益生菌是一类活的微生物,当摄入一定量时,能给宿主的健康带来益处[1]。在畜禽生产中,益生菌及其发酵产物具有调节畜禽肠道微生态平衡、促进营养物质消化吸收、提高免疫力和抗氧化能力等益生功能,对畜禽健康和生产性能产生积极影响[2-3]。然而,在实际生产与应用中,益生菌易受到冷冻干燥、高温、低pH和胆汁等胁迫环境影响,严重威胁其活性和益生特性[4]。近年来,许多研究致力于开发新型的益生菌递送系统,以提高益生菌在生产加工和胃肠道中的耐受性,增强其生物利用度。微胶囊、水凝胶和生物被膜等递送系统已被证实能显著提高益生菌的加工与贮藏稳定性、胃酸胆盐耐受性和肠道黏附定植能力[5-6],其中,生物被膜的递送系统因其在抗逆性、对抗病原菌和调节免疫功能等方面的显著优势,成为当前研究热点。生物被膜是细菌适应胁迫环境的一种生存方式,能够提高益生菌的抗逆性和改善其益生功能[7]。因此,益生菌生物被膜递送系统在畜禽养殖中具有巨大的应用潜力。本文综述了益生菌生物被膜的形成过程及其影响因素,并综述了基于生物被膜的递送系统种类及其作用,旨为益生菌在畜禽生产中的应用提供参考。
1 益生菌生物被膜的形成过程及其影响因素
益生菌生物被膜的形成受到自身特性、调控行为以及外部因素(如载体材料表面性质、外源性物质等)影响,以不同途径与机制调控成膜量。细菌可通过自身的基因调控其生物被膜形成。例如,枯草芽孢杆菌的epsA-O和tapA-sipW-tasA操纵子控制胞外多糖和蛋白质TasA的合成来影响其生物被膜的形成[11];而大肠杆菌Nissle 1917的kfiA基因影响荚膜多糖合成,从而调控生物被膜形成[12]。此外,载体材料表面的润湿性、粗糙度等物理特性显著影响细菌的初始黏附和生物被膜的形成[13]。研究表明,带正电的材料表面可促进与细菌的相互作用和生物被膜的形成[14];表面疏水性材料(聚苯乙烯表面)较亲水性材料(不锈钢、陶瓷)更利于促进细菌的黏附[15]。另外,生物被膜的形成受金属离子、盐浓度、pH和温度等环境因素的影响,如Mn2+、Fe3+、Mg2+和Na+在一定浓度下都可以对生物被膜的形成起到促进作用,Cu2+、Cu+、Al3+、Ca2+、Pb+和Zn+等金属离子则会对生物被膜的形成起到抑制作用[16]。细菌细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)含有脂质、核酸、蛋白质等营养成分,这些成分能够介导生物被膜细胞之间的黏附并维持生物被膜的稳定性,增强细菌生物被膜的形成[17]。外源性物质,如氮源、碳源、微量元素、植物提取物、益生元等可以有效地提高益生菌生物被膜的强度[18]。研究表明,儿茶素、染料木黄素和蔓越莓提取物可刺激乳酸菌生物被膜的形成[19]。
2 基于生物被膜的益生菌递送系统
基于生物被膜的益生菌递送系统可分为2种,一种是自封装,益生菌自身分泌的EPS形成生物被膜以封装细菌;另一种是载体封装,利用递送载体封装益生菌以形成生物被膜,或将益生菌封装在特定材料中,之后形成生物被膜。例如,壳聚糖包衣的海藻酸钠胶囊,形成外源性微胶囊化和内源性生物被膜结构双重保护作用,增强益生菌在生产加工和胃肠道中的耐受性,提高生物口服利用度[20]。
2.1 自封装
