Chinese Journal of Animal Nutrition >

2025 , Vol. 37 >Issue 4: 2750 - 2762

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.230

RESEARCH PAPER

Isolation, Identification and Biological Characteristics of Probiotic Lactic Acid Bacteria Derived from Porcine

  • WU Xiaoting ,
  • WANG Zhaolu ,
  • ZHU Lili ,
  • ZHAO Lili ,
  • JIN Jianjun ,
  • SHI Xin’e , *
Expand
  • College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China
* professor, E-mail:

Received date: 2024-10-01

  Online published: 2025-04-15

Fold

Abstract

The purpose of this experiment was to isolate and screen lactic acid bacteria with good acid production and probiotic properties from the feces of healthy weaned piglets, so as to lay a foundation for their future application as feed additives. In this study, lactic acid bacteria were isolated and purified using CaCO3-MRS solid medium. Ten strains of lactic acid bacteria were initially selected based on their capacity for acid production, followed by species identification through molecular biological identification. Their growth characteristics, tolerance, adhesion ability, antibiotic susceptibility and antimicrobial activity were subsequently evaluated alongside an assessment of their in vivo safety. The results showed that all ten strains of lactic acid bacteria (L2, L3, L4, L5, L7, L11, L13, L21, L22 and L24) with strong acid-producing ability were identified as Lactobacillus salivarius by 16S rRNA sequencing. In terms of growth characteristics, these strains exhibited similar patterns with a logarithmic phase occurring between 2 hours to 12 hours post-inoculation. Regarding acidity tolerance, L4 and L22 demonstrated higher acidity tolerance with survival rate of 36.24% and 36.20%, respectively, after being cultured in an acidic environment (pH 3.0) for three hours; meanwhile, L5 achieved the highest survival rate at 41.14% when exposed to a choline salt concentration of 0.3% for three hours. Adhesion ability revealed that all ten strains of lactic acid bacteria had surface hydrophobic rate exceeding 70%, with L5 exhibiting the highest rate at 87.76%, while L7 showed the lowest rate at 70.87%. Among these strains, L24 displayed the most robust auto-aggregation ability with an auto-aggregation rate of 28.27%. Antibiotic susceptibility test revealed that all ten strains of lactic acid bacteria were sensitive to amoxicillin, clavulanic acid, florfenicol, doxycycline, cefadroxil, cefuroxime and oxifloxacin, but exhibited resistance against benzathine penicillin and gentamicin. Additionally, the antimicrobial test confirmed that all ten strains of lactic acid bacteria effectively inhibited the growth of common intestinal pathogens. In addition, strains L3 and L5 were selected for the in vivo safety test in mice, the results showed that lactic acid bacteria (L3, L5 and L3+L5) had no negative effects on body weight and feed intake of mice, and there were no pathological changes in organs of mice after postmortem. In conclusion, the 10 strains of Lactobacillus salivary selected in this study from the feces of healthy weaned piglets have good probiotic properties, especially Lactobacillus salivary L3 and L5, which can be used as candidate strains of feed additives.

Key words： lactic acid bacteria; isolation; identification; biological characteristics; security

Cite this article

WU Xiaoting , WANG Zhaolu , ZHU Lili , ZHAO Lili , JIN Jianjun , SHI Xin’e . Isolation, Identification and Biological Characteristics of Probiotic Lactic Acid Bacteria Derived from Porcine[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2025 , 37(4) : 2750 -2762 . DOI: 10.12418/CJAN2025.230

