Chinese Journal of Animal Nutrition >

2025 , Vol. 37 >Issue 4: 2498 - 2521

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.211

RESEARCH PAPER

Effects of Exopolysaccharides Produced by Lactic Acid Bacteria on Physiological Function and Gastrointestinal Microbiota of Lambs

  • ZHAO Meng , 1, 2 ,
  • MA Bo 3 ,
  • BAI Haitao 3 ,
  • LI Chunhe 3 ,
  • WANG Xiao 3 ,
  • DU Ruiping , 1, 2, *
Expand
  • 1 Institute of Animal Nutrition and Feed Science, Inner Mongolia Academy of Agricultural & Animal Husbandry Science, Hohhot 010031, China
  • 2 Key Laboratory of Grass-Feeding Livestock Healthy Breeding and Livestock Product Quality Control (Co-Construction by Ministry and Province), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hohhot 010031, China
  • 3 School of Life Science, Inner Mongolia University, Hohhot 010018, China
* professor, E-mail:

Received date: 2024-09-30

  Online published: 2025-04-15

Fold

Abstract

The main purpose of this experiment was to investigate the effects of exopolysaccharides (ESP) produced by lactic acid bacteria on the physiological function and gastrointestinal microbiota of lambs. Thirty Sonid lambs, approximately 15 days old and in good health with similar body weight [(7.07±1.73) kg], were randomly divided into five groups: the blank control group (CON group), Astragalus polysaccharide group (ASP group), low-dose ESP group (EPS-L group), medium-dose ESP group (EPS-M group), and high-dose ESP group (EPS-H group). Each group consisted of six lambs, with three males and three females. Each group of lambs was orally administered different volumes of solutions daily: the CON group was treated by normal saline, the ASP group was treated by Astragalus polysaccharide solution at a dose of 1.0 mg/(lamb·d), the EPS-L group, EPS-M group and EPS-H group were treated by lactic acid bacteria ESP solution at the doses of 0.5, 1.0 and 2.0 mg/(lamb·d), respectively. The oral administration was continuous for 49 days. Blood samples of lambs in each group were collected on the 14th, 28th and 42nd days of oral administration for biochemical analysis. On days 43 and 44 of the oral administration, E. coli challenge was conducted on lambs in the CON group, ASP group and EPS-H group. The challenge dose was 109 CFU per lamb. On day 49 of the oral administration, three lambs were randomly selected from each group for slaughter. Rumen contents and gastrointestinal tissue samples were collected to analyze rumen fermentation parameters and gastrointestinal microbial diversity. The results showed as follows: 1) serum glutathione peroxidase (GSH-Px) activity in the EPS-H group was significantly higher than that in the CON group (P≤0.05), and the plasma tumor necrosis factor-α (TNF-α) content in the EPS-M group was significantly lower than that in all other groups (P≤0.05). 2) Under E. coli treatment, the concentrations of various volatile fatty acids in the rumen contents showed no significant difference among the three groups (P>0.05), but the acetic acid/propionic acid ratio was higher in the APS group than that in the EPS-H group and the CON group. 3) The microbial α diversity of duodenum, jejunum and ileum samples were higher in EPS-H group than CON group and ASP group, and the microbial α diversity of rumen sample was higher in ASP group than EPS-H group and CON group. 4) The microbial markers with high expression level in gastrointestinal samples of the ESP-H group were Mycoplasmataceae, Coprococcus, Anaerostipes, Oxalobacteraceae, Eubacteriaceae, Rhizobiales, Erysipelotrichaceae, Actinomycetaceae, Streptomyces, Anaerofustis, Clostridium, Dorea and Peptostreptococcaceae. The metabolic functions of differentia microbiota between EPS-H group and CON group with significantly up-regulation of expression abundance were cyanogenic amino acid metabolism (rumen), toluene degradation and drug metabolism-other enzymes (duodenum), novobiocin biosynthesis, peroxisome proliferator-activated receptor signaling pathway and polycyclic aromatic hydrocarbon degradation (jejunum), meiosis yeast, renin-angiotensin system and polycyclic aromatic hydrocarbon degradation (ileum). In summary, ESP produced by lactic acid bacteria can improve the antioxidant capacity, immune ability and disease resistance of lambs to some extent, and alleviate the negative impact of E. coli on the microbial homeostasis of lambs’ gastrointestinal tract, and promote the healthy development of microbial health in lambs’ gastrointestinal tract.

Key words： exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria; lambs; physiological function; gastrointestinal microbiota

Cite this article

ZHAO Meng , MA Bo , BAI Haitao , LI Chunhe , WANG Xiao , DU Ruiping . Effects of Exopolysaccharides Produced by Lactic Acid Bacteria on Physiological Function and Gastrointestinal Microbiota of Lambs[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2025 , 37(4) : 2498 -2521 . DOI: 10.12418/CJAN2025.211

