蒲公英(Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.)别名婆婆丁,主要产于北半球温带至亚热带地区。作为药食同源的中草药,蒲公英提取物含有皂苷、多糖、生物碱等多种活性成分,具有抗氧化、抗炎、抑菌、提高免疫力等多种功能[1-4]。近年来,蒲公英及其提取物在养殖生产活动中常作为抗生素的替代品,用于改善畜、禽、鱼类的生长性能,增强动物的免疫力和抗氧化能力,进而提高畜、禽、鱼类的生产效益[5]。
Sun等[6]研究发现,在饲料中添加蒲公英提取物可以降低杂交石斑鱼全身的脂质含量,增加抗氧化酶过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽还原酶(GR)以及炎症因子白细胞介素-8(IL-8)的mRNA相对表达量。在对鲤鱼的研究中发现,蒲公英提取物可以提高鲤鱼增重率(WGR)和饲料系数(FCR),改善血液生化指标及增强机体抗氧化能力[7];在对斑马鱼的研究中发现,蒲公英提取物可以减少机体炎症反应[8]。Tan等[9]研究发现,饲料中添加蒲公英提取物可通过改善鲳鱼肠道形态、免疫、抗氧化能力和肠道屏障来促进肠道健康。综上所述,蒲公英提取物能够改善鱼类的生理功能,促进鱼类的健康成长。
四氯化碳(CCl4)作为经典的致肝细胞坏死的肝损伤模型药物,广泛运用于研究保肝药物及药用植物提取物的评价[10-11]。李洪宇等[12]使用CCl4诱导小鼠急性肝损伤,探讨了两色金鸡菊提取物的保肝作用;何秋霞等[13]利用CCl4处理斑马鱼仔鱼,制作了CCl4致损的斑马鱼肝损伤模型;Krasnov等[14]利用CCl4胁迫后的虹鳟鱼幼鱼,研究了影响虹鳟鱼参与细胞应激、蛋白质折叠和类固醇代谢的结构蛋白和基因等。综上所述,CCl4在试验动物肝损伤模型的建立中具有广泛的应用。因此,本研究采用CCl4注射的方法,建立珍珠龙胆石斑鱼肝损伤模型,进而研究饲喂不同浓度蒲公英提取物饲料的珍珠龙胆石斑鱼经过CCl4注射后其肝脏形态、血清生化指标和抗氧化基因表达水平的变化情况。
珍珠龙胆石斑鱼是以抗病力强的棕点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)为父本和生长速度快的鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)为母本杂交而来的,具有亲本双方生长速度快、蛋白质含量高、肉质纤维细腻等优点[15],显示出较强的杂种优势,已经成为中国、韩国、日本以及东南亚等地区的重要经济鱼类[6],具有较高的经济价值。但关于蒲公英提取物对珍珠龙胆石斑鱼等水产动物在CCl4胁迫下的保肝作用仍不清楚。因此,本研究以不同浓度蒲公英提取物对CCl4胁迫后珍珠龙胆石斑鱼肝脏形态、血清生化指标和抗氧化能力的影响进行分析,探索不同浓度蒲公英提取物对石斑鱼保肝护肝和抗氧化能力的影响,为蒲公英提取物作为水产动物免疫增强剂的应用提供理论依据和数据参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本研究所使用的蒲公英提取物购自南京道斯夫生物科技有限公司,其有效成分黄酮含量为20%;珍珠龙胆石斑鱼苗来自惠州大亚湾试验基地,平均体重为(43.32±0.60) g。
1.2 试验设计和饲料制作
华南师范大学动物饲养管理与使用委员会批准了本研究(批准文号:SCNU-SLS-2023-040),本研究严格遵循了相关指导原则。
选择体重相近、状态良好的珍珠龙胆石斑鱼300尾,随机分成5组,每组3个重复,每个重复20尾。对照组饲喂基础饲料,试验组(Ⅰ~Ⅳ组)分别在基础饲料中添加0.1%、0.2%、0.4%和0.8%的蒲公英提取物。以鱼粉和豆粕为蛋白质源,以鱼油和豆油为脂肪源制作饲料。所有的饲料原料经粉碎后过60 mm目筛,将原料均匀混合后按30%的比例加入纯净水,然后使用双螺杆挤条机(购自华南理工大学)和造粒机(购自华南理工大学)将混合后的饲料制成直径为2.5 mm的颗粒料。自然晾干,置于-20 ℃的冰箱中保存备用。饲料组成及营养水平见先前发表的数据[6]。
1.3 石斑鱼饲养与管理
将珍珠龙胆石斑鱼随机饲养于容量为500 L的玻璃钢桶中,在正式试验之前用商品饲料暂养1周。按照试验计划,提前准备15个玻璃钢桶并按1~15依次编号,分别随机取20尾鱼置于各个桶中。除投喂的饲料组分不同外,各组间饲养管理无差异,每天进行2次饱食投喂(08:00和16:00)。养殖期为8周,养殖期间水温23~30 ℃,盐度保持30‰,溶氧量在6.0 mg/L以上,pH保持在7.8~8.0,氨氮含量低于0.05 mg/L。
1.4 胁迫试验