在畜牧生产中,抗生素又被称为生长促进剂,常用于促进动物生长及疾病预防,而抗生素滥用导致的动物相关产品中药物残留问题、食品安全性问题和耐药问题已严重影响到畜牧业的健康发展[1]。为有效阻断抗生素滥用,我国于2020年7月起颁布“禁抗令”,禁止在饲料中添加抗生素,禁抗令的出台在一定时间内对我国养殖业造成了一定的影响,寻找无毒副作用且无残留的抗生素替代品势在必行。
益生菌已广泛用于生猪生产,联合国粮食及农业组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)将益生菌定义为:“当摄取充足数量时,对宿主健康能发挥有益作用的活的微生物”。通常而言,益生菌主要有4种作用模式:竞争排斥病原微生物、增强免疫相关基因表达、改善消化和吸收功能以及减少有毒化合物[2⇓-4]。益生菌的主要种类有乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌等[5]。乳酸菌通过分解碳水化合物产生乳酸,降低pH,具有促进宿主健康和免疫调节特性,是目前益生菌中应用最广泛的微生物[6]。研究表明,从动物肠道中筛选鉴定出的乳酸菌多具有耐受性和益生性[7]。基于此,本研究以健康仔猪粪便中的乳酸菌为研究对象,先分离、筛选和鉴定,再评价其生物学特性和安全性,以获得具有良好耐受性和安全性的菌株,为进一步应用于饲料添加剂等动物产品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要试剂

MRS琼脂(HB0384)、MRS肉汤(HB0384-1)和乳酸菌成套生化鉴定管均购自青岛海博生物技术有限公司;革兰氏染色试剂盒(G1060)、猪胆盐(G8310)和无菌脱纤维绵羊血(TX0030)购自北京索莱宝科技有限公司;乳酸测定试剂盒(A019-2-1)购自南京建成生物工程研究所;细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302-02)购自北京天根生化科技有限公司;药敏片购自杭州微生物试剂有限公司。

1.1.2 样品来源

从西北农林科技大学畜禽生态养殖场采集健康仔猪新鲜粪便样品,置于10 mL无菌离心管中,低温条件下快速运回实验室。

1.1.3 菌株和试验动物

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和大肠杆菌(Escherichia coli)由西北农林科技大学动物医学院生物毒素实验室提供。28只4周龄C57BL/6J雄性小鼠,体重(20±2)g,购自重庆腾鑫生物技术有限公司,用于体内安全性试验。

1.2 试验方法

1.2.1 乳酸菌的筛选与鉴定

取1 g粪便样品溶解于9 mL的无菌生理盐水中,充分振荡混匀后,吸取100 μL进行梯度稀释,分别取100 μL稀释至10-5、10-6和10-7的稀释液均匀涂布于含碳酸钙(CaCO3)的MRS固体培养基上,倒置于37 ℃培养箱中过夜培养,挑取形态不同且有溶钙圈的单菌落,纯化后保存备用[8]。将纯化后的菌液涂布于MRS固体培养基上,观察菌体形态,并进行革兰氏染色和生理生化鉴定[9]。然后将菌液接入MRS肉汤培养基,在37 ℃恒温摇床中培养24 h后,测定pH和乳酸含量。最后通过PCR方法对分离出的菌株进行分子生物学鉴定。首先用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离乳酸菌的DNA,用细菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行16S rDNA扩增,引物由擎科生物科技有限公司合成。扩增完毕后,用1%的琼脂凝胶电泳检测,并将PCR产物送往擎科生物科技有限公司进行测序,将测序结果在NCBI数据库比对,确定细菌分类。

1.2.2 生长曲线测定

以MRS肉汤培养基为空白对照,将乳酸菌接入MRS肉汤培养基,在37 ℃摇床中恒温培养24 h,每隔2 h取样测量菌液在600 nm处的吸光度(OD600),每株菌重复3次。

1.2.3 耐酸、耐胆盐试验

耐酸试验:乳酸菌菌株活化培养后,将其接入pH为3.0的MRS肉汤培养基,于37 ℃恒温摇床培养3 h,测量菌液OD600,计算各个菌株存活率。每株菌做3个重复。阴性对照为不接种菌液的MRS肉汤培养基的OD600,阳性对照为接种菌液但不调pH的MRS肉汤培养基的OD600。
耐胆盐试验:乳酸菌菌株活化培养后,将其接入胆盐浓度为0.3%的MRS肉汤培养基,于37 ℃恒温摇床培养3 h,测量菌液OD600,计算各个菌株存活率。每株菌重复3次。阴性对照为不接种菌液的MRS肉汤培养基的OD600,阳性对照为接种菌液但不加胆盐的MRS肉汤培养基的OD600。按照如下公式计算存活率:
存活率(%)=[(待测菌株OD600-阴性对照OD600)/(阳性对照OD600-阴性对照OD600)]×100。