随着畜牧业快速发展,生产集约化程度不断提高,生产过程中相应的挑战和考验也随之而来。集约化饲养系统中,由于幼龄反刍动物的胃肠道微生物群落极不稳定[1],抗应激能力较弱,幼畜出生到断奶这一阶段胃肠道疾病的发病率居高不下[2],通过营养干预策略促进幼畜肠道发育,维持其功能和健康在反刍动物集约化生产系统中具有重要意义[3]。研究表明,反刍动物胃肠道微生物的早期发育和转化对其宿主健康有着长期的影响[4],不同的营养添加剂可以通过改变胃肠道微生物群落来影响宿主的抗应激能力[5]。因此,研发一种绿色高效的促进幼畜胃肠道微生物群落发育的营养添加剂就成为集约化饲养系统中亟待解决的问题。
乳酸菌是公认的绿色安全级微生物,其在自然界广泛分布[6],是人类和动物正常肠道菌群的天然组成部分[7],动物生产中常用于控制沙门氏菌[8]和大肠杆菌病原体的作用[9],这2种病原体是动物出生后第1周内最常见的细菌性致病原[10]。乳酸菌作为一种益生菌,有助于肠道抗原的降解和结构修饰,维持肠道菌群平衡。肠道菌群与宿主的生理状态特别是免疫功能密切相关[11],肠道菌群与肠上皮细胞和潜在的免疫与神经系统紧密地相互作用,形成微生物肠道保护屏障[12-13]。乳酸菌的生物活性会直接影响肠道菌群的代谢过程、动力学和宿主抵抗力[14]。目前已有的研究表明,乳酸菌的上述功能与其次级代谢产物胞外多糖(EPS)有关,乳酸菌在生长代谢过程中会不断分泌一种糖类化合物到细胞壁外,这种营养活性物质就是乳酸菌胞外多糖,胞外多糖已经证实具有抗过敏和抗炎特性,这些糖类化合物可以通过直接作用于免疫细胞或改善微生物结构以及提高短链脂肪酸的产生来调节宿主免疫反应,还可以通过增加细菌多样性及调节微生物菌群平衡,如提高产生短链脂肪酸细菌的占比、减少致病菌的占比,从而间接作用于宿主免疫功能[15]。此外,还有研究表明,乳酸菌胞外多糖还在微生物处于不利环境条件时对其具有保护作用,例如帮助微生物抵御脱水、营养缺乏、噬菌体、渗透胁迫、拮抗物和有毒物质对微生物的损伤[16],同时,乳酸菌胞外多糖具有降低胆固醇、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化和免疫调节等生理活性[17]。乳酸菌胞外多糖的免疫调节功能主要是通过激活免疫细胞(如巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞)以及提高单核细胞吞噬能力和调控免疫细胞因子(如补体、白细胞介素等)的分泌来调节机体的免疫功能[18-19]。乳酸菌胞外多糖调节免疫功能的能力与其结构和分子质量有关[20],随着研究的深入,乳酸菌作为益生菌已经商业化应用于食品工业中[21]。相比其他生物多糖,乳酸菌多糖作为细菌源多糖可以通过发酵工程实现量产,具有广阔的应用发展空间。但目前关于乳酸菌胞外多糖的生理活性研究主要集中在体外细胞培养和模式实验动物上,反刍动物营养方面乳酸菌胞外多糖的研究和应用并不多见,如果将乳酸菌胞外多糖应用于提高反刍动物幼畜免疫力及抗应激能力,关注幼畜从非反刍到反刍阶段的胃肠道微生物定向发育及免疫能力的获得与提高,将对反刍幼畜集约化生产管理提供新的解决思路。因此,本研究利用课题组前期筛选鉴定的具有良好免疫调节和抗炎作用的优势乳酸菌菌株干酪乳杆菌WXD30(Lactobacillus casei WXD30)作为生产菌株,利用发酵工程手段获得其胞外多糖,以15日龄羔羊作为试验对象,研究乳酸菌胞外多糖对羔羊生理机能及胃肠道菌群的影响,探讨乳酸菌胞外多糖作为新型绿色健康营养补充剂对羔羊抗应激及提高免疫力方面的功能作用,为羔羊初生阶段的绿色安全营养补充剂的开发及幼畜培育提供新的视角和理论及技术依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用乳酸菌胞外多糖采用水体醇沉法提取纯化自课题组前期鉴定保存的乳酸杆菌Lactobacillus casei WXD30,经离心、去除菌体、三氯乙酸除蛋白、过夜醇沉和透析冻干得到粗多糖,随后采用DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱和Sepharose CL-6B凝胶层析柱进行纯化后,透析冻干得到纯多糖,分装备用[22]。黄芪多糖(ASP)购自MACKLIN试剂公司,CAS编码为89250-26-0,货号为A860847,纯度大于98%。

1.2 试验设计与饲养管理

本研究动物试验在内蒙古乌兰察布市四子王旗内蒙古自治区农牧业科学院综合试验示范基地进行,试验过程中涉及动物福利与动物试验伦理等内容符合内蒙古自治区农牧业科学院科研处要求,批准号2022CXJJM05。
选取30只体重[(7.07±1.73) kg]相近、体况健康的15日龄左右的苏尼特羔羊,随机分为5组,分别为空白对照组(CON组)、黄芪多糖组(ASP组)、乳酸菌胞外多糖低剂量组(EPS-L组)、乳酸菌胞外多糖中剂量组(EPS-M组)和乳酸菌胞外多糖高剂量组(EPS-H组),每组6只羔羊,公母各3只。不同试验组羔羊进行分群管理,各组内试验羔羊采用混群饲养并随母哺乳。每日所用黄芪多糖和乳酸菌胞外多糖均使用35 mL生理盐水溶解后无菌包装备用。于每日09:00使用羔羊灌胃器将黄芪多糖或乳酸菌胞外多糖溶液对试验羔羊进行单只灌服处理,CON组则用等体积生理盐水进行灌服处理,连续灌服至试验结束,共计49 d。各组每日灌服溶质质量如表1所示。
表1 各组灌服溶质质量

Table 1 Mass of solute administered by each group

组别Groups 处理Treatment 溶质质量Solute mass/[mg/(只·d)]
CON 35 mL生理盐水
ASP 将黄芪多糖溶于35 mL生理盐水 1.0
EPS-L 将乳酸菌胞外多糖溶于35 mL生理盐水 0.5
EPS-M 将乳酸菌胞外多糖溶于35 mL生理盐水 1.0
EPS-H 将乳酸菌胞外多糖溶于35 mL生理盐水 2.0
试验期内试验羊按照牧场管理模式进行管理,羊舍通风、光照良好,卫生条件良好,羔羊随母哺乳,羔羊给予适量优质青干草和开食料,自由采食和饮水,羔羊开食料组成及营养水平见表2。
表2 羔羊开食料组成及营养水平(风干基础)

Table 2 Composition and nutrient levels of the starter feed (air-dry basis) %

项目Items 含量Content
原料Ingredients
玉米Corn 53.00
豆粕Soybean meal 33.00
小麦麸Wheat bran 5.50
菜籽粕Cottonseed meal 5.00
石粉Limestone 1.50
磷酸氢钙CaHPO4 0.50
氯化钠NaCl 0.50
预混料Premix 1.00
合计Total 100.00
营养水平Nutrient levels2)
干物质DM 86.82
粗蛋白质CP 21.26
粗脂肪EE 2.82
粗纤维CF 3.61
钙Ca 0.80
磷P 0.53
代谢能ME/(MJ/kg) 13.29

1)预混料为每千克开食料提供The premix provided the following per kg of the starter feed:VA 4 500 IU,VD 600 IU,VE 40 IU,Zn 80 mg,Mn 50 mg,Fe 50 mg,I 0.75 mg,Co 0.65 mg,Se 0.25 mg。

2)代谢能参照《中国饲料成分及营养价值表(2020年第31版)》进行计算,干物质(GB/T 6435—2014)、粗蛋白质(GB/T 3462—2018)、粗脂肪(GB/T 6433—2006)、粗纤维(GB/T 3434—2022)、钙(GB/T 6436—2018)、磷(GB/T 6437—2018)参照相应的国标方法进行测定。ME was calculated according to Tables of Feed Composition and Nutritive Values in China (thirty-first edition, 2020), while DM (GB/T 6435—2014), CP(GB/T 3462—2018), EE (GB/T 6433—2006), CF (GB/T 3434—2022), Ca (GB/T 6436—2018) and P (GB/T 6437—2018) were measured according to corresponding national standard methods.

