(P<0.05),蛋壳钙含量显著降低(P<0.05),而对蛋壳粗灰分含量、蛋壳总厚度和有效层厚度无显著影响(P>0.05)。与PC组相比,各添加组蛋壳水分含量均显著降低(P<0.05),而对蛋壳粗灰分含量、蛋壳总厚度和有效层厚度无显著影响(P>0.05),其中,与PC组相比,MnG组蛋壳钙含量显著增加(P<0.05);此外,MnG组和SeG组蛋壳乳突层厚度显著降低(P<0.05)。
表5 饲粮中添加有机锰、锌和纳米硒-褐藻寡糖对第12周蛋鸡蛋壳质量的影响

Table 5 Effects of dietary organic manganese, zinc and nano-selenium alginate oligosaccharides supplementation on eggshell quality of laying hens at week 12

项目
Items		 化学组成Chemical composition/% 超微结构Ultrastructure/μm
水分
Moisture		 粗灰分
Ash		 钙
Calcium		 磷
Phosphorus		 蛋壳
总厚度
Total
eggshell
thickness		 有效层
厚度
Effective
layer
thickness		 乳突层
厚度
Mammillary
layer
thickness
组别Groups
NC 0.65b 45.92 7.94a 0.08ab 394.17 359.14 32.71b
PC 1.04a 45.60 6.18bc 0.08ab 397.20 343.39 53.69a
MnG 0.58b 46.21 8.98a 0.13a 399.26 355.45 34.94b
ZnG 0.64b 46.32 7.58ab 0.13a 369.41 326.44 43.45ab
SeG 0.64b 45.76 4.68c 0.06b 389.93 351.58 35.37b
SEM 0.066 0.789 0.551 0.019 13.976 13.096 3.453
P值P-value <0.001 0.963 <0.001 0.028 0.562 0.388 <0.001
由表6可知,与NC组相比,PC组蛋壳膜粗蛋白质含量和总氨基酸的含量显著降低(P<0.05)。与PC组相比,各添加组蛋壳膜粗蛋白质含量均显著增加(P<0.05);此外,MnG组和ZnG组蛋壳膜必需氨基酸、非必需氨基酸和总氨基酸的含量显著增加(P<0.05),而SeG组蛋壳膜必需氨基酸、非必需氨基酸和总氨基酸的含量均无显著变化(P>0.05)。就单一氨基酸而言,与NC组相比,PC组苏氨酸、甘氨酸、胱氨酸、组氨酸、精氨酸和脯氨酸等氨基酸的含量显著降低(P<0.05),与PC组相比,MnG组天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸等氨基酸的含量显著增加(P<0.05),ZnG组天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸等氨基酸的含量显著增加(P<0.05),SeG组丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸的含量显著增加(P<0.05)。
表6 饲粮中添加有机锰、锌和纳米硒-褐藻寡糖对第12周蛋鸡蛋壳膜质量的影响

Table 6 Effects of dietary organic manganese, zinc and nano-selenium alginate oligosaccharides supplementation on quality of eggshell membrane of laying hens at week 12 %

项目
Items		 水分
Moisture		 粗蛋白质
Crude protein		 天冬氨酸
Aspartic		 苏氨酸
Threonine		 丝氨酸
Serine		 谷氨酸
Glutamic acid		 甘氨酸
Glycine		 丙氨酸
Alanine		 胱氨酸
Cysteine		 缬氨酸
Valine		 蛋氨酸
Methionine		 异亮氨酸
Isoleucine
组别Groups
NC 27.67 82.26a 6.19ab 4.20a 4.07abc 9.43 4.37a 2.04bc 6.17a 4.90bc 2.70 2.33b
PC 33.22 78.67b 5.91b 4.00b 3.90c 8.92 4.11bc 2.01c 5.81bc 4.77c 2.73 2.30b
MnG 28.89 82.21a 6.28a 4.21a 4.11ab 9.33 4.32a 2.14ab 6.18a 5.10a 2.86 2.46a
ZnG 27.94 83.25a 6.23a 4.23a 4.13a 9.31 4.29ab 2.21a 6.06ab 5.06ab 2.82 2.49a
SeG 28.99 81.77a 6.01ab 3.97b 3.95bc 9.25 4.08c 2.12ab 5.69c 4.82c 2.82 2.35b
SEM 1.667 0.662 0.095 0.060 0.057 0.143 0.062 0.034 0.103 0.066 0.044 0.033
P值P-value 0.143 <0.001 0.037 0.037 0.022 0.130 0.005 0.002 0.004 0.002 0.067 <0.001
项目
Items		 亮氨酸
Leucine		 酪氨酸
Tyrosine		 苯丙氨酸
Phenylalanine		 赖氨酸
Lysine		 组氨酸
Histidine		 精氨酸
Arginine		 脯氨酸
Proline		 必需氨基酸
EAA		 非必需氨基酸
NEAA		 总氨基酸
Total amino acid
组别Groups
NC 3.48abc 1.47c 1.38bc 2.53bc 2.82a 5.30a 7.12a 17.32b 53.18a 70.50a
PC 3.34c 1.42c 1.31c 2.44c 2.67b 5.05b 6.66b 16.88b 50.48b 67.35b
MnG 3.55ab 1.52ab 1.42ab 2.64a 2.92a 5.37a 6.63b 18.03a 53.02a 71.06a
ZnG 3.60a 1.59a 1.48a 2.63ab 2.90a 5.29a 6.51b 18.08a 52.75a 70.83a
SeG 3.40c 1.51b 1.46ab 2.45c 2.60b 4.89b 5.97c 17.29b 50.04b 67.34b
SEM 0.053 0.024 0.032 0.035 0.036 0.074 0.098 0.237 0.724 0.952
P值P-value 0.007 <0.001 0.003 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 0.003 0.005 0.008