1.2.4 表面疏水性与自凝集试验

表面疏水性是微生物与碳氢化合物黏附的一个重要因素,用于确定细菌与宿主细胞的接触。表面疏水性试验参考王朝等[10]的方法稍作修改:乳酸菌菌株活化培养后,在4 ℃条件下7 104×g离心15 min,弃去上清,沉淀用无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS)充分洗涤,并调节菌液OD600=0.50±0.05(A0)备用。取3 mL菌液与1 mL二甲苯充分振荡混匀,37 ℃下静置孵育1 h,小心吸取下层水相,测量OD600(At)。重复操作3次。按照如下公式表面疏水率计算:
表面疏水率(%)=[(A0-At)/A0]×100。
自凝集试验:乳酸菌菌株活化培养后,在4 ℃条件下7 104×g离心15 min,弃去上清,沉淀用无菌PBS充分洗涤后重悬于无菌PBS溶液中备用。取1 mL菌液,充分振荡混匀后测量OD600(B0)。于37 ℃静置孵育4 h后,测量上清液OD600(Bt)。重复操作3次。自凝集率计算公式如下:
自凝集率(%)=[(B0-Bt)/B0]×100。
细菌表面疏水能力的划分标准为,表面疏水率在20%以下为非疏水,在20%~50%为中度疏水,在50%以上为高度疏水;细菌自聚合能力的划分标准为,自凝集率在16%~35%为低自聚合能力,在36%~50%为中等自聚合能力,在50%以上为高自聚合能力[11]。

1.2.5 抑菌试验

采用牛津杯打孔扩散法[12]测定乳酸菌菌株的抑菌性能。选取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌为病原指示菌,病原指示菌活化培养后,均匀涂布于LB平板。平板表面干燥后,用牛津杯在平板上打孔,并用镊子将多余琼脂夹出。吸取100 μL过夜培养的菌液加入孔中,置于培养箱中过夜培养。用游标卡尺测量抑菌圈直径,每株菌重复3次。将不接菌液的MRS肉汤培养基加入孔中作阴性对照。

1.2.6 抗生素敏感性试验

采用药敏片琼脂扩散法(K-B法)[13]进行分离菌株的药敏试验。将乳酸菌接入MRS肉汤培养基,在37 ℃摇床中过夜培养,用无菌PBS溶液调整浊度与比浊管(0.5麦氏单位)相同。将乳酸菌菌液均匀涂抹于MRS琼脂培养基,待平板表面干燥后贴相应药敏片,置于培养箱中过夜培养,用游标卡尺测量抑菌圈直径,与美国临床实验室标准化协会(CLSI)标准比较判断乳酸菌菌株的药物敏感性(判断标准见表1)。每种药敏片重复3次。所用药敏片为阿莫西林、羧苄西林、呱拉西林、苯唑西林、新霉素、庆大霉素、氟苯尼考、多西环素、头孢氨苄、头孢拉定、头孢他啶、头孢呋辛、头孢哌酮、氧氟沙星。
表1 药敏片种类、含药量及抑菌圈直径判断标准

Table 1 Standard about inhabitation zone diameter and species and drug loading of susceptibility discs

抗生素
Antibiotics		 含药量
Drug loading/
(μg/片)		 抑菌圈直径判断标准
Standard about inhabitation zone diameter/mm
耐药R 中介I 敏感S
阿莫西林Amoxicillin 10 ≤13 14~17 ≥18
羧苄西林Carbenicillin 100 ≤19 20~22 ≥23
呱拉西林Piperacillin 100 ≤17 18~20 ≥21
苯唑西林Oxacillin 1 ≤10 11~12 ≥13
新霉素Neomycin 30 ≤12 13~16 ≥17
庆大霉素Gentamicin 100 ≤12 13~14 ≥15
氟苯尼考Florfenicol 30 ≤12 13~17 ≥18
多西环素Doxycycline 30 ≤12 13~15 ≥16
头孢氨苄Cephalexin 30 ≤14 15~17 ≥18
头孢拉定Cefradine 30 ≤14 15~17 ≥18
头孢他啶Ceftazidime 30 ≤14 15~17 ≥18
头孢呋辛Cefuroxime 30 ≤14 15~17 ≥18
头孢哌酮Cefoperazone 75 ≤15 16~20 ≥21
氧氟沙星Ofloxacin 5 ≤12 13~15 ≥16