1.3 大肠杆菌攻毒试验

大肠杆菌是引起幼畜腹泻的重要致病原微生物[23],为了研究乳酸菌胞外多糖在大肠杆菌污染环境下对羔羊瘤胃功能及瘤胃微生物多样性的影响,于灌服处理第43天和第44天,选择CON组、ASP组和EPS-H组试验羊进行大肠杆菌攻毒试验,攻毒处理选择经口腔下胃管直接灌胃的方式,大肠杆菌菌种为Escherichia coli (Migula) Castellani and Chalmers,ATCC 25922TM,攻毒剂量为109 CFU/只[24⇓⇓-27]。在灌服处理第49天,进行大肠杆菌攻毒的CON组、ASP组和EPS-H组这3个组,每组随机选取3只试验羊进行屠宰,采集瘤胃内容物及胃肠道组织样本,用于后续试验分析。

1.4 样本采集

1.4.1 血液样本采集及血清、血浆分离

分别于试验开始后第14天、第28天、第42天采集羔羊血液,采用颈静脉穿刺方式采血,并分别使用10 mL乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝采血管及非抗凝采血管收集血液,之后将非抗凝采血管斜置于4 ℃冰箱中静置30 min,待血液凝固后1 500×g离心15 min,收集血清移至1.5 mL离心管内-20 ℃保存,用于后续血清抗氧化指标分析;将抗凝采血管于采样2 h内4 ℃保存移至实验室,之后1 500×g离心10 min,收集血浆于1.5 mL冻存管中-20 ℃保存,用于血浆细胞因子和免疫球蛋白含量测定。

1.4.2 胃肠道内容物样本采集

试验羊屠宰后取出瘤胃,先测定瘤胃内容物pH,随后采用刮样板分别刮取瘤胃、十二指肠、空肠、回肠的内容物样本,收集入5 mL冻存管中后立即液氮保存,待后续微生物多样性分析。将其余瘤胃内容物使用4层纱布过滤收集过滤液,过滤液装入已加入25%偏磷酸的50 mL冻存管中,于液氮中保存,用于后续挥发性脂肪酸(VFA)浓度测定。

1.4.3 试验羔羊体重数据记录

分别在试验开始和试验结束当天(第49天)09:00对各组试验羔羊逐一进行体重称量并记录。

1.5 指标检测与方法

1.5.1 血清抗氧化指标测定

将冷冻保存的血清样本37 ℃水浴解冻后,使用江苏艾迪生生物科技有限公司生产的对应指标检测试剂盒进行丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性与总抗氧化能力(T-AOC)检测,检测严格按照相关试剂盒说明书操作。

1.5.2 血浆细胞因子和免疫球蛋白含量测定

将冷冻保存的血浆样本37 ℃水浴解冻后,使用江苏酶免实业有限公司生产的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒检测细胞因子[白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)、皮质醇(COR)、γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]和免疫球蛋白[免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白A(IgA)]含量,检测严格按照相关试剂盒说明书操作。

1.5.3 瘤胃内容物挥发性脂肪酸浓度测定

使用Thermo Trace 1310气相色谱仪,配备Agilient HP-INNOWAX毛细管柱,结合Thermo ISQ 7000质谱仪检测瘤胃内容物中乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸浓度,检测严格按照气相色谱-质谱联用系统操作说明书进行操作。

1.5.4 胃肠道内容物微生物宏基因组测序

胃肠道内容物干冰保存邮寄至江苏苏联科生物科技有限公司,委托其进行瘤胃、十二指肠、空肠和回肠内容物的微生物宏基因组测序,测序结果使用QIIME2软件及默认参数进行生物信息学分析。使用QIIME2软件调用“qiime taxa barplot”命令进行微生物组成分析,调用“qiime diversity alpha-rarefaction”命令并设置参数为“--p-steps 10,--p-min-depth 10,--p-iterations 10”进行α多样性分析,调用“qiime diversity core-metrics-phylogenetic”命令进行β多样性分析;使用R脚本,分别调用VennDiagram包、pheatmap包、Python LEfSe包以及metagenomeSeq包进行微生物差异分析与标志微生物筛选;使用PICRUSt2软件进行微生物潜在功能预测。

1.6 数据处理与分析

试验数据用Excel 2019软件进行初步整理计算,血液指标采用SPSS 23.0统计软件的mixed混合模型进行双因素方差分析,将处理和采血时间分别作为2个主效因素并且考虑双因素的交互作用对血液指标的影响,结果用平均值和均值标准误表示。瘤胃VFA浓度数据采用SPSS 23.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),并结合方差齐性检验及Duncan氏法进行多重比较,结果用平均值和均值标准误表示。P≤0.05为差异显著,P≤0.01为差异极显著,P>0.05为差异不显著。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌胞外多糖对羔羊血液指标的影响

由表3可知,所测血清抗氧化指标中,除EPS-H组血清GSH-Px活性较CON组和EPS-M组显著升高(P≤0.05)外,其余各抗氧化指标各组之间均无显著差异(P>0.05)。所测血浆细胞因子和免疫球蛋白中,除EPS-M组血浆TNF-α含量显著低于其他各组(P≤0.05)外,其余细胞因子及免疫球蛋白含量各组之间均无显著差异(P>0.05)。双因素方差分析显示,采血时间对各项血液指标均有极显著影响(P≤0.01),但处理以及处理和采血时间的交互作用对各项血液指标均无显著影响(P>0.05)。
表3 各组羔羊的血清抗氧化指标及血浆细胞因子和免疫球蛋白含量

Table 3 Serum antioxidant indexes and plasma cytokine and immunoglobulin contents of lambs in different groups

项目
Items		 组别Groups 均值
标准误
SEM		 P值P-value
CON ASP EPS-L EPS-M EPS-H 处理
Treatment		 采血时间
Time of
blood
sampling		 处理×
采血时间
Treatment×
time of blood
sampling
丙二醛
MDA/(nmol/mL)		 1.19 1.43 1.42 1.66 1.58 0.095 0.761 0.001 0.353
超氧化物歧化酶
SOD/(U/mL)		 71.87 69.23 72.50 69.95 72.74 0.534 0.072 <0.001 0.068
过氧化氢酶
CAT/(U/L)		 17.83 21.21 19.86 19.49 20.20 1.379 0.947 0.002 0.663
总抗氧化能力
T-AOC/(U/mL)		 25.57 26.76 23.95 26.01 25.36 0.735 0.848 <0.001 0.314
谷胱甘肽过氧化物酶
GSH-Px/(U/mL)		 0.07bc 0.09abc 0.10ab 0.07c 0.11a 0.004 0.042 <0.001 0.008
白细胞介素-1β
IL-1β/(pg/mL)		 54.98 54.75 56.36 55.95 55.09 0.326 0.206 <0.001 0.089
白细胞介素-4
IL-4/(pg/mL)		 39.46 39.00 39.08 38.06 39.06 0.165 0.774 <0.001 0.680
白细胞介素-6
IL-6/(pg/mL)		 150.91 150.19 150.45 148.34 151.18 0.357 0.974 <0.001 0.235
皮质醇
COR/(ng/mL)		 138.15 136.37 136.45 139.58 138.80 0.747 0.332 <0.001 0.677
γ-干扰素
IFN-γ/(pg/mL)		 635.07 625.18 630.71 615.05 627.57 1.797 0.697 <0.001 0.617
肿瘤坏死因子-α
TNF-α/(pg/mL)		 130.65b 131.60b 134.41a 127.80c 133.09ab 0.395 0.049 <0.001 0.536
免疫球蛋白G
IgG/(mg/mL)		 62.10 61.27 59.14 59.46 60.72 0.391 0.147 <0.001 0.858
免疫球蛋白M
IgM/(μg/mL)		 1 238.41 1 209.31 1 238.10 1 202.15 1 267.27 5.989 0.118 <0.001 0.062
免疫球蛋白A
IgA/(μg/mL)		 313.16 312.71 311.46 306.47 313.60 1.055 0.912 <0.001 0.907

