应激是指动物机体对外界或内部环境的超常刺激所产生的非特异性应答反应的总和。应激反应机制十分复杂,机体作为一个有机整体,通过神经-内分泌系统几乎动员所有器官和组织来对付应激原的刺激。其中,中枢神经系统特别是大脑皮质起整合作用,交感-肾上腺髓质轴和垂体-肾上腺皮质轴、垂体-甲状腺轴垂体-性腺轴起执行作用。应激与动物生产之间存在显著的互作关系,且应激对动物的生产性能和健康状况产生正面或负面的影响,取决于环境刺激的强度、持续时间以及动物的生理状态。当外界环境因子的变化超出家畜的适宜范围时,家畜会启动防御系统,以应对环境过度刺激带来的不利影响,从而在不适宜的环境条件下维持体内的生理平衡,当机体尚未适应或未能成功应对应激时,抵抗力和免疫力会显著下降,这可能直接或间接导致疾病的发生,并使机体对疫病的易感性增加,甚至可能导致死亡。此外,应激带来的危害并不止步于生产过程中,家畜屠宰后,过度的应激反应会产生一些有害代谢产物残留在肉类及肉制品中,导致肉品质严重下降[1]。应激原可以是外界的(例如早期断奶、过冷或热和长距离运输等),也可以是内部的(例如心情紧张、精神压抑、某些内部器官机能或生理生化过程发生障碍等),均可引起家畜应激。免疫应激和氧化应激是断奶应激、热应激和运输应激等其他应激的基础。通过科学合理地进行畜牧环境工程设计、提供适宜的饲养环境以及适时使用药物可有效减少应激反应。此外,疫苗接种和免疫增强手段也是预防应激导致健康问题的有效策略。近年来越来越多的学者发现,通过绿色无污染的营养调控措施来缓解应激引起的家畜机体损伤,是较为理想的选择。
多糖类化合物是一类由多个单糖通过糖苷键连接形成的复杂碳水化合物,常见单糖的分子式为C6H12O6,多糖可以表示为(C6H12O6)n,其中n代表单糖的重复单元数。随着聚合度的增加,多糖的分子质量也逐渐增大。多糖根据其组成和功能可分为多种类型,主要包括由同一种类的单糖单位组成的同多糖(如淀粉和纤维素等)和由不同种类的单糖单位组成的杂多糖(如植物多糖、动物多糖、微生物多糖和复合多糖等)。研究发现,多糖类化合物有抗病毒、免疫调节和抗氧化等多种生物学功能,广泛存在于植物、真菌、海藻和微生物中,具有安全、高效、毒副作用小、残留少等优点,在食品、医药、保健品领域中具有广泛的应用前景。因此,本文主要综述了多糖类化合物作为饲料添加剂对动物免疫应激和氧化应激的缓解作用,以期为多糖类化合物作为饲料添加剂的开发和使用提供理论依据。
1 多糖类化合物对动物免疫应激的缓解作用
免疫应激是指由外源免疫刺激(如过度免疫、病原菌感染和药物滥用等)引起的免疫系统的过度激活[2],畜禽往往表现为体温升高、食欲减退、肠道微生物区系紊乱等,与此同时,机体会动用营养物质合成免疫效应分子,以抵抗免疫应激。免疫应激引起的一系列变化势必会造成动物生长阻滞,而多项研究已表明在动物饲粮中添加多糖类化合物可缓解免疫应激对动物生长的负面影响。研究发现,刺五加多糖改善了在免疫应激状态下仔猪的生长性能[3];黄芪多糖不仅可以缓解免疫应激状态下仔猪的日增重下降[4],还可以缓解免疫应激状态下肉仔鸡和肉鸭的生长阻滞[5-6]。本课题组研究发现,黑沙蒿多糖也展现出缓解免疫应激的作用,饲粮中添加黑沙蒿多糖能够有效缓解脂多糖(LPS)引起的肉仔鸡生长性能的下降,并加强机体清除自由基的能力,一定程度上减轻了肠道损伤,从而缓解肉仔鸡的免疫应激[7]。除植物多糖外,动物多糖的缓解作用也被逐渐发掘。研究表明,牡蛎多糖可以提高断奶仔猪的生长性能,并对免疫应激仔猪的肠道健康有缓解作用,且与过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的基因表达有关[8]。综上所述,多糖类化合物通过增强机体抗氧化能力以及减少肠道损伤,从而缓解免疫应激对畜禽生长性能的负面影响。