1.2.7 溶血试验

乳酸菌菌株活化培养后,以金黄色葡萄球菌为阳性对照,用接种环将各乳酸菌分别接种至血平板,倒置培养24 h,观察有无溶血环产生[13]。

1.2.8 体内安全性评价

将28只C57BL/6J小鼠随机分为4组,每组7只,进行为期28 d的饲养。对照组(C组)小鼠每天灌胃200 μL的生理盐水,其他3组为试验组,分别灌胃相同体积的乳酸菌L3(G1组)、乳酸菌L5(G2组)以及乳酸菌L3与L5混合菌液(混合比例为1∶1,G3组),菌液浓度均为1×109 CFU/mL,试验期间所有小鼠自由采食和饮水,并定期更换垫料。灌胃28 d之后对每组小鼠进行剖检,对乳酸菌的体内安全性进行评价。所有动物护理和样本收集程序严格按照西北农林科技大学实验动物管理和伦理审查委员会批准的协议执行,动物许可证号为:IACUC2024-1015。

1.2.9 统计学分析

试验数据使用Excel 2019进行预处理,统计分析采用SPSS 26.0统计软件进行,以P<0.05表示差异显著,数值以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 分离纯化结果

试验共筛选出35株疑似乳酸菌菌株,按顺序命名为L1~L35,部分细菌形态和革兰氏染色镜检结果如图1所示,分离菌株纯化后,菌落呈乳白色、表面光滑,经革兰氏染色后呈阳性反应,菌株形状表现为杆状。
图1 部分菌株的菌落形态及细胞形态

Fig.1 Conlony morphology and cell morphology of some strains

2.2 生理生化鉴定结果

对分离菌株进行糖发酵试验和生理生化鉴定,部分检测结果见表2和表3。根据《伯杰氏系统细菌学手册》和《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》(GB 4789.35—2016)[14],初步判定分离菌株为唾液乳杆菌。
表2 部分菌株糖发酵试验结果

Table 2 Results of saccharide fermentation test of some strains

菌株编号
Strain
numbers		 纤维二糖
Fibrous
disaccharides		 麦芽糖
Maltose		 甘露醇
Mannitol		 水杨苷
Salicin		 山梨醇
Sorbitol		 蔗糖
Sucrose		 棉子糖
Cotton
candy		 菊糖
Inulin		 乳糖
Lactose
L2 + + + + + + + + +
L3 + + + + + + + + +
L4 + + + + + + + + +
L5 + + + + + + + + +
L7 + + + + + + + + +
L11 + + + + + + + + +
L13 + + + + + + + + +
L21 + + + + + + + + +
L22 + + + + + + + + +
L24 + + + + + + + + +

“+”表示阳性,“-”表示阴性。表3同。

“+” means positive, and “-” means negative. The same as Table 3.

表3 部分菌株生理生化试验结果

Table 3 Results of physiological and biochemical tests of some strains

菌株编号
Strain
numbers		 明胶
Gelatin		 吲哚
Indole		 硫化氢
Hydrogen
sulfide		 硝酸盐肉汤
Nitrate broth		 过氧化氢
Hydrogen
peroxide		 产酸
Acid
production		 产气
Gas
production
L2 + - - - - + -
L3 + - - - - + -
L4 + - - - - + -
L5 + - - - - + -
L7 + - - - - + -
L11 + - - - - + -
L13 + - - - - + -
L21 + - - - - + -
L22 + - - - - + -
L24 + - - - - + -

2.3 乳酸菌产酸能力

乳酸菌终末pH和乳酸含量如表4所示,结果显示产乳酸含量最多的是L7,其余按乳酸含量降序排列依次为L21、L11、L5、L22、L30、L13、L28、L31、L15;终末pH最低的为L2,然后依次为L3、L24、L4、L7、L22、L5、L13、L17和L21。综合考虑,最终选择L2、L3、L4、L5、L7、L11、L13、L21、L22和L24共10株乳酸菌进行后续试验。
表4 乳酸菌终末pH和乳酸含量