同行数据肩标无字母或相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P≤0.05),不同大写字母表示差异极显著(P≤0.01)。下表同。

In the same row, vales with no letter or the same lowercase letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different lowercase letter superscripts mean significant difference (P≤0.05), and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P≤0.01). The same as below.

2.2 大肠杆菌攻毒处理下乳酸菌胞外多糖对羔羊瘤胃内容物pH和挥发性脂肪酸浓度的影响

由表4可知,在大肠杆菌攻毒处理下,CON组、ASP组和EPS-H组羔羊的瘤胃内容物pH以及除己酸外的各挥发性脂肪酸浓度的差异均不显著(P>0.05),但ASP组乙酸/丙酸比值显著高于CON组(P≤0.05),而EPS-H组乙酸/丙酸比值与CON组相比有提高的趋势(P=0.059)。
表4 各组羔羊瘤胃内容物pH和挥发性脂肪酸浓度

Table 4 pH and volatile fatty acid concentrations in rumen content of lambs in different groups

项目
Items		 组别Groups 均值标准误
SEM		 P值
P-value
CON ASP EPS-H
pH 5.85 5.80 6.15 0.324 0.222
乙酸Acetate/(mmol/L) 46.01 58.30 50.62 3.261 0.340
丙酸Propionate/(mmol/L) 12.04 10.03 10.22 0.492 0.188
异丁酸Isobutyrate/(mmol/L) 0.53 0.43 0.60 0.046 0.366
丁酸Butyrate/(mmol/L) 6.91 6.82 7.30 0.451 0.922
异戊酸Isovaleric/(mmol/L) 0.51 0.33 0.44 0.046 0.303
戊酸Valproic/(mmol/L) 0.39 0.39 0.33 0.032 0.734
己酸Hexanoic/(mmol/L) 0.02a 0.15b 0.04a 0.024 0.043
乙酸/丙酸Acetate/propionate 3.81b 5.81a 4.92ab 0.335 0.017
总挥发性脂肪酸TVFA/(mmol/L) 66.42 76.45 69.55 3.818 0.613

2.3 大肠杆菌攻毒处理下乳酸菌胞外多糖对羔羊胃肠道微生物多样性的影响

2.3.1 下机原始数据质控及统计

瘤胃、十二指肠、空肠和回肠内容物样本DNA质量及文库构建符合上机测序要求,下机数据进行质控、去噪、拼接和去嵌合体等步骤后获得平均有效序列数量为76 976条,各样本的有效序列长度分布统计如图1所示。
图1 有效序列长度分布图

A为瘤胃样本,B为十二指肠样本,C为空肠样本,D为回肠样本。

Fig.1 Effective sequence length distribution diagram

A is rumen sample, B is duodenum sample, C is jejunum sample, and D is ileum sample.

由下机原始数据统计和质控结果可知,各样本微生物测序数据质量满足后续微生物多样性组成谱的生物信息学分析。

2.3.2 各样本微生物α多样性分析

α多样性可反映局部均匀生境下的微生物丰富度、多样性和均匀度等,微生物α多样性分析以Chao1和Observed_species指数表征丰富度,以Shannon和Simpson指数表征多样性,Faith_pd指数表征基于进化的多样性,以Pielou_e指数表征均匀度,以Goods_coverage指数表征覆盖度。各组瘤胃样本的微生物α多样性分析结果见图2,各组十二指肠样本的微生物α多样性分析结果见图3,各组空肠样本的微生物α多样性分析结果见图4,各组回肠样本的微生物α多样性分析结果见图5。由各组织样本的微生物α多样性指数箱线图可知,EPS-H组的十二指肠、空肠和回肠内容物的微生物α多样性中丰富度指数、多样性指数和均匀度指数均高于CON组和ASP组,而瘤胃内容物的微生物α多样性中以上指数为ASP组高于EPS-H组和CON组,但差异均不显著(P>0.05)。
图2 各组瘤胃样本的微生物α多样性指数箱线图

RC为CON组瘤胃样本,RP为ASP组瘤胃样本,RT为EPS-H组瘤胃样本。

Fig.2 Box plots of microbial α diversity indexes for rumen samples from different groups

RC is the rumen sample of CON group, RP is the rumen sample of ASP group, and RT is the rumen sample of ESP-H group.

图3 各组十二指肠样本的微生物α多样性指数箱线图

DC为CON组十二指肠样本,DP为ASP组十二指肠样本,DT为EPS-H组十二指肠样本。

Fig.3 Box plots of microbial α diversity indexes for duodenum samples from different groups

DC is the duodenum sample of CON group, DP is the duodenum sample of ASP group, and DT is the duodenum sample of ESP-H group.

图4 各组空肠样本的微生物α多样性指数箱线图

JC为CON组空肠样本,JP为ASP组空肠样本,JT为EPS-H组空肠样本。

Fig.4 Box plots of microbial α diversity indexes for jejunum samples from different groups

JC is the jejunum sample of CON group, JP is the jejunum sample of ASP group, and JT is the jejunum sample of ESP-H group.

图5 各组回肠样本的微生物α多样性指数箱线图

IC为CON组回肠样本,IP为ASP组回肠样本,IT为EPS-H组回肠样本。

Fig.5 Box plots of microbial α diversity indexes for ileum samples from different groups

IC is the ileum sample of CON group, IP is the ileum sample of ASP group, and IT is the ileum sample of ESP-H group.