畜禽的肠道屏障主要由机械屏障、化学屏障、微生物屏障以及免疫屏障构成。畜禽在生长过程中(特别是在早期发育阶段),环境和营养应激等因素对肠道屏障的影响可导致其损伤,进而引发免疫功能下降和肠道微生物群失衡,这可能导致动物的生长性能降低,疾病频发,甚至引发死亡[9]。用LPS建立仔猪免疫应激模型,在基础饲粮中添加0.10%的牛膝多糖可增加肠道绒毛长度,降低隐窝深度,从而改善LPS应激后仔猪肠道屏障损伤[10]。在饲粮中添加香菇多糖能有效缓解LPS刺激造成的仔猪肠道形态损伤,进而保护肠黏膜结构的完整性[11]。另有研究指出,刺五加多糖能够通过降低免疫应激状态下仔猪血浆中D-乳酸(肠黏膜通透性指标)的含量,降低仔猪腹泻发病率和发病程度[3]。Song等[12]研究表明,黄芪多糖可缓解患有坏死性肠炎肉仔鸡回肠组织中闭锁蛋白(Occludin)和闭合小环蛋白(ZO)-2的mRNA表达水平的下降。白术多糖可缓解LPS引起的雏鹅血清中内毒素、C反应蛋白以及促炎因子含量的上调,减少各肠段的组织损伤,使小肠的免疫球蛋白A(IgA)分泌细胞数量恢复,这可能与白术多糖缓解LPS引起的Toll样受体4(TLR4)、Occludin和ZO-1的mRNA表达水平异常有关[13]。
有体外研究利用细胞培养技术,建立LPS诱导的肠上皮细胞-巨噬细胞(Caco2-RAW264.7)共培养肠道炎症模型来模拟肠道微环境,结果表明,黑灵芝多糖能通过提高肠道碱性磷酸酶和二胺氧化酶活性,増加ZO-1、Occludin和闭合蛋白(Claudin)3种紧密连接蛋白的mRNA表达水平,降低Caco2-RAW264.7共培养模型通透性,从而改善LPS刺激引起的屏障功能损伤[14]。其他研究者也进行了相关研究,结果表明当受损伤的仔猪小肠上皮细胞(IPEC-J2细胞)培养体系中单独添加黄芪多糖、白术多糖及牛膝多糖时,能提高LPS作用下IPEC-J2细胞增殖率和跨膜电阻值,减少细胞中碱性磷酸酶的活性和细胞麦芽糖酶的流失,起到降低小肠上皮细胞膜的通透性的作用;此外,三者联合或单独使用还能提高Occludin和ZO-1的mRNA表达水平,缓解由于LPS诱导的小肠上皮细胞的损伤[15]。以上结果表明,多糖类化合物能够缓解LPS诱导的动物肠道炎症的症状,在免疫屏障和机械屏障方面保护肠黏膜屏障功能。
研究发现,葛根多糖可上调腹泻犊牛肠道中拟杆菌门和放线菌门的相对丰度,下调变形菌门的相对丰度,从而调节肠道微生态平衡,降低动物腹泻的发生率[16]。因此,有研究者从微生物群落组成的角度,通过LPS刺激建立动物免疫应激模型,进一步揭示了多糖类化合物改善肠道微生态的作用机制。白术多糖通过维持雏鹅肠道中罗姆布茨菌(Romboutsia)数量的相对稳定从而改善LPS引起的肠道菌群失衡,进而维持雏鹅微生物屏障的稳定,保护肠黏膜免疫功能[13]。对于LPS诱导产生免疫应激的仔猪,添加800 mg/kg刺五加多糖的效果优于对照组,其粪便大肠杆菌数量、回肠和盲肠内容物pH显著下降,粪便乳酸杆菌数量显著升高[3]。饲粮中添加多糖类化合物可改善断奶羔羊瘤胃发酵以及瘤胃微生物菌群多样性及其相对丰度,影响瘤胃代谢物和代谢通路[17],同时促进小肠各段发育并改善肠道菌群组成[18],从而缓解断奶羔羊应激性腹泻,提高生长性能。综上所述,多糖类化合物可被动物胃肠道后段的微生物发酵利用,选择性地促进有益菌在肠道中的生长繁殖,同时抑制有害菌的增殖,从而缓解免疫应激状态下动物的炎症反应。