Table 4 Lactic acid bacteria terminal pH and lactate content

菌株编号
Strain numbers		 乳酸含量
Content of lactic
acid/(mmol/L)		 终末pH
Terminal pH		 菌株编号
Strain numbers		 乳酸含量
Content of lactic
acid/(mmol/L)		 终末pH
Terminal pH
L1 84.65±3.76 4.05±0.00 L19 92.16±5.72 4.05±0.01
L2 84.65±5.74 3.98±0.00 L20 73.96±4.28 4.02±0.01
L3 87.33±5.08 3.99±0.02 L21 143.76±21.79 4.01±0.01
L4 112.87±11.66 4.00±0.00 L22 139.90±14.42 4.00±0.01
L5 140.50±7.99 4.01±0.02 L23 109.31±3.94 4.02±0.00
L6 93.86±2.05 4.09±0.00 L24 93.86±2.18 4.00±0.01
L7 156.24±11.38 4.00±0.00 L25 115.54±7.04 4.02±0.01
L8 94.75±6.29 4.02±0.01 L26 102.18±12.79 4.02±0.01
L9 90.89±3.08 4.05±0.01 L27 103.37±2.50 4.05±0.01
L10 74.55±6.99 4.05±0.01 L28 128.61±2.87 4.02±0.01
L11 141.68±13.96 4.02±0.01 L29 116.14±6.33 4.02±0.00
L12 87.92±3.57 4.02±0.01 L30 135.15±7.21 4.04±0.01
L13 131.58±6.24 4.01±0.01 L31 118.81±5.37 4.07±0.02
L14 103.66±6.89 4.26±0.00 L32 98.61±14.31 4.04±0.01
L15 117.33±11.54 4.02±0.01 L33 90.30±2.44 4.04±0.01
L16 101.58±6.43 4.18±0.01 L34 92.08±5.13 4.02±0.00
L17 101.58±2.71 4.01±0.01 L35 105.15±5.02 4.02±0.00
L18 106.63±6.08 4.05±0.01

2.4 分子生物学鉴定结果

由表5可知,将乳酸菌的16S rRNA序列在NCBI上比对后发现,筛选出的10株乳酸菌均为唾液乳杆菌,除了L21和L24与唾液乳杆菌同源性分别为99.93%和97.23%以外,其余菌株与标准菌株的同源性均为100.00%。
表5 乳酸菌的鉴定结果

Table 5 Identification results of lactic acid bacteria

菌株编号
Strain numbers		 菌种名称
Strain name		 拉丁文名称
Latin name		 同源性
Homology/%
L2 唾液乳杆菌 Ligilactobacillus salivarius 100.00
L3 唾液乳杆菌 Ligilactobacillus salivarius 100.00
L4 唾液乳杆菌 Ligilactobacillus salivarius 100.00
L5 唾液乳杆菌 Ligilactobacillus salivarius 100.00
L7 唾液乳杆菌 Ligilactobacillus salivarius 100.00
L11 唾液乳杆菌 Ligilactobacillus salivarius 100.00
L13 唾液乳杆菌 Ligilactobacillus salivarius 100.00
L21 唾液乳杆菌 Ligilactobacillus salivarius 99.93
L22 唾液乳杆菌 Ligilactobacillus salivarius 100.00
L24 唾液乳杆菌 Ligilactobacillus salivarius 97.23

2.5 生长曲线

37 ℃条件下10株乳酸菌的生长情况见图2。分离到的10株乳酸菌菌株在MRS肉汤中培养24 h的生长情况相似,在培养2 h后开始大量繁殖,进入对数生长期,12 h达到稳定期,整体呈典型的“S”曲线。
图2 乳酸菌生长曲线

Fig.2 Growth curves of lactic acid bacteria

2.6 耐酸、耐胆盐试验结果

10株乳酸菌在pH为3.0的MRS肉汤中的存活率如图3-A所示。在培养3 h以后,10株乳酸菌的存活率均在30%以上,其中L4的存活率最高,为36.25%,L7的存活率最低,为32.59%。从耐酸试验结果可以看出L4的耐酸性最好,其次是L22、L11、L5和L2。10株乳酸菌在胆盐浓度为0.3%的MRS肉汤培养基中的存活率如图3-B所示。除L2的存活率较低,为29.58%以外,其余9株乳酸菌的存活率均在30%以上,其中L5的存活率最高,为41.14%。从耐胆盐试验结果可以看出,L5表现出较强的胆汁耐受力,其次是L3、L7、L11和L4。
图3 乳酸菌的耐酸、耐胆盐能力