2.3.3 各样本微生物差异分析与标志微生物筛选

为研究不同组间微生物的差异性和挖掘不同组间的标志微生物,对各样本微生物物种差异进行分析,采用韦恩图进行各样本微生物有效序列数量统计分析,筛选确定不同组微生物的占比及标志微生物,各组样本微生物有效序列数量维恩图如图6所示。随后对各样本韦恩图中各组内及组间交叉区域的微生物有效序列数量进行属水平上的柱状图分析,如图7所示。由于本试验只研究各样本不同组间微生物的差异性及筛选不同组间的标志微生物,所以只分析各样本不同组的微生物数据,各组间交叉重叠区域的微生物数据不做讨论。
图6 各样本微生物有效序列数量韦恩图

A为各组瘤胃样本韦恩图,图中RC为CON组,RP为ASP组,RT为EPS-H组。B为各组十二指肠样本韦恩图,图中DC为CON组,DP为ASP组,DT为EPS-H组。C为各组空肠样本韦恩图,图中JC为CON组,JP为ASP组,JT为EPS-H组。D为各组回肠样本韦恩图,图中IC为CON组,IP为ASP组,IT为EPS-H组。

Fig.6 Venn diagrams of effective sequence quantity for microbes of each sample

A is the Venn diagram of rumen samples from different groups, in the figure, RC is CON group, RP is ASP group, and RT is ESP-H group. B is the Venn diagram of duodenum samples, in the figure, DC is CON group, DP is ASP group, and DT is ESP-H group. C is the Venn diagram of jejunum samples, in the figure, JC is CON group, JP is ASP group, and JT is ESP-H group. D is the Venn diagram of ileum samples, in the figure, IC is CON group, IP is ASP group, and IT is ESP-H group.

图7 各样本微生物属水平有效序列数量柱状图

A、B、C、D分别为瘤胃、十二指肠、空肠、回肠样本微生物属水平有效序列数量统计。图中横坐标为对应韦恩图中不同区域的有效序列集合,纵坐标为属于不同属的微生物有效序列数量的百分比。横坐标中RC、DC、JC和IC表示CON组独有的,RP、DP、JP和IP表示ASP组独有的,RT、DT、JT和IT表示EPS-H组独有,RT-RP、DT-DP、JT-JP和IT-IP表示EPS-H组与ASP组共有的,RT-RC、DT-DC、JT-JC和IT-IC表示EPS-H组与CON组共有的,RP-RC、DP-DC、JP-JC和IP-IC表示ASP组与CON组共有的,RT-RP-RC、DT-DP-DC、JT-JP-JC和IT-IP-IC为EPS-H组、ASP组和CON组3组共有的。不同分类单元以不同颜色标识。

Fig.7 Bar charts of effective sequence quantity of microbes at genus level in each sample

A, B, C and D are effective sequence quantity statistics of microbes at genus level in rumen, duodenum, jejunum and ileum samples, respectively. In figures, the horizontal axis represents the effective sequence sets corresponding to different regions of the Venn diagram, and the vertical axis represents the percentage of effective sequence quantity belonging to different genera. In the horizontal axis, RC, DC, JC and IC represent unique to the CON group; RP, DP, JP and IP represent those unique to the ASP group; RT, DT, JT and IT represent those unique to the EPS-H group; RT-RP, DT-DP, JT-JP and IT-IP represent those shared by the EPS-H group and the ASP group; RT-RC, DT-DC, JT-JC and IT-IC represent those shared by the EPS-H group and the CON group; RP-RC, DP-DC, JP-JC and IP-IC represent those shared by the ASP group and the CON group; RT-RP-RC, DT-DP-DC, JT-JP-JC and IT-IP-IC represent those shared by the EPS-H group, the ASP group and the CON group. Different classification units are marked with different colors.

由图6可知,EPS-H组的十二指肠和回肠样本微生物有效序列数量均高于ASP组和CON组。其中,EPS-H组的十二指肠样本独有有效序列数量为1 063个,占比为41.87%,EPS-H组的回肠样本独有有效序列数量为2 115个,占比高达56.76%。而各组瘤胃样本微生物有效序列数量相当,3组则各占1/3。空肠样本微生物有效序列数量ASP组、EPS-H组和CON组则分别为1 491、1 102和709个,占比分别为38.69%、28.59%和18.40%。
由图7可知,EPS-H组羔羊瘤胃微生物在属水平上的优势微生物为普雷沃氏菌属(Prevotella)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)和解琥珀酸菌属(Succiniclasticum),ASP组瘤胃微生物在属水平上的优势微生物为Prevotella、Ruminococcus和密螺旋体菌属(Treponema),CON组瘤胃微生物在属水平上的优势微生物为Prevotella、Ruminococcus和RFN20;EPS-H组和ASP组十二指肠微生物在属水平上的优势微生物均为Ruminococcus、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)和阿德勒菌属(Adlercreutzia),CON组十二指肠微生物在属水平上的优势微生物为Ruminococcus、梭菌属(Clostridium)和Succiniclasticum;EPS-H组空肠微生物在属水平上的优势微生物为Ruminococcus、Butyrivibrio和Adlercreutzia,ASP组空肠微生物在属水平上的优势微生物为Ruminococcus、Clostridium和颤螺菌属(Oscillospira),CON组空肠在属水平上的优势微生物为Ruminococcus、粪球菌属(Coprococcus)和芽孢杆菌属(Bacillus);EPS-H组回肠微生物在属水平上的优势微生物为Ruminococcus、Oscillospira和Clostridium,ASP组回肠微生物在属水平上的优势微生物为Ruminococcus、Butyrivibrio和Bacillus,CON组回肠微生物在属水平上的优势微生物为Ruminococcus、Coprococcus和Bacillus。
为了进一步比较各组样本间的微生物物种组成差异,使用热图对各组样本的微生物物种丰度分布趋势进行分析,对各组样本平均丰度前50的属的丰度数据进行热图绘制,如图8至图11所示。
图8 瘤胃样本微生物属水平物种组成热图

热图中红色越深表示丰度越高,蓝色越深表示丰度越低。图9、图10和图11同。

Fig.8 Heat maps of species composition of microbes at genus level in rumen sample

In the heat map, the deeper the red, the higher the abundance, and the deeper the blue, the lower the abundance. The same as Fig.9, Fig.10 and Fig.11.

图9 十二指肠样本微生物属水平物种组成热图

Fig.9 Heat maps of species composition of microbes at genus level in duodenum sample

图10 空肠样本微生物属水平物种组成热图

Fig.10 Heat maps of species composition of microbes at genus level in jejunum sample

图11 回肠样本微生物属水平物种组成热图

Fig.11 Heat maps of species composition of microbes at genus level in jejunum sample

由图8至图11可知,瘤胃、十二指肠、空肠和回肠各样本微生物属水平物种在CON组、ASP组和EPS-H组呈现不同的微生物物种表达丰度聚类现象,说明在大肠杆菌攻毒条件下,不同处理使得样本微生物丰度发生差异性变化。
为了阐述在大肠杆菌攻毒条件下乳酸菌胞外多糖对羔羊消化系统微生物表达丰度的影响,采用LEfSe差异分析方法[28]筛选各组瘤胃、十二指肠、空肠和回肠样本中的丰度差异标志微生物,根据标志微生物表达丰度的高低获得EPS-H组较ASP组和CON组的差异标志微生物LDA得分,结果如图12所示。
图12 各样本不同组标志微生物的LDA得分柱状图

A为瘤胃样本,B为十二指肠样本,C为空肠样本,D为回肠样本。

Fig.12 Bar charts of LDA scores for microbial markers in different groups of each sample

A is rumen sample, B is duodenum sampls, C is jejunum sample, and D is ileum sample.