养殖期结束后,饥饿24 h。使用橄榄油将CCl4稀释至30%。试验组(Ⅰ~Ⅳ组)每重复随机取10尾鱼,注射橄榄油稀释的30% CCl4;对照组每重复随机取10尾鱼,再随机分为2组,每组3个重复,每重复10尾鱼,一组注射纯橄榄油作为空白对照组,另一组注射30% CCl4作为模型组。各组均采用腹腔注射(按照每10 g体重0.05 mL的剂量)。注射完成后,胁迫72 h,密切监测石斑鱼的生理状态。
1.5 样品收集
CCl4胁迫72 h后,每桶随机取活鱼3~5尾,用100 mg/L的MS-222麻醉,用1 mL注射器从尾部静脉处取血,将血样置于离心管中,在冰箱4 ℃放置过夜后放入离心机进行1 000×g离心10 min,取上清获得血清样本,-80 ℃冻存;然后剖开腹部,剥离出肝脏、头肾和脾脏,取适量样本。每组样品中随机取适量肝脏,置于4%多聚甲醛保存,用于制作组织切片观察肝脏形态;其余样品迅速于液氮速冻后,置于-80 ℃冰箱保存,用于分析抗氧化基因表达。
1.6 指标测定
1.6.1 肝脏组织切片的制作与观察
取4%多聚甲醛固定好的肝脏组织0.5 cm3,经水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后,附贴于用甘油处理过的载玻片上进行苏木精-伊红(HE)染色,用中性树胶进行封片,置于光学显微镜下观察并记录,评估肝脏组织形态变化。
1.6.2 血清生化指标测定
使用全自动生化分析仪(7180型,HITACHI公司,日本)按照WAKO LabAssay系列试剂盒(上海金畔生物科技有限公司)的说明书,分别测定血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)活性及总蛋白(TP)、球蛋白(GLOB)、白蛋白(ALB)含量。
1.6.3 抗氧化基因表达
根据试剂盒(北京全式金生物科技有限公司)说明书操作,采用两步法在荧光定量PCR仪(CFX96,Bio-Rad Laboratories, Inc.,美国)测定各组石斑鱼肝脏、脾脏和头肾的Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)、锰超氧化物歧化酶(MnSOD)、GPX、CAT和GR的mRNA相对表达量。引物序列参考之前已发表的文章[6]。
1.7 数据统计分析
试验结果采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),并用Duncan氏多重比较法进行差异显著性分析,结果以平均值±标准差(mean±SD)表示,P<0.05为存在显著差异。
2 结果
2.1 蒲公英提取物对CCl4胁迫后珍珠龙胆石斑鱼肝脏形态的影响
如图1所示,与空白对照组对比,模型组肝细胞发生空泡化,部分细胞膜明显破裂,且大部分细胞核位置发生明显偏移或者聚集现象;试验Ⅱ组肝细胞形态比较完整,未出现空泡化,细胞核位置居中;试验Ⅲ组肝细胞出现空泡化,细胞膜边缘模糊化,且细胞核发生细微偏移,细胞核保持着较完好的形态结构;试验Ⅳ组肝细胞核明显偏移,核膜破裂导致形态发生改变。
2.2 蒲公英提取物对CCl4胁迫后珍珠龙胆石斑鱼血清生化指标的影响
如表1所示,试验Ⅰ组血清ALT活性最低,试验Ⅰ、Ⅱ组血清ALT活性显著低于模型组(P<0.05);空白对照组血清ALP活性显著低于其他各组(P<0.05);试验Ⅱ组血清ALB含量显著高于空白对照组和模型组(P<0.05)。各组之间血清AST、LDH活性及TP、GLOB含量无显著差异(P>0.05)。
表1 蒲公英提取物对CCl4胁迫后珍珠龙胆石斑鱼血清生化指标的影响Table 1 Effects of dandelion extract on serum biochemical indexes of pearl gentian grouper after CCl4 stressed |
| 项目 Items | 空白对照组 Blank control group | 模型组 Model group | 试验Ⅰ组 Test group Ⅰ | 试验Ⅱ组 Test group Ⅱ | 试验Ⅲ组 Test group Ⅲ | 试验Ⅳ组 Test group Ⅳ |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 丙氨酸氨基转移酶 ALT/(U/L) | 10.67±3.79ab | 13.67±2.31b | 5.33±1.15a | 7.50±4.95a | 8.00±1.73ab | 11.33±3.51ab |