免疫应激会损伤机体的免疫系统,而多糖对免疫应激状态的缓解主要包括促进免疫器官的生长发育,促进和维持机体细胞免疫、体液免疫及黏膜免疫功能的相对稳定这几个方面。刺五加多糖和牛膝多糖均可缓解LPS引起的淋巴细胞数目减少,提高白细胞数量和中性粒细胞的数量和比例,降低淋巴细胞比例(与LPS有一定的拮抗作用),进而增强机体免疫功能,缓解和改善仔猪的免疫应激[3,19]。然而,也有研究表明,饲粮中添加刺五加多糖会显著降低外周血中的白细胞和中性粒细胞数量[20],这与先前的研究不相一致,可能是由于多糖的饲喂量和试验动物应激程度的不同导致的。大量研究表明,多糖类化合物可促进淋巴细胞的增殖与分化。鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖及其纯化组分对刀豆蛋白A(ConA)诱导的小鼠淋巴细胞增殖与LPS刺激的B淋巴细胞增殖均有一定协同作用[21]。黑果枸杞叶多糖对未经诱导和经ConA或LPS诱导的正常小鼠体外脾淋巴细胞增殖具有显著的促进作用[22]。
多糖类化合物不仅能够通过促进淋巴细胞的增殖来发挥缓解作用,还能通过恢复LPS导致的淋巴细胞形态的改变缓解免疫应激对机体造成的损伤。Xu等[23]研究发现,用LPS刺激单核巨噬细胞后,巨噬细胞会发生形态的改变,而添加黄芪多糖纳米颗粒可直接作用于免疫细胞,修复细胞的形态,使细胞恢复卵圆形,并改善细胞膜破损,减少细胞液外溢,发挥抗炎作用。添加人参多糖也能抑制由LPS引起的细胞形态和细胞增殖能力的变化[24]。多糖类化合物不仅在免疫细胞层面发挥缓解作用,还能够影响应激状态下免疫器官的发育,从而降低甚至消除免疫应激给机体带来的损伤。对于LPS刺激的仔猪,饲粮中添加刺五加多糖较饲喂基础饲粮的仔猪胸腺和脾脏指数显著升高[20]。对于病毒性肝炎导致的免疫应激的肉鸭,添加黄芪多糖可显著提高其脾脏指数、胸腺指数和法氏囊指数[6]。由此可见,饲粮中添加多糖类化合物具有促进免疫应激状态下动物免疫器官发育的作用。
免疫细胞释放的细胞因子是免疫系统中重要的信息分子,在免疫调节方面发挥着十分重要的作用。细胞因子分泌水平的高低能够在一定程度上体现机体的免疫状态。多糖类化合物可通过改善外周血免疫细胞数量、促进免疫细胞因子的分泌、增加免疫球蛋白的产生等途径,增强断奶幼畜免疫力和抗病力[25],进而提高幼畜的平均日增重和饲料转化率,增强幼畜的免疫力,提高成活率[26]。研究表明,刺五加多糖可提高断奶仔猪血清白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α含量[3];也可提高肠黏膜IL-10含量,降低肠黏膜IL-8含量,减少肠黏膜肥大细胞数量[20]。由此可见,饲粮中添加刺五加多糖可以缓解LPS连续刺激引起的断奶仔猪肠黏膜炎症反应。