由图12可知,相较于CON组和ASP组,EPS-H组瘤胃样本中表达丰度高的标志微生物是支原体科(Mycoplasmataceae)、支原体目(Mycoplasmatales)和Coprococcus,十二指肠样本中表达丰度高的标志微生物是厌氧棒杆菌属(Anaerostipes)和草酸杆菌科(Oxalobacteraceae),空肠样本中表达丰度高的标志微生物是真杆菌科(Eubacteriaceae)、丹毒丝菌目(Erysipelotrichales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、放线菌目(Actinomycetales)、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)、放线菌科(Actinomycetaceae)、丹毒丝菌纲(Erysipelotrichi)、链霉菌属(Streptomyces)、厌氧棒形菌属(Anaerofustis)和链霉菌科(Streptomycetaceae),回肠样本中表达丰度高的标志微生物是Clostridium、多雷菌属(Dorea)和消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)。

2.3.4 标志微生物代谢通路预测

使用PICRUSt2软件对筛选的各样本微生物进行代谢通路的功能预测[29],获得各样本微生物代谢通路的丰度数据,使用metagenomeSeq方法筛选EPS-H组相较CON组各组织样本中表现为上调且差异显著的代谢通路,旨在阐明在大肠杆菌攻毒条件下,EPS-H组各消化系统样本表达丰度高的标志微生物的潜在生物功能,结果见图13至图16。
图13 瘤胃样本中EPS-H组和CON组之间差异KEGG代谢通路图

横坐标log2(差异倍数)正值代表EPS-H组相对CON组上调,负值为下调,纵坐标为不同的KEGG代谢通路标签。以不同颜色展示显著性程度。图14、图15和图16同。

Fig.13 KEGG metabolic pathway diagram of differences between EPS-H group and CON group in rumen sample

The positive value of log(FC) on the horizontal axis represents the up-regulation of EPS-H group compared with CON group, while the negative value represents the down-regulation. The vertical axis represents different KEGG metabolic pathway labels. Display the degree of significance in different colors. The same as Fig.14, Fig.15 and Fig.16.

图14 十二指肠样本中EPS-H组和CON组之间差异KEGG代谢通路图

Fig.14 KEGG metabolic pathway diagram of differences between EPS-H group and CON group in duodenum sample

图15 空肠样本中EPS-H组和CON组之间差异KEGG代谢通路图

Fig.15 KEGG metabolic pathway diagram of differences between EPS-H group and CON group in jejunum sample

图16 回肠样本中EPS-H组和CON组之间差异KEGG代谢通路图

Fig.16 KEGG metabolic pathway diagram of differences between EPS-H group and CON group in ileum sample

由图13可知,通过差异筛选获得瘤胃样本中EPS-H组较CON组显著上调的差异微生物潜在代谢通路为氰基氨基酸代谢(cyanoamino acid metabolism)。
由图14可知,通过差异筛选获得十二指肠样本中EPS-H组较CON组显著上调的差异微生物的代谢通路为甲苯降解(toluene degradation)和药物代谢-其他酶(drug metabolism-other enzymes)。
由图15可知,通过差异筛选获得空肠样本中EPS-H组较CON组显著上调的差异微生物的潜在代谢通路为新生霉素生物合成(novobiocin biosynthesis)、过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路(PPAR signaling pathway)和多环芳烃降解(polycyclic aromatic hydrocarbon degradation)。
由图16可知,通过差异筛选获得回肠样本中EPS-H组较CON组显著上调的差异微生物的潜在代谢通路为酵母减数分裂(meiosis yeast)、肾素血管紧张素系统(renin-angiotensin system)、多环芳烃降解和光合作用-天线蛋白(photosynthesis-antenna proteins)。

2.4 各组羔羊体重数据

由表5可知,试验结束时EPS-H组和EPS-M组羔羊体重均值分别为20.44和19.42 kg,均显著高于CON组羔羊的15.12 kg(P≤0.05)。
表5 各组羔羊体重数据

Table 5 Body weight data of lambs in different groups kg

项目
Items		 组别Groups 均值标准误
SEM		 P值
P-value
CON ASP EPS-L EPS-M EPS-H
初始体重IBW 6.09 6.88 6.98 7.94 7.46 0.311 0.430
终末体重FBW 15.12c 17.41bc 16.46c 19.42ab 20.44a 0.487 <0.001

3 讨论

3.1 乳酸菌胞外多糖对羔羊血液指标的影响

3.1.1 乳酸菌胞外多糖对羔羊血清抗氧化指标的影响

动物机体时刻处在动平衡状态,其中氧化和抗氧化之间的平衡是维持机体内环境动平衡的一个重要机制,如果机体接受或者产生超过其抗氧化能力的过量活性氧,则会导致机体出现氧化应激现象,造成机体损伤[30],而机体的抗氧化系统则会通过破坏分解代谢自由基并阻止其产生和对机体造成过氧化损伤[31]。血清抗氧化指标如MDA[32]、SOD[33]、CAT[34]、T-AOC[35]、GSH-Px[36]等可以反映机体氧化和抗氧化之间的平衡程度,其中SOD、CAT和GSH-Px可以有效消除氧自由基对机体蛋白质和核酸等细胞生物大分子造成的伤害,而MDA是机体脂质过氧化的产物,血清MDA含量可以直接反映机体受到氧化应激的损伤程度[37],T-AOC则是机体所有抗氧化酶和非酶抗氧化物质总的抗氧化能力。
本试验分别在灌服处理的第14天、第28天和第42天对试验羔羊进行采血检测血清抗氧化指标及血浆细胞因子和免疫球蛋白含量的变化,对试验羔羊血液指标以处理和采血时间作为2个主效因素进行双因素方差分析,并考虑处理和采血时间的交互作用对血液指标的影响。由血清抗氧化指标结果可知,羔羊血清抗氧化指标中GSH-Px活性在组间呈现出显著性变化,EPS-H组较CON组显著升高,血清MDA含量和T-AOC各组间无显著差异,而SOD和CAT活性则表现为EPS-H组较CON组呈现上升趋势,但差异不显著;双因素方差分析结果显示,处理和采血时间的交互作用对血清抗氧化指标的影响均不显著。梅秀明等[38]研究表明,乳酸菌胞外多糖可以提高小鼠体内的SOD和CAT活性,从而增强其抗氧化性,并且减少MDA对小鼠造成的损伤。此外,另有研究表明乳酸菌胞外多糖具有较强的体外抗氧化性[39-40]。通过以上不同时间点血清抗氧化指标的变化结果可得,灌服乳酸菌胞外多糖可以一定程度上提高羔羊血液中的抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶的活性,从而提高羔羊的抗氧化能力。