| 天冬氨酸氨基转移酶 AST/(U/L) | 16.00±0.00 | 22.00±11.36 | 15.50±0.71 | 19.50±2.12 | 18.00±8.49 | 20.50±3.54 |
| 碱性磷酸酶 ALP/(U/L) | 93.33±11.50a | 134.00±18.95b | 148.00±8.89b | 146.33±17.04b | 123.33±6.66b | 140.33±23.46b |
| 乳酸脱氢酶 LDH/(U/L) | 110.00±25.46 | 132.00±15.56 | 96.50±17.68 | 114.00±46.67 | 114.50±54.45 | 127.33±41.04 |
| 总蛋白TP/(g/L) | 38.15±2.05 | 36.73±0.62 | 38.00±1.41 | 37.95±2.92 | 38.45±2.33 | 36.55±0.92 |
| 球蛋白GLOB/(g/L) | 32.05±1.48 | 30.57±0.35 | 31.35±0.92 | 30.20±0.99 | 30.33±2.56 | 29.90±0.57 |
| 白蛋白ALB/(g/L) | 6.50±0.80a | 6.30±0.14a | 6.65±0.49ab | 7.75±0.07b | 6.67±0.45ab | 6.65±0.30ab |
2.3 蒲公英提取物对CCl4胁迫后珍珠龙胆石斑鱼抗氧化能力的影响
2.3.1 蒲公英提取物对CCl4胁迫后珍珠龙胆石斑鱼肝脏抗氧化基因表达的影响
如图2所示,模型组肝脏Keap1的mRNA相对表达量显著高于空白对照组(P<0.05);试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组肝脏Keap1的mRNA相对表达量呈现逐渐增高的趋势,但均显著低于模型组(P<0.05)。模型组肝脏GPX、CAT和GR的mRNA相对表达量均显著高于空白对照组(P<0.05)。试验Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组肝脏GPX和MnSOD的mRNA相对表达量均显著高于试验Ⅰ组和空白对照组(P<0.05)。模型组及试验Ⅰ、Ⅱ组肝脏CAT和GR的mRNA相对表达量显著高于其他各组(P<0.05)。
图2 蒲公英提取物对CCl4胁迫后珍珠龙胆石斑鱼肝脏抗氧化基因表达的影响数据柱标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下图同。 Fig.2 Effects of dandelion extract on expression of antioxidant genes in liver of pearl gentian grouper after CCl4 stressed Value columns with the same small letter mean no significant difference (P>0.05), while with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as below. |
2.3.2 蒲公英提取物对CCl4胁迫后珍珠龙胆石斑鱼头肾抗氧化基因表达的影响
如图3所示,空白对照组头肾Keap1、GPX和MnSOD的mRNA相对表达量显著高于其他各组(P<0.05)。模型组头肾CAT和GR的mRNA相对表达量显著低于其他各组(P<0.05)。试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组头肾GPX和CAT的mRNA相对表达量呈现先降低后升高的趋势,且均在试验Ⅲ组达到最低值。
2.3.3 蒲公英提取物对CCl4胁迫后珍珠龙胆石斑鱼脾脏抗氧化基因表达的影响
如图4所示,空白对照组脾脏Keap1的mRNA相对表达量显著低于模型组及试验Ⅲ、Ⅳ组(P<0.05)。模型组脾脏MnSOD和GR的mRNA相对表达量显著低于空白对照组(P<0.05)。试验Ⅲ组脾脏MnSOD和CAT的mRNA显著高于模型组(P<0.05)。
3 讨论
3.1 蒲公英提取物对CCl4胁迫后珍珠龙胆石斑鱼肝脏形态的影响