近年来,牛膝多糖由于其显著的免疫调节作用备受瞩目,目前研究者对牛膝多糖的缓解作用进行了大量的体内与体外研究。秦文雅[10]以仔猪为研究对象,用LPS建立应激模型,探讨牛膝多糖对其免疫细胞释放的细胞因子含量的影响,结果表明,饲粮中添加0.1%的牛膝多糖后可以提高肠道IL-1β、IL-2、IL-6含量,降低TNF-α含量,有效缓解LPS对仔猪带来的免疫应激。同时,张文俊[17]对牛膝多糖缓解作用的研究也发现,给用LPS诱导应激的仔猪饲喂500 mg/kg的牛膝多糖可以显著降低应激仔猪血清TNF-α含量,增加类胰岛素生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)含量,有降低前列腺素E2(PGE2)含量的趋势,表明牛膝多糖可以有效地抑制炎症因子的分泌,增强仔猪的抗炎症作用。体外研究表明,牛膝多糖可显著减少免疫应激下仔猪空肠上皮细胞中促炎细胞因子分泌和表达,且与牛膝多糖的添加水平呈负相关关系[19]。
此外,多花黄精多糖可抑制LPS诱导的巨噬细胞M1型极化,抑制IL-6和TNF-α的分泌,具有抗炎作用[27]。类似的研究也表明,结肠炎小鼠中IL-1β的mRNA表达水平显著升高,而高剂量黄芪多糖处理后IL-1β的mRNA表达水平显著下调至正常水平[28]。黑灵芝多糖对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型具有保护作用,能降低促炎细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)、环氧化酶-2(COX-2)、活性氧(ROS)等炎症介质的表达,抵抗LPS诱导的炎症反应[14]。Kim等[29]采用高剂量LPS诱导的小鼠感染性休克败血症模型研究桑黄多糖的抗炎作用,结果显示桑黄多糖能够有效抑制细胞因子(如TNF-γ、IL-12、IL-1β)含量的升高;此外,该多糖能够调节细胞因子释放,并影响B细胞和巨噬细胞中主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅱ类分子的表达。研究表明,桑黄多糖显著降低血清中IL-2、IFN-γ和TNF-α含量,同时促进体外LPS激活的巨噬细胞自发凋亡,有效缓解败血症并表现出抗炎作用[29]。随后,Chang等[30]研究表明,桑黄子实体多糖能够有效抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞瘤细胞中一氧化氮(NO)的产生,并呈现明显的剂量效应。不同浓度的人参多糖均能显著降低由LPS诱导的促炎症因子IL-1β、TNF-α含量[24]。对羧甲基茯苓多糖体外缓解作用的研究发现,有LPS刺激时,该多糖的不同组分均能显著抑制由LPS诱导的RAW264.7细胞大量释放NO和IL-6、TNF-α及IL-1β,对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型有抑制作用,具有显著的抗炎活性;无LPS刺激时,该多糖的不同组分可不同程度地诱导NO、IL-6、TNF-α及IL-1β的产生,且生成量呈一定浓度依赖性,具有显著的免疫调节活性[31]。综上所述,多糖类化合物具有双向免疫调节作用,即对正常状态下的动物机体有轻微的免疫刺激作用,而对免疫应激状态下的动物,可通过抑制炎症因子的过量产生缓解其免疫应激。
2 多糖类化合物对动物氧化应激的缓解作用