益生菌可通过分泌的胞外多糖和蛋白质形成生物被膜来封装益生菌,提高其在胁迫环境的耐受性[21]。如枯草芽孢杆菌可通过分泌的胞外多糖和蛋白TasA促进其在固体培养基或气液表面形成生物被膜[11]。研究报道,相较于浮游态的枯草芽孢杆菌,生物被膜态的枯草芽孢杆菌在猪中表现出显著的胃肠道耐受性和黏附性,其口服生物利用度、肠道定植能力分别是浮游态的125、17倍[22]。细菌纤维素(bacterial cellulose,BC)是一种主要由某些类型细菌产生的有机化合物,作为一种天然可再生聚合物,BC具有独特的特定结构和特性,包括高纯度、三维纳米纤维网络、高结晶度、卓越的机械性能、形成过程中的高可塑性和生物相容性,其中木酸醋杆菌和葡萄糖酸杆菌是合成纤维素较强的细菌[23]。Pepicelli等[24]通过乳化液模板法来制备由木酸醋杆菌分泌的BC来封装生物被膜态的益生菌微胶囊,使用微流体装置进行控制乳化可生产具有可调尺寸和单分散性的BC胶囊;另外,液滴稳定性和细菌纤维素的形成易受细菌浓度、液滴大小和表面活性剂类型的影响。
2.2 载体封装
2.2.1 微胶囊
近年来,一些研究将微胶囊包被技术与生物被膜培养有效结合,以形成高密度的生物被膜态的益生菌微胶囊,其外源性微胶囊化和内源性生物被膜结构的双重保护作用可提高益生菌在胁迫环境中的耐受性,并实现其在宿主肠道中缓释、黏附和定植,从而发挥益生作用。基于生物被膜的益生菌微胶囊可分为内源型生物被膜态的益生菌微胶囊和外源型生物被膜态的益生菌微胶囊,前者是将浮游态的益生菌经挤压法、乳化法等微胶囊化技术制备成半渗透微胶囊,在特定的培养条件下形成生物被膜;后者为将预先培养的生物被膜态的益生菌微胶囊化。
目前,海藻酸盐、壳聚糖、果胶等多糖常被用作益生菌微胶囊壁材。Cheow等[25]研发了一种以多糖为壁材的鼠李糖乳杆菌微胶囊,再通过在半渗透的微胶囊内原位培养浮游态的鼠李糖乳杆菌,使微胶囊内生长高密度的生物被膜,结果显示,与浮游态的益生菌微胶囊相比,具有生物被膜的鼠李糖乳杆菌微胶囊具有更强的耐冷冻性和耐热性,其中壳聚糖涂层的海藻酸盐微胶囊在模拟肠液中的细胞控释能力和储存性能均优于卡拉胶微胶囊。另外,微胶囊包被壁材的浓度[26]和益生菌生物被膜的培养时间和生长培养基[27]对益生菌在不良环境中的存活率影响不一。添加植物油可延缓生物被膜态的益生菌微胶囊在胃肠道中的释放[28]。生物被膜态的益生菌微胶囊还可靶向递送至结肠释放益生菌,黏附并定植于肠道黏膜。果胶酸钙珠对胃酸具有一定的抗性,可被结肠中的细菌酶特异性降解,常用作益生菌结肠靶向分子递送载体[29]。Heumann等[30]的体外试验发现,与浮游态的副干酪乳杆菌微胶囊相比,果胶钙微球包被的生物被膜态的副干酪乳杆菌在酸、冷冻干燥、盐、模拟胃肠道条件下的存活率提高;体内试验结果显示,灌胃小鼠果胶钙微球包被的生物被膜态的副干酪乳杆菌可在结肠中释放并定植在其表面,对小鼠坏死性小肠结肠炎具有一定的缓解作用。
目前的研究主要集中在内源型生物被膜态的益生菌微胶囊,且其抗逆性、模拟胃肠道液的释放性能均优于外源型的。最近一项研究报道,使用果胶钙粒、壳聚糖-果胶钙珠粒和海藻酸钠-果胶-乳清珠粒3种微胶囊壁材来制备类植物乳杆菌LR-1的内源型和外源型生物被膜态的益生菌微胶囊,结果发现,使用海藻酸钠-果胶-乳清珠粒原位培养(内源型)的类植物乳杆菌LR-1生物被膜具有更强的耐热、耐盐、耐酸和耐冷冻能力,以及更优的储存性能和在人工胃肠道中的释放率,这可能归因于原位培养的类植物乳杆菌LR-1生物被膜包埋的微胶囊结构更为致密[31]。