3.1.2 乳酸菌胞外多糖对羔羊血浆细胞因子和免疫球蛋白含量的影响

血液是动物机体的枢纽,承担着机体间各组织器官不间断进行物质交换的重要工作,是机体的物质运输通路,血液指标可直接反映各组织器官的运行状态,是机体生理机能的展示窗口。血液中的炎性因子及免疫指标可以在一定程度上反映机体的生理状态,白细胞介素和肿瘤坏死因子是重要的炎性细胞因子,炎性因子与机体免疫应答存在着复杂的交联关系,炎性因子可以促进免疫应答发生。由血浆细胞因子和免疫球蛋白含量的检测结果可知,EPS-M组羔羊血浆细胞因子中TNF-α的含量显著低于CON组和ASP组,此结果可以佐证乳酸菌胞外多糖具有抗肿瘤活性,可以通过调动免疫系统,激发免疫细胞对抗肿瘤发生[41];血浆IL-1β含量呈现灌服乳酸菌胞外多糖组较CON组及ASP组有升高趋势,但差异不显著;血浆IgM含量则呈现EPS-H组较CON组及ASP组有升高趋势,血清免疫球蛋白含量升高,是机体进行免疫的生理过程,说明乳酸菌胞外多糖可以起到类似免疫疫苗的作用,提高机体的免疫能力。此结果与牟光庆等[42]的研究结果相似,后者研究表明乳酸菌胞外多糖具有提高小鼠免疫应答的能力。双因素方差分析结果显示处理和采血时间的交互作用对血浆中细胞因子及免疫球蛋白含量的影响均不显著。
由各组血液指标可知,给羔羊灌服乳酸菌胞外多糖可以在一定程度上提高羔羊血液中的抗性细胞因子和免疫球蛋白含量,从而提高羔羊的抗逆性和免疫能力。并且,通过灌服乳酸菌胞外多糖对羔羊血清抗氧化指标及血浆细胞因子和免疫球蛋白含量的影响结果可知,在羔羊阶段,灌服适当剂量的乳酸菌胞外多糖对羔羊无生理毒性,且可以一定程度提高羔羊的抗氧化能力和免疫能力。血液指标结合羔羊体重变化可知,灌服乳酸菌胞外多糖羔羊可以提高羔羊抗病性,并可缓解大肠杆菌对羔羊生长性能的影响。

3.2 在大肠杆菌攻毒处理下乳酸菌胞外多糖对羔羊瘤胃内容物挥发性脂肪酸浓度的影响

瘤胃微生物的种类、活性和比例组成构成瘤胃微生物生态系统,健康瘤胃微生物生态系统产生的挥发性脂肪酸是反刍动物重要的能量来源,所以反刍动物对营养物质的消化吸收与其瘤胃微生物生态系统有着紧密的联系,瘤胃微生物代谢产生的挥发性脂肪酸,可以在一定程度上反映瘤胃微生物生态系统的状态[43]。幼龄反刍动物瘤胃微生物生态系统尚未建立完全,瘤胃微生物生态群落尚未稳定,易于受到大肠杆菌等病原微生物侵扰,从而对反刍动物健康造成一定影响。大肠杆菌性腹泻常常造成幼畜急性脱水性死亡,给畜牧业生产经营者造成一定的损失。大肠杆菌性腹泻多由幼畜舔舐污染物而感染,因此本试验进行大肠杆菌攻毒来模拟幼畜在大肠杆菌污染环境下,研究乳酸菌胞外多糖在大肠杆菌侵扰下对羔羊瘤胃内容物挥发性脂肪酸浓度的影响,结果显示,在大肠杆菌攻毒状态下,3组羔羊的瘤胃内容物pH无显著差异,乙酸、丙酸、丁酸等各挥发性脂肪酸以及总挥发性脂肪酸浓度无显著差异,但相较CON组,EPS-H组和ASP组乙酸浓度升高,丙酸浓度降低;瘤胃乙酸/丙酸比值则表现为ASP组显著高于CON组,而EPS-H组与CON组相比有提高的趋势。上述试验结果说明大肠杆菌攻毒会降低羔羊瘤胃发酵参数中的乙酸/丙酸比值,而乳酸菌胞外多糖可以缓解在大肠杆菌攻毒导致的乙酸/丙酸比值的降低趋势,但效果不如黄芪多糖。研究表明,乙酸是葡萄糖供能的主要关联物质,而丙酸是肝脏糖异生的关联物质,提高瘤胃乙酸/丙酸比值相当于提高饲料转化效率,在减少能量损失同时减少温室气体的排出[44⇓-46]。因此,通过乳酸菌胞外多糖对大肠杆菌攻毒羔羊的瘤胃内容物挥发性脂肪酸浓度变化的影响结果可知,乳酸菌胞外多糖和黄芪多糖可以缓解由大肠杆菌引起的羔羊瘤胃乙酸/丙酸比值的降低,减少大肠杆菌对羔羊瘤胃微生态系统健康的影响,并且可一定程度上提高瘤胃微生物产生乙酸的量,促进瘤胃对营养物质的消化吸收,有助于提高羔羊抵抗大肠杆菌污染的能力。

3.3 在大肠杆菌攻毒处理下乳酸菌胞外多糖对羔羊胃肠道微生物的影响

3.3.1 在大肠杆菌攻毒处理下各组羔羊胃肠道微生物多样性差异

本研究发现,大肠杆菌可以改变羔羊瘤胃发酵参数及发酵类型,并且乳酸菌胞外多糖可以缓解大肠杆菌处理下瘤胃发酵参数的变化,由此判断大肠杆菌会影响反刍动物消化吸收系统内微生物多样性的变化。微生物在反刍动物消化系统中起到至关重要的作用,反刍动物消化系统微生物种类复杂、数量庞大,常处在动态平衡状态[47]。反刍动物对营养物质进行消化吸收的主要器官为瘤胃和肠道,因此本试验分析了大肠杆菌处理条件下CON组、ASP组和EPS-H组羔羊瘤胃、十二指肠、空肠和回肠的微生物多样性。微生物多样性分析沿用生态学家使用的α多样性表征物种生境内的多样性,以综合评价微生物总体多样性[48-49]。针对α多样性分析以Chao1和Observed_species指数表征丰富度[50],以Shannon和Simpson指数表征多样性[51-52],以Faith_pd指数表征基于进化的多样性[53],以Pielou_e指数表征均匀度[54],以Goods_coverage指数表征覆盖度[55]。由各组羔羊胃肠道微生物α多样性分析结果可知,在大肠杆菌处理下,CON组及ASP组瘤胃、十二指肠、空肠和回肠微生物的α多样性中的丰富度指数、多样性指数和均匀度指数均低于EPS-H组,但差异不显著。由此可知,大肠杆菌处理具有降低羔羊消化系统微生物多样性的趋势,而乳酸菌胞外多糖可以减缓由大肠杆菌造成的瘤胃微生物多样性的下降。研究表明,肠道微生物多样性与动物健康呈正相关[56],所以乳酸菌胞外多糖的添加可以改善羔羊胃肠道微生物多样性,缓解由大肠杆菌引起的微生物多样性的下降,进而积极影响羔羊生理健康。