通过显微镜认真观察肝组织切片,本研究发现CCl4胁迫对石斑鱼肝脏造成了显著的损伤,表现为肝脏细胞空泡化、细胞核偏移及聚集等病理现象。这些观察结果与先前研究中CCl4对水生生物及哺乳动物肝脏的毒性作用相一致,进一步验证了CCl4作为肝损伤诱导剂的可靠性。值得注意的是,饲喂添加蒲公英提取物饲料的珍珠龙胆石斑鱼在CCl4胁迫后,其肝脏的病理变化得到了明显的改善。特别是肝细胞空泡化和细胞核聚集现象,在蒲公英提取物的作用下得到了显著的缓解。这一发现不仅揭示了蒲公英提取物对石斑鱼肝脏损伤具有潜在的修复作用,还提示蒲公英提取物中的某些活性成分可能具有保护肝脏免受化学性损伤的能力。通过对比不同试验组的肝脏组织切片,发现饲料中添加0.2%的蒲公英提取物展现出了最佳的修复效果。这一结果不仅为蒲公英提取物的应用提供了具体的浓度参考,也为后续深入研究其活性成分及作用机制奠定了基础。
3.2 蒲公英提取物对CCl4胁迫后珍珠龙胆石斑鱼血清生化指标的影响
血清生化指标如ALT、AST、LDH和ALP等,在一定程度上可以反映水生动物的生理健康情况[18]。ALT广泛分布于肝脏、骨骼、肠、肾等组织,参与水解核酸、蛋白质、生物碱等机体活动。AST存在于干细胞的线粒体,参与氨基酸代谢和尿素循环的关键步骤。正常情况下,ALT和AST在血清中的活性不高,但是当鱼体的细胞破裂,其中的ALT和AST释放到血清中,使得在血清中的ALT和AST活性升高,一定程度上表明鱼体的肝功能出现异常[19]。LDH是一种在细胞代谢和能量产生中有着重要作用的酶。ALP存在于肝脏、骨骼和胆管等组织中,起促进磷酸酶水解反应的作用。TP由ALB和GLOB共同组成。ALB是肝脏实质性细胞合成,用于修补机体组织和提供能量,与GLOB共同反映机体对环境的抵抗力[20]。在正常范围内ALB和GLOB的含量升高时,一定程度上反映了机体的免疫力提高[21]。
本试验发现,模型组血清中ALT活性和ALB含量较高,说明石珍珠龙胆斑鱼肝脏受到较严重损伤,肝脏细胞可能发生破裂甚至死亡。而添加蒲公英提取物组血清中ALT活性有所降低,且添加0.1%和0.2%蒲公英提取物时其活性较低;该结果与Tan等[9]研究蒲公英提取物对改善金鲳幼鱼免疫功能的结果,以及Sun等[22]关于混合植物提取物对杂交石斑鱼血清生化指标影响的研究结果相似。同时,也有相关研究表明,蒲公英提取物中含有的蒲公英醇对肝炎具有抑制作用[23],菊苣酸能有效抑制炎症细胞的形成[24],这可能是蒲公英提取物对动物肝脏具有较好的保护作用。笔者推测,蒲公英提取物可能通过调节肝脏代谢途径,减少有害物质的积累,从而降低ALT的释放。此外,蒲公英提取物中的某些成分可能直接作用于免疫细胞,提高机体的免疫力,表现为血清ALB和GLOB含量的升高。
3.3 蒲公英提取物对CCl4胁迫后珍珠龙胆石斑鱼抗氧化能力的影响
在正常生理状态下,动物体内活性氧处于动态平衡状态,但是许多外源性或内源性刺激会导致动物体内氧化还原状态趋向氧化,进而对动物体造成伤害。动物体的抗氧化系统酶促系统主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、CAT、GPX、GR等[25]。Keap1-核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路是细胞氧化应激反应中的关键通路,其调控作用在细胞防御保护中发挥着重要作用[26]。该信号通路可作为衡量鱼类是否受到外界环境干扰的重要指标,在一定程度上反映鱼类的生理状况。本试验进一步分析了Keap1-Nrf2信号通路在其中的作用,发现蒲公英提取物可能通过抑制Keap1的表达,激活Nrf2信号通路,从而上调抗氧化酶的表达,提高机体的抗氧化能力。这一发现不仅揭示了蒲公英提取物对珍珠龙胆石斑鱼抗氧化能力的调控机制,也为其他水产动物的研究提供了新的思路。此外,本试验也深入挖掘了数据之间的关联性,发现蒲公英提取物能改善珍珠龙胆石斑鱼肝脏形态和提高其抗CCl4胁迫能力,可能是通过抑制肝脏炎症反应和提高肝脏抗氧化能力来实现的。
本试验发现饲料添加适量的蒲公英提取物能降低CCl4胁迫后珍珠龙胆石斑鱼肝脏、头肾和脾脏Keap1的mRNA相对表达量。与饲料中添加适量枸杞提取物[27]、千里光提取物[28]、银杏叶提取物[29]和三七提取物[30]可以显著降低杂交石斑鱼的Keap1 mRNA相对表达量的结果相似。本试验中,料中添加适宜水平的蒲公英提取物能提高CCl4胁迫后石斑鱼肝脏、头肾和脾脏MnSOD、CAT和GR的mRNA相对表达量,这与鲤鱼[7]、杂交石斑鱼[6]、蛋鸡[32]和肉鸡[31]的研究结果相似。而饲粮中蒲公英提取物添加量为0.8%时,上述各基因的mRNA相对表达量接近于CCl4致损的模型组水平,这可能是因为蒲公英提取物添加过量所致。
4 结论
在珍珠龙胆石斑鱼饲料中添加适量的蒲公英提取物,可以适当地减弱肝细胞被有害物质的侵害,保证肝脏正常的代谢和解毒功能,同时还能调控血清各生化指标,提高抗氧化能力,以增强石斑鱼的综合免疫力。本试验条件下,蒲公英提取物适宜添加量为0.1%~0.2%。