2.2.2 葡聚糖微球(dextran microspheres,DMs)
DMs具有多孔、半渗透、生物相容性、生物可降解等特性,是以葡聚糖为原料与交联剂经交联反应后制备得到的聚合物微球[32]。研究表明,DMs的多孔结构可预先负载麦芽糖、蔗糖等益生元,在胃肠道内逐渐释放,为黏附在DMs表面的益生菌提供营养物质以促其生长和生物被膜形成[33]。罗伊氏乳杆菌具有葡萄糖基转移酶(glucosyltransferase,GTFW),依赖GTFW介导的黏附作用与交联葡聚糖相互作用形成生物被膜;而DMs对非GTFW表达细菌如鼠李糖乳杆菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、艰难梭状芽孢杆菌等病原体的黏附性极低[34]。Navarro等[35]的体外试验发现,负载高浓度的蔗糖或麦芽糖的DMs形成的罗伊氏乳杆菌生物被膜显著提高了益生菌在低pH下的存活率,并提高了罗伊氏乳杆菌对人结直肠腺癌上皮细胞DLD-1和人小肠上皮细胞FHs 74Int的黏附率。
2.2.3 纳米纤维
纳米纤维主要通过静电纺丝技术制备而来,具有高比面积、高孔隙率、孔径小等结构特征,有利于细菌附着并提供适宜的三维立体空间,便于营养物质和代谢产物的传输,是一种理想的生物被膜载体。赵子舒[36]对比7种纤维材料对副干酪乳杆菌生物被膜形成的影响,包括涤纶纤维膜、聚丙烯纤维膜、聚丙烯纤维膜(内部表面都有孔)、聚丙烯纤维膜(表面无孔内部有孔)、碳纳米纤维膜、醋酸纤维素微米纤维膜及醋酸纤维素纳米纤维膜,结果发现,纤维直径为0.3 μm的醋酸纤维素纳米纤维膜可大量黏附细菌并形成典型的生物被膜,而其他载体材料则成膜能力较差。与浮游态的植物乳杆菌相比,纳米纤维膜负载的生物被膜态的植物乳杆菌在恶劣环境下显示出更高的存活率,并作为发酵剂在货架期内具有较高的发酵能力和存活率[37]。赵子舒等[38]研究发现,添加4 mmol/L多巴胺溶液改性后的微米级聚丙烯纤维膜的生物相容性大大增加,其表面形成致密的副干酪乳杆菌生物被膜,而未经改性处理的纤维膜仅有少量的细菌黏附。
2.2.4 膳食纤维
膳食纤维具有表面粗糙、比表面积大且可大规模发酵制备等特点,适用于食品益生菌生物被膜工业化生产。不同非水溶性膳食纤维基质对益生菌形成生物被膜的能力和时间有显著影响。陈翠翠等[39]通过摇床动态培养双歧杆菌来探究其分别在黄豆粉、小麦纤维、笋干粉、玉米粉、葡萄籽粉及苹果纤维6种非水溶性膳食纤维介质表面的成膜能力及其抗逆性,结果表明,双歧杆菌在葡萄籽粉上的成膜能力最强,成膜率为(36.68±2.75)%,最佳成膜时间为36 h;其次是小麦纤维,成膜率为(33.39±0.87)%,最佳成膜时间为24 h;而笋干粉的成膜能力最差;此外,葡萄籽粉和小麦纤维负载的生物被膜态的双歧杆菌在冻干、模拟胃肠液中的存活率显著高于浮游态的双歧杆菌。Grossova等[40]使用益生菌发酵马铃薯纤维、玉米淀粉、燕麦纤维等固体基质,发现嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌和短双歧杆菌对这3种固体基质的黏附性差,而对荞麦和豌豆显示出较强的黏附性。Amoah等[41]研究发现,枯草芽孢杆菌可在鹰嘴豆奶的抗性淀粉纤维上形成生物被膜,其显著提高枯草芽孢杆菌抗菌色素pulcherrimin的产生,从而提高枯草芽孢杆菌的耐受性和存活率,这可能是抗性淀粉纤维通过激活tapA操作子调控枯草芽孢杆菌的生物被膜形成的原因。
