在宠物营养领域,营养补充剂如益生菌、膳食纤维和不饱和脂肪酸已被广泛证实对肠道健康具有积极影响。凝结芽孢杆菌属是革兰氏阳性芽孢形成菌,具有改善消化道功能、提升营养状况和增强免疫力的功能;此外,其还因具有保护性蛋白外壳等特性,在加工和储存过程中展现出良好的稳定性[1]。膳食纤维作为益生元的一种,能够通过调节肠道菌群平衡,对促进肠道健康和预防疾病发挥着重要作用[2-3]。膳食纤维可分为可溶性膳食纤维(soluble dietary fiber,SDF)和不可溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber,IDF),各自具有独特的生理功能[4]。同时,ω-3多不饱和脂肪酸因其抗氧化、抗癌、免疫调节及改善宠物毛发等多重功效而备受关注[5]。
本研究将凝结芽孢杆菌、多种来源的膳食纤维(包括干菊苣根、南瓜、蓝莓、胡萝卜及蔓越莓)以及ω-3与ω-6不饱和脂肪酸按1∶3比例结合,形成一种复合益生组合物,并系统性评估其对猫生长性能、养分表观消化率、免疫功能、抗氧化能力、毛发健康以及肠道菌群的综合影响,旨在评估该益生制剂对猫营养和健康的影响,从而为未来的营养干预措施提供可能的科学支持。
1 材料与方法
1.1 试验动物及试验设计
本试验在北京山宠水福宠物营养试验中心进行,试验经过中国农业大学实验动物福利与动物实验伦理审查委员会批准(批准编号:Aw 80404202-2-1)。试验选取日龄、体重接近的健康成年英国短毛猫16只,随机分为2组,每组8只(其中对照组1只猫由于身体原因,中期退出试验),进行单笼饲喂。对照组饲喂基础饲粮;试验组饲喂在基础饲粮中添加复合益生组合物的饲粮,每100 g猫粮含2×107 CFU凝结芽孢杆菌、1.15 g膳食纤维和4 g不饱和脂肪酸。基础饲粮按照NRC(2006)推荐营养水平配制,其营养水平见表1。预试期2周,正试期6周。试验期间监测猫的日采食量、体重变化、粪便质量和腹泻率,并在试验结束时采集血液和粪便样本,以评估血常规指标、血清生化指标、免疫功能、抗氧化能力以及肠道菌群。
表1 基础饲粮营养水平(风干基础)Table 1 Nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % |
| 项目Items | 含量Content |
|---|---|
| 干物质Dry matter | 94.10 |
| 粗蛋白质Crude protein | 30.01 |
| 粗脂肪Ether extract | 12.60 |
| 粗纤维Crude fiber | 2.30 |
| 粗灰分Ash | 6.90 |
| 钙Calcium | 1.29 |
| 磷Phosphate | 1.14 |
| 水溶性氯化物Water-soluble chloride | 0.65 |
| 牛磺酸Taurine | 0.13 |
| 总能GE/(MJ/kg) | 20.39 |
营养水平为测定值。 | |
Nutrient levels were measured values. |
1.2 指标测定
1.2.1 生长性能和粪便质量
记录试验猫每周的体重和日采食量;根据表2粪便评分标准进行粪便评分,测定粪便pH;并记录试验期间猫的腹泻次数,根据腹泻天数计算腹泻率。
表2 粪便评分标准Table 2 Fecal scoring standard |
| 评分Score | 评分依据Scoring basis |
|---|---|
| 1 | 硬、干、小且易碎的硬块,轻捏即粉碎 |
| 2 | 坚硬、成形、干燥的粪便,拾起粪便时地面上仅少量残留,不变形 |
| 3 | 柔软、成形且潮湿的粪便,无裂缝,有清晰的形状,拾起时会变形 |
| 4 | 柔软、未成形的粪便,粪便湿度较大 |
| 5 | 粪便完全呈液态 |
1.2.2 养分表观消化率
在正试期第6周连续5 d收集所有粪便,对其称重并储存于-20 ℃冰柜中待分析。采用相应国标方法测定饲粮和粪便样品中干物质(GB/T 6435—2014)、粗蛋白质(GB/T 6432—2018)、粗脂肪(GB/T 6433—2006)、粗纤维(GB/T 6434—2006)、粗灰分(GB/T 6438—2007)、钙(GB/T 6436—2018)、磷(GB/T 6437—2018)、水溶性氯化物(GB/T 6439—2023)和牛磺酸(GB 5009.169—2016)含量,并采用氧弹式测热仪测定饲粮和粪便样品总能(ISO 9831:1998)。养分表观消化率计算公式如下:
某养分表观消化率(%)=100×(饲粮中该养分含量-粪便中该养分含量)/饲粮中该养分含量。
1.2.3 血液指标