A:乳酸菌耐酸能力;B:乳酸菌耐胆盐能力。数据柱标记不同字母表示差异显著 (P<0.05),下图同。

Fig.3 Acid tolerance and bile salt tolerance of lactic acid bacteria

A: acid tolerance of lactic acid bacteria; B: bile salt tolerance of lactic acid bacteria. Data columns with different letters indicated significant difference (P<0.05), the same as below.

2.7 表面疏水性与自凝集试验结果

表面疏水率和自凝集率反映的是细菌的黏附能力,10株乳酸菌的表面疏水率与自凝集率如图4所示。本试验分离出的10株乳酸菌有不同程度的表面疏水性,表面疏水率范围在67.57%~87.76%,与其他菌株相比,L5的表面疏水率最高,为87.76%,其次为L2、L13和L3;10株乳酸菌有不同程度的自凝集能力,且部分菌株的自凝集率存在显著差异(P<0.05),其中L24有较强的自凝集能力,其次为L11和L5。
图4 乳酸菌的表面疏水性和自凝集能力

A:乳酸菌的表面疏水率;B:乳酸菌的自凝集率。

Fig.4 Surface hydrophobicity and auto-aggregation ability of lactic acid bacteria

A: surface hydrophobic rate of lactic acid bacteria; B: auto-agglutination rate of lactic acid bacteria.

2.8 对主要肠道致病菌的抑菌性能

以MRS培养基为空白对照,测定分离出的10株乳酸菌对3种肠道致病菌的抑制作用,抑菌圈直径如表6所示,L2对大肠杆菌的抑制作用最强,抑菌圈直径为(13.392±0.138) mm;L3对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强,抑菌圈直径为(14.475±0.150) mm,L13和L22对金黄色葡萄球菌的抑制作用较弱,抑菌圈直径分别为(9.736±0.146) mm和(8.789±0.088) mm;L21对鼠伤寒沙门氏菌的抑制能力最强,抑菌圈直径为(13.323±0.351) mm,综上所述,该试验分离出的10株乳酸菌均能抑制常见肠道致病菌的生长。
表6 抑菌圈直径

Table 6 Inhibition zone diameters mm

菌株编号
Strain numbers		 指示菌Indicator bacteria
大肠杆菌
Escherichia coli		 金黄色葡萄球菌
Staphylococcus aureus		 鼠伤寒沙门氏菌
Salmonella typhimurium
L2 13.392±0.138 13.216±0.038 13.137±0.205
L3 12.219±0.146 14.475±0.150 12.453±0.171
L4 11.561±0.157 13.384±0.851 12.516±0.242
L5 11.837±0.122 13.831±0.348 11.959±0.195
L7 12.771±0.135 12.497±0.576 12.296±0.163
L11 12.162±0.203 11.188±0.007 11.343±0.253
L13 12.005±0.156 9.736±0.146 12.917±0.367
L21 13.199±0.161 11.905±0.355 13.323±0.351
L22 13.113±0.171 8.789±0.088 12.567±0.331
L24 11.909±0.103 12.815±0.148 12.979±0.277
MRS 7 7 7

2.9 抗生素敏感性试验结果

用药敏片琼脂扩散法测定分离的10株乳酸菌对临床常用抗生素的耐药性,结果如表7所示,所有分离菌株对阿莫西林、呱拉西林、氟苯尼考、多西环素、头孢拉定、头孢呋辛和氧氟沙星都表现出敏感性,但对苯唑西林和庆大霉素耐药。综上所述,本试验分离出的10株乳酸菌对临床上常用的抗生素表现出不同程度的敏感。
表7 抗生素敏感性试验结果