2.3 有机锰、锌和纳米硒-褐藻寡糖对蛋鸡蛋壳腺功能的影响

由表7可知,与NC组相比,PC组钙结合蛋白D28k (CaBP-D28k) mRNA相对表达量显著下调(P<0.05)。与PC组相比,MnG组CA和CaBP-D28k mRNA相对表达量显著上调(P<0.05),ZnG组和SeG组雌激素受体α(ERα)mRNA相对表达量显著上调(P<0.05)。
表7 饲粮添加有机锰、锌和纳米硒-褐藻寡糖对蛋鸡蛋壳腺基因表达的影响

Table 7 Effects of dietary organic manganese, zinc and nano-selenium alginate oligosaccharides supplementation on eggshell gland gene expression of laying hens

项目
Items		 雌激素受体α
ERα		 碳酸酐酶
CA		 钙ATP酶
CaATP		 钙结合蛋白D28k
CaBP-D28k
组别Groups
NC 1.00b 1.00c 1.00 1.00a
PC 0.78b 1.39bc 0.60 0.29b
MnG 1.68ab 2.91a 1.17 1.02a
ZnG 2.23a 2.56ab 1.15 0.70ab
SeG 2.27a 2.53ab 0.78 0.53ab
SEM 0.303 0.448 0.168 0.187
P值P-value 0.002 0.015 0.090 0.038

3 讨论

3.1 有机锰、锌和纳米硒-褐藻寡糖对蛋鸡蛋品质的影响

杜元军等[16]研究指出,暗斑蛋相较于正常蛋具有更厚更重且更高强度的蛋壳结构。本研究发现,相较于正常蛋,暗斑蛋表现出了更高的蛋壳强度,这一结论与其研究结果相似。李亚杰等[17]的研究结果表明,在41周龄蛋鸡饲粮中添加1 000 mg/kg的L-丝氨酸能显著降低蛋壳暗斑的发生。
另外,张继良等[18]在蛋鸡的饲粮中添加了活性维生素D3及锌锰复合物也显著增强蛋壳的厚度和强度,降低暗斑的发生率。此外,研究表明,酵母硒可通过调节蛋壳的矿化过程有效提高蛋壳强度,降低蛋壳的透光率[12]。在本研究中,蛋鸡饲粮中添加有机锰、锌和纳米硒-褐藻寡糖较PC组显著降低了鸡蛋暗斑评分平均值,其中第8周时,ZnG组的暗斑评分平均值是各添加组中最低的,但均高于NC组,并且各添加组较PC组均降低了暗斑评分3~5分的比例,增加了暗斑评分0~2分的比例,这与以前的研究结果[13,18]一致。