试验结束时,对每只猫进行前肢静脉采血。将一部分血液收集在含乙二胺四乙酸(EDTA)的采血管中用于血常规指标的检测,另一部分血液分离血清用于血清生化、免疫和抗氧化指标的检测。血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)含量均采用江苏酶免实业有限公司生产的试剂盒测定,测定方法按照说明书操作。血清总抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性以及丙二醛(MDA)含量均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定,测定方法按照说明书操作。
1.2.4 毛发健康
试验结束时,收集每只猫背部毛发少许,由5名非专业人员参照毛皮状况评判标准对各组猫毛皮光泽度和柔顺度指标进行毛发评分(hair score,HS)。所有样品使用以下5个等级进行评分:1=暗淡,粗糙,干燥;2=中等反光,中等柔和;3=高度反光,非常柔软;4=中等软,中等油腻;5=非常油腻。其中,1≤HS≤2为干燥,2<HS<4为理想,4≤HS≤5为油腻。通过扫描电子显微镜测量毛发样品鳞片层的结构特征,包括毛发厚度、毛发高度和毛发直径。
1.2.5 肠道菌群
试验结束时,采集每只猫的新鲜粪便样本,利用16S rDNA测序技术对样品进行检测。采用E.Z.N.A.® Soil DNA试剂盒提取粪便微生物总DNA,使用通用引物341F(5'-CCTACGGGRSGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3')进行扩增并构建文库,测序服务由上海美吉生物医药科技有限公司完成。所得序列根据相似度≥97%原则进行操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU)聚类。
1.3 数据处理和统计分析
采用SPSS 26.0软件进行独立样本t检验,结果数据以“平均值±标准差”表示,P<0.05为差异显著,0.05<P<0.10为差异有显著趋势。
2 结果与分析
2.1 复合益生组合物对猫生长性能和粪便质量的影响
由表3可知,与对照组相比,试验组猫日采食量、粪便评分、粪便pH和体重变化均无显著差异(P>0.05)。对照组和试验组猫试验期间日采食量分别为44.38和43.76 g,腹泻率分别为4.96%和1.30%。
表3 复合益生组合物对猫生长性能和粪便质量的影响Table 3 Effects of compound prebiotic composition on growth performance and fecal quality of cats |
| 项目 Items | 对照组 Control group | 试验组 Experimental group | P值 P-value |
|---|---|---|---|
| 日采食量Daily feed intake/g | 44.38±5.73 | 43.76±11.06 | 0.897 |
| 粪便评分Fecal score | 2.36±0.36 | 2.22±0.17 | 0.340 |
| 腹泻率Diarrhea rate/% | 4.96 | 1.30 | |
| 粪便pH Fecal pH | 6.41±0.44 | 6.61±0.35 | 0.369 |
| 体重变化Body weight change/kg | -0.12±0.14 | -0.05±0.23 | 0.518 |
同行数据肩标无字母表示差异不显著(P>0.05),不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。 | |
In the same row, values with no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below. |
2.2 复合益生组合物对猫养分表观消化率的影响
由表4可知,与对照组相比,试验组猫各养分表观消化率均无显著差异(P>0.05)。
表4 复合益生组合物对猫养分表观消化率的影响Table 4 Effects of compound prebiotic composition on nutrient apparent digestibility of cats % |
| 项目 Items | 对照组 Control group | 试验组 Experimental group | P值 P-value |
|---|---|---|---|
| 干物质DM | 73.38±0.68 | 74.34±1.89 | 0.228 |
| 粗蛋白质CP | 79.09±1.38 | 81.06±2.58 | 0.095 |
| 粗脂肪EE | 88.13±1.95 | 87.91±2.91 | 0.868 |