Table 7 Results of antibiotic susceptibility test

抗生素
Antibiotics		 L2 L3 L4 L5 L7 L11 L13 L21 L22 L24
阿莫西林Amoxicillin S S S S S S S S S S
羧苄西林Carbenicillin S S I S I S S S S S
呱拉西林Piperacillin S S S S S S S S S S
苯唑西林Oxacillin R R R R R R R R R R
新霉素Neomycin R I R R R R R I I R
庆大霉素Gentamicin R R R R R R R R R R
氟苯尼考Florfenicol S S S S S S S S S S
多西环素Doxycycline S S S S S S S S S S
头孢氨苄Cephalexin I I I S I S S S S S
头孢拉定Cefradine S S S S S S S S S S
头孢他啶Ceftazidime I I I S I I S I S S
头孢呋辛Cefuroxime S S S S S S S S S S
头孢哌酮Cefoperazone S S I S S S S S S S
氧氟沙星Ofloxacin S S S S S S S S S S

R表示菌株对抗生素耐药,I表示菌株对抗生素中度敏感,S表示菌株对抗生素敏感。

R indicates that strain is resistant to antibiotics, I indicates that strain is moderately sensitive to antibiotics, and S indicates that strain is sensitive to antibiotics.

2.10 溶血试验结果

金黄色葡萄球菌和乳酸菌在血琼脂平板上的生长形态如图5所示,金黄色葡萄球菌菌落周围出现透明溶血环,为β-溶血;本试验分离出的10株乳酸菌菌落周围没有出现透明溶血环,证明不能使红细胞溶解,为γ-溶血。综上所述,本试验分离出的10株乳酸菌对机体有一定的安全性。
图5 乳酸菌的溶血活性

Fig.5 Hemolytic activity of lactic acid bacteria

2.11 体内安全性评价

综合考虑10株菌株在体外环境中的益生特性,本试验选取L3和L5菌株进行小鼠体内安全性试验。如图6所示,试验期间,试验组和对照组小鼠生长正常,毛色干燥光亮,均无中毒和死亡现象,乳酸菌对小鼠体重和采食量无显著影响(P>0.05),剖检后发现无腹腔积水和出血症状,组织脏器均未见眼观可见的病理变化且脏器指数无显著差异(P>0.05),且与单独灌胃乳酸菌组小鼠相比,L3和L5混合灌胃后小鼠体重、采食量及脏器指数均无显著差异(P>0.05)。以上试验结果表明乳酸菌L3和L5对小鼠无毒副作用。
图6 乳酸菌体内安全性试验结果

A:小鼠体型;B:小鼠体重曲线;C:小鼠采食量;D:小鼠脏器指数。

Fig.6 Results of in vivo safety test of lactic acid bacteria

A: body size of mice; B: body weight curve of mice; C: feed intake of mice; D: organ indexes of mice.