3.2 有机锰、锌和纳米硒-褐藻寡糖对蛋鸡蛋壳质量的影响

蛋壳是禽蛋的重要组成部分,它可固定鸡蛋内容物的形状,保护胚胎免受物理损害和微生物侵害。本试验结果表明,与NC组相比,PC组蛋壳水分含量显著增加,蛋壳钙含量显著降低。研究结果显示,在蛋鸡饲粮中添加80 mg/kg蛋氨酸锌能够显著提高蛋壳腺中的钙离子浓度,同时也可促进矿化过程中HCO3-的生成[19],增加蛋壳钙沉积量[8],提升蛋壳质量和强度。此外,陈连民等[20]研究结果表明,有机锰、锌的使用可能改善了钙在蛋壳中的积累程度,从而提高了蛋壳品质。在本研究中,与PC组相比,各添加组蛋壳水分含量均显著降低,值得注意的是,MnG组蛋壳钙含量显著增加。此外,研究还表明,乳突的排列顺序及大小直接影响整个蛋壳的形成并影响蛋壳质量[21]。本试验电镜结果表明,PC组乳突层厚度相较于NC组显著增加。深入探究其原因,笔者推测可能是因为暗斑蛋稀疏的内膜网状结构使钙质在蛋壳钙化过程中覆盖不均匀。锰参与蛋壳酸性黏多糖和糖蛋白的合成,有助于形成蛋壳的有机基质[22],增加蛋壳乳突的密度,改善蛋壳的超微结构,从而提升蛋壳的品质[23]。在本试验中,在暗斑发生率的蛋鸡饲粮中添加有机锰和纳米硒-褐藻寡糖均显著降低了蛋壳乳突层厚度。肖俊峰[24]研究发现,基础饲粮中添加锰显著降低了乳突层高度,与本试验研究结果一致。
有研究指出,蛋壳膜中纤维蛋白的含量不足会导致蛋壳膜出现较大的孔隙和较薄的厚度。这种结构上的缺陷使得蛋内的水分更容易渗透进入蛋壳的石灰质部分,最终促使暗斑的形成[25]。同时也有研究表明,暗斑蛋壳膜蛋白质含量显著低于正常组[1]。本试验研究结果也发现,PC组较NC组显著降低了蛋壳膜粗蛋白质含量,这与前人研究结果相似。此外,饲粮中添加有机锰、锌和纳米硒-褐藻寡糖显著增加了蛋壳膜粗蛋白质的含量,表明饲粮中添加有机微量元素可能通过增加蛋壳膜粗蛋白质含量,降低鸡蛋内部水分透过蛋壳膜进入蛋壳的概率,减少水分在蛋壳中的沉积,从而表现为鸡蛋蛋壳暗斑的减少。有文献指出,高暗斑组中蛋壳膜苏氨酸、甘氨酸、胱氨酸、组氨酸、精氨酸和脯氨酸等氨基酸含量均显著低于正常组[26]。同时也有研究表明,蛋鸡在脯氨酸、赖氨酸代谢上的差异导致蛋壳膜总蛋白含量减少,从而影响蛋壳膜物理性质是暗斑产生的原因[27]。本试验研究发现,与正常组相比,暗斑组蛋壳膜中大部分水解氨基酸和总氨基酸的含量显著降低,其中脯氨酸和总氨基酸含量的降低与前人研究结果[28]一致。此外,蛋鸡饲粮中添加有机锰、锌显著增加了蛋壳膜中必需氨基酸和总氨基酸的含量,推测有机锰和锌的添加可能通过增加蛋壳膜中氨基酸的含量增加蛋壳膜总蛋白含量,使蛋内出来的水分不易通过该膜浸透到蛋壳,同时使蛋壳的晶体结构更致密,降低外界水分进入蛋壳的概率从而降低暗斑的产生。

3.3 有机锰、锌和纳米硒-褐藻寡糖对蛋鸡蛋壳腺功能的影响

禽类子宫部又被称为“蛋壳腺”,是蛋壳形成的主要部位[28]。蛋壳的形成是一个高度复杂的过程,其超微结构的变化和蛋品质的降低可能与子宫部生物矿化相关基因有关[29-30]。本研究发现,与NC组相比,PC组CaBP-D28k mRNA相对表达量显著降低,表明高暗斑组可能通过下调CaBP-D28k mRNA相对表达量减少蛋壳钙沉积,降低蛋壳质量,促进暗斑的形成。本研究还发现,饲粮中添加有机锰能显著上调蛋壳腺CA和CaBP-D28k mRNA相对表达量。前人研究表明,饲粮中补充锰参与蛋壳腺体中蛋白多糖和糖蛋白的代谢和基因表达[31]。这与Li等[32]研究发现添加矿物质的饲粮并未影响老龄母鸡蛋壳腺中CaBP-D28k的表达不一致,可能是由于添加量、饲养条件以及蛋鸡的品种存在差异。此外,Yang等[33]研究表明,CA主要参与钙离子从肠道到蛋壳腺的流动,导致高HCO3-在蛋壳腺中沉积钙离子。本试验结果表明,饲粮中添加有机锰通过上调CA和CaBP-D28k mRNA相对表达量改善蛋壳腺功能,促进蛋壳钙沉积,提高蛋壳质量。

4 结论

综上所述,相较于暗斑发生率较低的蛋鸡,暗斑发生率较高的蛋鸡其蛋壳腺(子宫)功能有所下降,蛋壳质量及蛋壳膜中的氨基酸含量显著减少,同时蛋壳的水分含量和乳突层的厚度有所增加。在暗斑发生率较高的蛋鸡饲粮中添加120 mg/kg锰(60 mg/kg羟基蛋氨酸锰+60 mg/kg MnSO4)、110 mg/kg 锌(55 mg/kg羟基蛋氨酸锌+55 mg/kg ZnSO4)或0.3 mg/kg纳米硒-褐藻寡糖能降低鸡蛋蛋壳暗斑程度并降低蛋壳水分含量和乳突层厚度,增加蛋壳膜粗蛋白质和氨基酸含量,这可能与其提高蛋壳腺钙代谢相关基因表达从而提高蛋壳腺的功能有关。

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