| 粗纤维CF | 58.77±3.49 | 59.11±3.80 | 0.858 |
| 粗灰分Ash | 52.30±3.31 | 51.10±2.47 | 0.437 |
| 钙Ca | 47.07±10.46 | 44.18±8.00 | 0.555 |
| 磷P | 61.26±3.07 | 60.64±4.35 | 0.756 |
| 总能GE | 80.26±0.52 | 79.55±2.22 | 0.429 |
2.3 复合益生组合物对猫血常规指标和血清生化指标的影响
表5 复合益生组合物对猫血常规指标的影响Table 5 Effects of compound prebiotic composition on routine blood indices of cats |
| 项目 Items | 对照组 Control group | 试验组 Experimental group | P值 P-value |
|---|---|---|---|
| 白细胞数目WBC/(×109个/L) | 10.13±2.08 | 11.07±1.73 | 0.375 |
| 红细胞数目RBC/(×1012个/L) | 9.34±1.44 | 9.73±1.47 | 0.608 |
| 血红蛋白HGB/(g/L) | 135.43±22.04 | 135.25±13.80 | 0.985 |
| 血小板数目PLT/(×109个/L) | 256.43±121.96 | 180.13±62.34 | 0.143 |
| 淋巴细胞数目LY/(×109个/L) | 2.55±0.89 | 3.27±0.79 | 0.118 |
| 单核细胞数目MON/(×109个/L) | 1.45±1.30 | 1.45±1.89 | 0.993 |
| 中性粒细胞数目NC/(×109个/L) | 4.98±1.75 | 7.09±2.82 | 0.112 |
| 红细胞比容HCT/% | 44.57±7.53 | 44.63±5.01 | 0.987 |
| 红细胞平均体积MCV/fL | 47.78±2.64 | 46.25±3.58 | 0.373 |
| 平均红细胞血红蛋白含量MCH/pg | 14.46±0.59 | 13.99±1.29 | 0.376 |
| 平均红细胞血红蛋白浓度MCHC/(g/L) | 301.00±3.52 | 302.63±5.13 | 0.778 |
| 红细胞体积分布密度RDW/% | 17.53±1.18 | 17.20±1.63 | 0.666 |
表6 复合益生组合物对猫血清生化指标的影响Table 6 Effects of compound prebiotic composition on serum biochemical indices of cats |
| 项目 Items | 对照组 Control group | 试验组 Experimental group | P值 P-value |
|---|---|---|---|
| 葡萄糖GLU/(mmol/L) | 4.95±1.10 | 5.04±0.85 | 0.862 |
| 甘油三酯TG/(mg/dL) | 42.71±16.45 | 37.09±12.44 | 0.465 |
| 高密度脂蛋白胆固醇HDL-C/(mg/dL) | 70.94±6.60 | 66.42±7.59 | 0.244 |
| 低密度脂蛋白胆固醇LDL-C/(mg/dL) | 24.27±11.29 | 19.70±9.80 | 0.413 |
| 总蛋白TP/(g/L) | 79.56±4.18 | 80.15±4.03 | 0.784 |
| 白蛋白ALB/(g/L) | 26.44±3.48 | 26.63±4.17 | 0.929 |
| 球蛋白GLB/(g/L) | 53.11±5.52 | 53.50±4.64 | 0.885 |
| 谷丙转氨酶ALT/(U/L) | 51.00±20.98 | 47.75±18.08 | 0.752 |
| 谷草转氨酶AST/(U/L) | 18.30±4.39 | 18.26±7.25 | 0.991 |
2.4 复合益生组合物对猫血清免疫指标的影响
由表7可知,与对照组相比,试验组猫血清IgM含量显著提高(P<0.05),血清IgG和IgA含量无显著差异(P>0.05)。
表7 复合益生组合物对猫血清免疫指标的影响Table 7 Effects of compound prebiotic composition on serum immune indices of cats g/L |
| 项目 Items | 对照组 Control group | 试验组 Experimental group | P值 P-value |