3.3.2 在大肠杆菌攻毒处理下各组羔羊胃肠道微生物差异分析与标志微生物筛选

由CON组、ASP组和EPS-H组羔羊各样本微生物的群落统计分析结果可知,3组瘤胃样本微生物统计数量各占1/3,十二指肠和回肠样本微生物统计数量EPS-H组均高于ASP组和CON组,空肠样本微生物统计数量ASP组高于EPS-H组和CON组。由此可知,大肠杆菌处理在一定程度上降低了羔羊消化系统中某些微生物的数量和表达丰度,破坏了瘤胃微生物正常环境,对瘤胃后消化系统中微生物的数量及丰度均造成一定程度的影响,但是乳酸菌胞外多糖可以缓解大肠杆菌对羔羊消化系统微生物群落造成的负面影响,并且效果要优于黄芪多糖。
对各样本微生物数量百分比分析可知,EPS-H组较CON组消化系统各样本属水平优势微生物中数量百分比上升的微生物有Succiniclasticum、Butyrivibrio、Adlercreutzia、Oscillospira,数量百分比下降的微生物有Treponema、Clostridium、Coprococcus、Bacillus。由各样本微生物属水平表达丰度分布趋势结果可知,各样本属水平微生物物种在CON组、ASP组和EPS-H组呈现不同的微生物物种表达丰度聚类现象,说明在大肠杆菌处理条件下,灌服乳酸菌胞外多糖使得羔羊消化系统各样本微生物较CON组和ASP组发生表达丰度性差异变化。由各样本微生物LEfSe分析结果可知,EPS-H组消化系统各样本表达丰度高的标志微生物是Mycoplasmataceae、Coprococcus、Anaerostipes、Oxalobacteraceae、Eubacteriaceae、Rhizobiales、Erysipelotrichaceae、Actinomycetaceae、Streptomyces、Anaerofustis、Clostridium、Dorea和Peptostreptococcaceae。
Elolimy等[57]和Mu等[58]均研究证实,Succiniclasticum参与瘤胃能量代谢和发酵过程,具有分解淀粉的能力,可提高瘤胃消化率[59],并且影响瘤胃pH,改善营养物质吸收和能量代谢[60-61]。另有研究表明,Butyrivibrio是一类居于瘤胃利用纤维等糖类发酵产生丁酸的厌氧型革兰氏阴性菌,是一种提高瘤胃功能的有益菌[62],其产生的丁酸可以促进羔羊瘤胃乳头发育[63],同时,Oscillospira也可以产生促进瘤胃乳头发育的丁酸盐[64]。Adlercreutzia是一类可产生雌马酚且具有抗炎作用的革兰氏阳性菌[65]。关于Coprococcus的研究表明,相较于单纯消化不良的奶牛而言,健康奶牛瘤胃中Coprococcus的含量较丰富[66],且Coprococcus是一类有益微生物,可以加强宿主微生物平衡,提高抵抗力,且可产生抗菌复合物[67]。因此,由各样本微生物差异分析及标志微生物筛选结果可知,在大肠杆菌处理条件下,相较于CON组,灌服乳酸菌胞外多糖可以提高羔羊瘤胃有益菌的数量百分比,且EPS-H组样本中表达丰度较高的微生物均与瘤胃消化功能呈正相关关系,所以在大肠杆菌处理条件下,乳酸菌胞外多糖具有缓解大肠杆菌引起的瘤胃微生物群落数量及丰度降低。换言之,乳酸菌胞外多糖可以促进瘤胃微生物发育及提高瘤胃消化能力,从而增强幼畜的抗应激能力。
为了阐明在乳酸菌胞外多糖作用下消化系统中上调微生物的具体代谢功能,对EPS-H组较CON组表达丰度显著上调的差异微生物进行功能预测,获得瘤胃中EPS-H组较CON组显著上调的差异微生物潜在代谢通路为氰基氨基酸代谢,十二指肠中EPS-H组较CON组显著上调的差异微生物的潜在代谢通路为甲苯降解和药物代谢及相关酶,空肠中EPS-H组较CON组显著上调的差异微生物的潜在代谢通路为新生物素合成、过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路和多环芳香烃降解,回肠中EPS-H组较CON组显著上调的差异微生物的潜在代谢通路为酵母减数分裂、肾素血管紧张素系统和多环芳香烃降解。
氰基氨基酸代谢功能与甘氨酸和丙氨酸的代谢相关[68],甲苯降解与药物代谢功能与瘤胃蛋白质代谢和尿酸等次级营养素代谢相关[69],新生物素合成与能量代谢相关[70],而过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路和多环芳香烃降解则是参与代谢的主要信号通路[71],肾素血管紧张素系统也与营养代谢相关[72],因此,由EPS-H组较CON组显著上调的差异代谢功能结果可知,在大肠杆菌处理条件下,EPS-H组表达丰度上调的胃肠道微生物均与营养代谢相关,因此乳酸菌胞外多糖可以促进胃肠道微生物发挥其正常代谢功能,促进微生物发酵及营养物质的代谢,从而提高羔羊在大肠杆菌处理条件下的抗病和抗应激能力。

4 结论

灌服乳酸菌胞外多糖可以显著提高羔羊血清中GSH-Px的活性,显著降低血浆中TNF-α的含量,从而一定程度上增强羔羊的抗氧化能力及免疫能力,提高羔羊的抗病性。在引起羔羊腹泻的大肠杆菌处理下,给羔羊灌服乳酸菌胞外多糖可以缓解大肠杆菌引起的瘤胃微生物多样性的下降及瘤胃乙酸/丙酸比值的降低趋势,一定程度上提高瘤胃微生物产生乙酸的量,并且可以提高瘤胃有益菌的数量百分比占比及表达丰度,具有促进瘤胃微生物发育及提高瘤胃消化能力的作用。综上所述,乳酸菌胞外多糖可以提高羔羊的抗病性,减少大肠杆菌对羔羊胃肠道微生物稳态的影响,促进胃肠道对营养物质的消化吸收,是一种潜在的具有提高羔羊抗病性、促进胃肠道微生物发育以提高营养物质吸收作用的绿色微生态添加剂。

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