3 讨论

我国农业农村部第318号公告《饲料添加剂品种目录》中公布了15种可直接在动物饲料中添加的微生物种类,乳酸菌为其中之一。其中唾液乳杆菌不仅可以调节肠道微生物菌群,还可以产生抑制病原菌生长的抗菌化合物,刺激机体产生保护性免疫应答,抑制金黄色葡萄球菌等主要致病菌[15-16]。有研究指出,同源益生菌定植能力更强、能更快适应肠道内环境,且对宿主的益生作用也优于异源性菌群,因此理想的益生菌菌种常从动物肠道中分离[17-18]。本研究从健康仔猪粪便中分离出10株产酸能力较好的乳酸菌,经鉴定为唾液乳杆菌,并进一步对其益生性和安全性进行了评价。
由于胃中的酸性环境和肠道中的胆盐环境会破坏细胞膜结构、损伤DNA活性[19],所以益生菌在肠道内定植并发挥益生作用的首要条件是有对低pH和高胆盐的耐受力。正常情况下,胃液pH在3.0左右,小肠内胆盐浓度在0.03%~0.3%[20]。本试验中,将分离菌株分别在pH为3.0的酸性环境中和胆盐浓度为0.3%的胆碱盐环境中培养3 h后发现,L5、L2、L13和L3表现出较高的酸耐受性,L5具有较高胆盐耐受性,其次是L7和L3,适合在肠道中生长发酵。一些其他研究也证明,菌株来源不同,对动物消化道适应性和耐受性不同[21]。
此外,乳酸菌需黏附在肠道内才能发挥调控菌群结构,促进宿主健康的功效。因此,黏附能力是评价乳酸菌益生特性的重要指标[22-23]。研究显示,表面疏水性和自凝集能力有助于乳酸菌在动物肠道内定植,表面疏水率和自凝集率越高,黏附能力越强[24]。本试验通过测定乳酸菌的表面疏水率和自凝集率间接评估其黏附能力。李建军等[25]对29株菌株进行了表面疏水性和自凝集试验,所有试验菌株的表面疏水率都在7%~32%,自凝集率在3%~81%,Zhang等[26]从荷斯坦牛生乳中分离出了疏水率在36%和70%以上的中等和较好疏水性能的乳酸菌。本试验中筛选出的10株乳酸菌有不同程度的表面疏水性和自凝集能力,其中L5的表面疏水性和自凝集能力最强,表面疏水率和自凝集率分别为(87.76±0.51)%和(23.33±0.45)%,其次为L24,表面疏水率和自凝集率分别为(79.89±0.10)%和(28.28±0.56)%,L3分别为(82.58±0.19)%和(21.81±0.26)%。
对病原微生物的抑制活性也是筛选益生菌的重要指标之一。乳酸菌在发酵过程中会产生有机酸、过氧化氢和细菌素等抗菌产物,抑制病原菌的生长[27]。大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌是较常见的肠道致病菌[28],本研究结果显示,10株乳酸菌对常见肠道致病菌均有一定的抑制效果,与前人研究结果[29-30]一致。
通常情况下,从自然界中分离的乳酸菌是安全的,但有研究指出,一些益生菌会引起溶血症和心内膜炎,因此溶血活性是筛选益生菌的重要标准之一。溶血试验结果显示,10株乳酸菌均没有潜在的溶血危害,对机体有一定的安全性。
农业农村部于2021年印发《直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南》,明确指出:“直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株为细菌的,应开展抗菌药物敏感性评价”。由于乳酸菌菌株可能存在获得抗微生物药物耐药性的情况,且乳酸菌被认为可能成为耐药基因的储存库并将其转移给致病菌,从而导致病原体耐药性传播及感染治疗复杂化。此外,益生菌在少数情况下可能致病,引起人体全身性感染(感染性心内膜炎和菌血症)。因此,在用于饲料添加剂前,对益生菌进行药敏测试,了解菌株药敏谱以避免获得性耐药的发生是非常必要的[31]。本试验选取了14种常用抗生素进行了药敏试验,结果表明,本试验分离出的10株乳酸菌除对庆大霉素和苯唑西林完全耐药外,对其他12种抗生素表现出不同程度的敏感性。从仔猪粪便中分离出耐药性低的乳酸菌,可能与仔猪规模化养殖,使用抗生素较少有关。
由于乳酸菌的体外安全性试验结果不一定反映其在体内的真实情况,其摄入后对机体的安全性仍是一个不可忽视的问题[32]。同时,考虑到复合益生菌比单一的益生菌能更好的发挥作用,本试验借鉴了28 d经口毒性试验指南,通过小鼠模型对L5和L3进行了体内安全性评价。28 d经口毒性试验期间,试验组和对照组小鼠生长正常,毛色干燥光亮,均无中毒和死亡现象,乳酸菌对小鼠体重和采食量无显著影响,剖检后发现无腹腔积水、无出血症状,组织脏器均未见眼观可见的病理变化且脏器指数无显著差异,表明L3和L5对小鼠无毒副作用,可作为饲料添加剂的候选菌株。

4 结论

本试验从健康仔猪粪便中分离筛选出10株产酸性能较好的乳酸菌,经鉴定均为唾液乳杆菌。其中,耐酸能力较好的乳酸菌有L5、L2、L13和L3;耐胆盐能力较好的乳酸菌有L5、L7和L3;对肠上皮细胞具有较强黏附能力的乳酸菌有L5、L24和L3。相较于其他菌株,L5和L3在体外环境中表现出更好的益生性、抗逆性和抑菌性,且具有安全性,可作为畜禽微生态制剂的候选菌株,应用于畜禽饲粮中。

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