|---|---|---|---|
| 免疫球蛋白G IgG | 18.81±2.09 | 17.98±2.11 | 0.507 |
| 免疫球蛋白A IgA | 0.30±0.03 | 0.31±0.04 | 0.450 |
| 免疫球蛋白M IgM | 1.47±0.15b | 2.00±0.34a | 0.006 |
2.5 复合益生组合物对猫血清抗氧化指标的影响
由表8可知,与对照组相比,试验组猫血清SOD活性显著提高(P<0.05),血清T-AOC、GSH-Px和CAT活性以及MDA含量均无显著差异(P>0.05)。
表8 复合益生组合物对猫血清抗氧化指标的影响Table 8 Effects of compound prebiotic composition on serum antioxidant indices of cats |
| 项目 Items | 对照组 Control group | 试验组 Experimental group | P值 P-value |
|---|---|---|---|
| 超氧化物歧化酶SOD/(U/mL) | 37.45±8.55b | 80.93±11.81a | <0.001 |
| 谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px/(U/mL) | 1 567.42±31.72 | 1 639.18±146.26 | 0.310 |
| 总抗氧化能力T-AOC/(U/mL) | 8.42±3.29 | 8.25±4.06 | 0.930 |
| 过氧化氢酶CAT/(U/mL) | 27.36±13.07 | 28.76±10.52 | 0.834 |
| 丙二醛MDA/(nmol/mL) | 10.88±5.50 | 7.95±3.66 | 0.238 |
2.6 复合益生组合物对猫毛发健康的影响
由表9可知,与对照组相比,试验组猫毛发评分呈上升趋势(P=0.078),毛发毛躁程度有所改善;2组间毛发直径、毛发高度和毛发厚度均无显著差异(P>0.05)。
表9 复合益生组合物对猫毛发健康的影响Table 9 Effects of compound prebiotic composition on hair health of cats |
| 项目 Items | 对照组 Control group | 试验组 Experimental group | P值 P-value |
|---|---|---|---|
| 毛发直径Hair diameter/μm | 22.66±2.27 | 23.48±1.73 | 0.438 |
| 毛发高度Hair height/μm | 3.41±0.83 | 3.14±0.35 | 0.411 |
| 毛发厚度Hair thickness/μm | 0.23±0.07 | 0.19±0.08 | 0.374 |
| 毛发评分Hair score | 2.71±0.34 | 2.98±0.17 | 0.078 |
2.7 复合益生组合物对猫肠道菌群的影响
2.7.1 复合益生组合物对猫肠道菌群α多样性的影响
如图1所示,与对照组相比,试验组猫肠道菌群α多样性指数(Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数)无显著差异(P>0.05)。
2.7.2 复合益生组合物对猫肠道菌群结构的影响
如图2-C所示,在门水平,对照组和试验组猫肠道菌群的优势菌门均为厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteriota)、拟杆菌门(Bacteroidota)和变形菌门(Proteobacteria);且与对照组相比,试验组变形菌门相对丰度显著提高(P<0.05)。如图2-D所示,在属水平,猫肠道菌群主要包括柯林斯氏菌属(Collinsella)、消化梭菌属(Peptoclostridium)、布劳特氏菌属(Blautia)、链球菌属(Streptococcus)、巨球型菌属(Megasphaera)、Catenibacterium、未分类消化链球菌科 (unclassified_f_Peptostreptococcaceae)和普雷沃氏菌属(Prevotella)等,其中试验组Catenibacterium相对丰度较对照组有提高趋势(P=0.081)。