如前所述,免疫应激与氧化应激密不可分,免疫应激的发生往往伴随着氧化应激的发生。氧化应激是指自由基生成增加或清除机制减弱,导致氧化与抗氧化失衡,造成机体损伤[32]。肠上皮细胞作为肠道黏膜的主要组成部分,其损伤被视为肠功能障碍的核心病理机制。在应激原的刺激下,肠上皮细胞常受到显著的氧化应激,过量自由基的积累最终导致肠道功能紊乱[33]。近年来,研究者进行了大量的体内和体外研究来探讨多糖类化合物能否消除或缓解伴随着免疫应激发生的氧化应激,进而提高机体健康状态。有研究以辣木叶多糖为添加剂,探究其对过氧化氢(H2O2)诱导的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)氧化损伤的保护作用,结果表明,辣木叶多糖抑制了细胞内ROS的生成,并降低了BMECs的凋亡率,同时保持了细胞膜和细胞结构完整性,且提高了BMECs中过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性,同时降低了丙二醛(MDA)含量[34]。曾涵芳等[35]也采用了同样的研究方法探讨了黄芪多糖对H2O2诱导的BMECs凋亡、氧化损伤及相关基因、蛋白表达的影响,结果也表明黄芪多糖显著降低了由H2O2导致的ROS含量的升高,同时还提高了SOD和GSH-Px活性,从而缓解了H2O2诱导的BMECs的氧化损伤。综上所述,辣木叶多糖和黄芪多糖均能提高H2O2诱导的BMECs中抗氧化酶活性,并减缓氧化损伤引起的BMECs凋亡,而这可能与多糖显著下调了凋亡基因B细胞淋巴瘤相关X蛋白(Bax)/B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)mRNA比值及半胱天冬蛋白酶-3(Caspase-3)的mRNA表达水平,且显著降低了Bax的蛋白表达水平,从而降低了H2O2诱导的细胞凋亡率有关[35]。
在随后的研究中,研究者在建立体外LPS诱导绵羊淋巴细胞氧化应激模型的基础上,通过在培养液中添加不同浓度(0~100 μg/mL)的酵母β-葡聚糖以探讨其对绵羊淋巴细胞抗氧化能力的影响,结果表明10 μg/mL酵母β-葡聚糖作用6 h后,与LPS组相比较,淋巴细胞内SOD和CAT活性极显著增加,MDA和ROS含量极显著降低,这说明酵母β-葡聚糖可抑制LPS诱导的淋巴细胞氧化损伤,对LPS诱导的绵羊淋巴细胞氧化损伤有良好的保护作用,且存在剂量依赖效应[36]。研究表明,在使用H2O2诱导的小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞氧化损伤模型中,阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)Z0206硫酸酯化多糖能够通过保护氧化损伤细胞的形态结构、提高抗氧化酶活性和线粒体膜电位,抑制Caspase-3的活化及DNA降解,从而对诱导的细胞氧化损伤提供保护,显示出其作为有效抗氧化剂的潜力[37]。黑灵芝多糖可以在一定程度上恢复丙烯醛诱导的巨噬细胞氧化损伤状态下的细胞活力,提高SOD和CAT活性,降低MDA含量,降低Kelch样环氧氯丙烷关联蛋白1(Keap1)的表达,提高核因子E2相关因子2(Nrf2)的表达,从而保护细胞免受氧化应激损伤[38]。黑果枸杞叶多糖也可有效抑制H2O2诱导的HeLa细胞氧化损伤[22]。辐射诱导细胞损伤模型的研究表明,大豆抗氧化多糖对细胞具有保护作用,大豆抗氧化多糖能有效抵御电离辐射造成的损害,显著提高辐射损伤小鼠脾细胞的活性,降低脾细胞DNA受损的程度,并提升细胞内抗氧化酶的活性,并降低MDA含量[39]。