图2 复合益生组合物对猫肠道菌群结构的影响A:肠道菌群Venn图;B:肠道菌群β多样性(PCoA);C:肠道菌群在门水平上组成;D:肠道菌群在属水平上组成。 Fig.2 Effects of compound prebiotic composition on intestinal microflora structure of cats A: Venn diagram of; B: β diversity intestinal microflora (PCoA); C: intestinal microflora composition at phylum level; D: intestinal microflora composition at genus level. |
3 讨论
3.1 复合益生组合物对猫免疫功能的影响
免疫功能作为动物健康的重要指标,对于理解复合益生组合物在宠物营养中的潜在作用至关重要。本研究结果显示,与对照组相比,试验组猫血清IgM含量显著提高,而血清IgG和IgA含量则无显著差异。IgM作为体液免疫反应的早期标志物,其含量的提高可能表明复合益生组合物对猫体液免疫功能具有一定的促进作用。研究表明,凝结芽孢杆菌能够增强机体细胞免疫和体液免疫功能,提高动物的抗病能力[6]。ω-3多不饱和脂肪酸通过参与免疫细胞生物膜的组成,对提升机体免疫水平具有积极作用[5]。孙梅等[7]研究凝结芽孢杆菌制剂对断奶仔猪的影响发现,凝结芽孢杆菌可显著提高血清IgG和IgM含量。复合益生组合物对猫免疫功能的影响主要体现在血清IgM含量的提高上,这可能与复合益生组合物中各组分的协同作用有关。
3.2 复合益生组合物对猫毛发健康的影响
本研究评估了复合益生组合物对猫毛发健康的影响,结果显示,试验组猫毛发评分较对照组有所提高,表明复合益生组合物可能对改善猫的毛发质量具有潜在的积极作用。Rees等[8]使用含有亚麻籽的饲粮饲喂比格犬28 d后发现,其毛发评分显著提升,毛发质量得到改善。宋献艺等[9]研究发现,添加适量膳食纤维发酵苹果渣能够影响獭兔健康水平,提高其生长性能,并改善其被毛品质。本研究发现,试验组猫毛发评分得到改善,但毛发直径、毛发高度和毛发厚度等微观结构参数并未发生显著变化,这可能是因为复合益生组合物对毛发的宏观外观和触感有积极影响,而对毛发的微观结构影响有限。由此可知,复合益生组合物对猫毛发健康的影响主要体现在感官评价的改善上,而非毛发的微观结构。
3.3 复合益生组合物对猫抗氧化能力的影响
抗氧化能力是衡量机体清除自由基、抵御氧化应激的重要指标,对于维护细胞功能和机体健康至关重要。本研究中,与对照组相比,试验组猫血清SOD活性显著提高,而血清T-AOC、GSH-Px和CAT活性以及MDA含量则无显著差异,这表明复合益生组合物对促进猫体内特定抗氧化酶活性的提高具有积极作用。余魁等[10]研究表明,饲粮添加2×106 CFU/g凝结芽孢杆菌可以显著提高仔猪血浆SOD活性,显著降低血浆MDA含量。先前一项关于大鼠的研究表明,摄入膳食纤维可以通过调节抗氧化酶的活性来提高其抗氧化能力[11]。ω-3不饱和脂肪酸亦被证实能够通过减轻炎症反应和降低氧化应激来增强机体的抗氧化防御[5]。本研究中,试验组猫血清SOD活性显著升高,可能与复合益生组合物中各组分的协同作用有关。
3.4 复合益生组合物对猫肠道菌群的影响
肠道内的微生物具有影响宿主养分消化吸收、提高机体免疫力以及消灭外源病原微生物的作用[12-13];此外,肠道微生物及其功能产物会影响宿主健康[14]。研究发现,膳食纤维能够提高肠道有益菌的比例,并增加肠道微生物的丰富度和多样性,从而预防肥胖[15],抑制大肠杆菌等几种致病菌的生长[16]。Pu等[17]研究发现,后肠中的多种微生物可以发酵膳食纤维产生多种短链脂肪酸,不仅能促进有益微生物的生长,还能改善肠道的完整性和功能。Wang等[18]研究发现,凝结芽孢杆菌能够通过调节大鼠的肠道菌群,从而抑制内毒素诱导的大鼠盲肠组织炎症反应和氧化应激。本试验结果显示,在猫肠道菌群α多样性指数方面,试验组与对照组间未观察到显著差异,表明整体多样性未受干扰;但观察到试验组特有菌群数目增加,提示复合益生组合物可能促进了肠道中特定菌群的增长。此外,与对照组相比,在门水平上,试验组猫肠道菌群中变形菌门相对丰度显著提高;在属水平上,试验组猫肠道菌群中Catenibacterium相对丰度亦呈现提高趋势,这些变化可能与复合益生组合物的协同免疫调节作用有关。
除此之外,本试验发现,复合益生组合物的添加并未引起猫养分表观消化率、血常规指标、血清生化指标、腹泻率、日采食量和体重等的显著变化,表明该复合益生组合物未给猫的身体健康带来不良影响。而饲粮添加复合益生组合物使猫肠道中观察到特定益生菌的相对丰度提高,这些变化与肠道健康指标的改善相关;同时,试验组猫血清IgM含量和SOD活性显示出统计学上的显著提升,提示复合益生组合物可能对猫的免疫功能和抗氧化能力具有潜在的正面影响。
4 结论
饲粮添加由凝结芽孢杆菌、膳食纤维和不饱和脂肪酸复合而成的益生组合物可以提高猫血清IgM含量和SOD活性,同时改善肠道菌群结构和毛发评分,对提升猫的整体健康状况具有积极作用。