大量的体内研究也证实了多糖对氧化应激的缓解作用。手掌参多糖提取物可提高肉羊生长性能,且能缓解氧化应激造成的生长性能和抗氧化性能下降的问题,具有一定的抗氧化应激作用[40]。红芪粗多糖可降低由LPS刺激导致断奶仔猪体内MDA含量的升高,并提高一氧化氮合酶(NOS)、SOD和GSH-Px活性,说明红芪粗多糖在一定剂量范围内可以有效减轻细胞受损程度,有效抑制LPS刺激所致的抗氧化酶活性降低,增强机体的抗氧化能力[41]。对于牛膝多糖的研究也得出了类似的结论,饲喂牛膝多糖可以显著降低仔猪血清MDA含量,提高血清GSH-Px活性和总抗氧化能力(T-AOC),表明牛膝多糖也可缓解仔猪的氧化应激[42]。霍山石斛多糖预处理可使四氯化碳(CCl4)处理的小鼠肝脏中MDA含量降低,恢复SOD、CAT、GSH-Px活性和谷胱甘肽(GSH)含量[43]。与此同时,有研究者选用CCl4诱发的急性肝脏损伤小白鼠动物模型,研究分析了粗茶树花多糖对肝脏抗氧化功能的影响,结果表明,茶树花多糖显著抑制了血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和门冬酸氨基转移酶(AST)活性,显著提高了肝脏中SOD和GSH-Px活性以及降低了肝脏中MDA的生成[44]。通过注射D-半乳糖构建小鼠氧化应激模型,研究者探讨了滇重楼多糖对机体氧化应激的缓解作用,结果表明,滇重楼多糖显著增加了小鼠体重,提高了其胸腺和脾脏指数,同时也提高了血清及小鼠各组织(脑、心脏和肝脏)中SOD、GSH-Px和CAT活性及T-AOC,并降低了血清及各组织中MDA含量[45]。Wang等[46]使用大肠杆菌诱导断奶犊牛氧化应激,并指出β-葡聚糖能提高断奶犊牛的抗氧化功能,降低大肠杆菌感染后氧化应激的发生率。
除了植物多糖,微生物多糖也因其显著的缓解氧化应激作用逐渐步入研究者的视野。猴头菇多糖能够有效改善氧化应激状态下仔猪的回肠形态结构及通透性。此外,猴头菇多糖显著降低了氧化应激状态下IPEC-J2细胞内ROS含量,同时提高了SOD和CAT活性,显著降低了MDA含量,提高了Occludin、Claudin和ZO-1的mRNA基因表达水平和ZO-1的蛋白表达水平,缓解了LPS诱导的氧化应激对IPEC-J2细胞屏障功能的损伤[47]。研究表明,鲍氏层孔菌菌丝体多糖可减弱D-半乳糖诱导的氧化应激反应,显著提高肝脏和血清中抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px活性以及T-AOC,显著降低肝脏和血清中MDA含量,同时还能提高小鼠的胸腺指数、脾脏指数和肝脏指数,抑制氧化应激所致的小鼠肝脏线粒体肿胀[21]。此外,动物多糖,例如青蛤粗多糖和牡蛎多糖锌配合物能够显著提高CCl4诱导脏肝损伤模型小鼠及LPS刺激断奶仔猪机体SOD、GSH-Px活性,并降低MDA含量[8,48]。综上所述,多糖类化合物可提高机体抗氧化酶活性,降低脂质过氧化物和氧自由基水平,并削弱对蛋白质和核酸的损伤,从而缓解了畜体的氧化应激。
3 小结
多糖类化合物作为饲料添加剂可通过促进免疫器官的生长发育,保护胃肠道黏膜屏障功能,改善胃肠道微生物菌群结构,缓解动物的免疫应激。此外,多糖类化合物可显著提高机体抗氧化酶活性,降低脂质过氧化物和氧自由基水平,从而缓解动物的氧化应激,减轻应激对畜禽的负面影响,从而提升其生长性能和畜产品质量。目前的研究主要集中于多糖类化合物对家畜健康的影响,但其发挥作用的具体机制也尚不清楚,例如多糖类化合物如何吸收代谢,通过何种方式作用于机体,受体是单一的某一种还是通过几种受体共同发挥作用,仍需进一步的研究。