2.2.5 其他
蒙脱石属于天然无机材料,具有阳离子交换、吸附能力强、比表面积大等特点,可吸附益生菌[42]。大多数益生菌,如双歧杆菌、乳杆菌属于乳酸菌,其细胞壁含有大量带负电的磷壁酸,细菌表面一般带负电荷[43]。正电荷载体材料更能促进益生菌黏附成膜,而负电荷载体材料可能因静电排斥而不利于其黏附成膜。天然蒙脱石通常带有负电荷,Han等[43]通过3-氨基丙基三乙氧基硅烷对蒙脱石进行变性处理,使得蒙脱石其表面持续带正电,嗜酸乳杆菌可在其表面形成生物被膜。Grossova等[40]通过光学显微镜发现,嗜酸乳杆菌和长双歧杆菌在二氧化硅载体表面形成生物被膜能力优于高岭土、磷酸钙。另外,聚乳酸复合豆粕制成的载体也支持戊糖片球菌生物被膜的形成,且在第1天即可形成致密的生物被膜[44]。Rangaswamy等[45]将德氏乳杆菌固定至网状聚氨酯泡沫表面进行生物被膜的培养,并填充到反应器中生产乳酸,结果发现聚氨酯泡沫为乳酸菌生物被膜的形成提供了一个良好的支架,同时乳酸产量显著提高,且在不增加接种量的条件下,可连续反应超过1 000 h。聚β-羟基丁酸酯(poly-β-hydroxybutyric acid,PHB)是许多细菌的重要能量底物,也被称为“细菌脂肪”,有助于细菌在营养物质缺乏和环境压力下生存[46]。PHB表面疏松多孔的结构为约氏乳杆菌生物被膜的形成提供了有利的生态位。研究表明,约氏乳杆菌黏附于PHB形成生物被膜,在模拟胃液、胆盐、胆汁酸等恶劣环境中具有较高的存活率,显示出较强的抗逆性[47]。
3 益生菌生物被膜递送系统的作用
3.1 增强黏附能力和抗逆性
研究报道,生物被膜态的益生菌较浮游态的益生菌具有更强的黏附能力和耐酸、耐胆盐、耐高温等耐受性。益生菌在宿主肠道中持续发挥生理作用的前提是其能够黏附于宿主肠上皮细胞膜[48]。fbb为纤黏蛋白编码基因,参与细胞的黏附作用;而rop N和rrf2基因与细菌的运动性相关,间接影响细菌黏附性。研究发现,生物被膜态的类植物乳杆菌L-ZS9在高温、胆盐条件下的存活率显著提高,对HT-29细胞的黏附率为浮游态的1.5倍,且生物被膜显著上调其黏附相关基因fbb、rop N和rrf2的mRNA表达水平,具有较强的黏附性,并显著上调其胁迫相关基因atpβ、atpε、clp、pspC、ccpA及群体感应信号分子自诱导物-2(autoinducer-2,AI-2)合成关键基因luxS的转录水平,提高益生菌黏附性和抗逆性[49-50]。类似地,Zhang等[51]研究发现,生物被膜态的植物乳杆菌Y42对HT-29细胞的黏附率是浮游态的1.1倍,并显著提高其在人工模拟胃肠液的存活率。He等[52]使用冷冻干燥法制备玉米醇溶蛋白/纤维素复合水凝胶,发现罗伊氏乳杆菌可在其复合物上形成生物被膜,可使罗伊氏乳杆菌具有良好的胆盐、人工胃肠液耐受性。Yao等[53]研究发现,嗜盐四联球菌生物被膜具有更高的表面电荷、亲水性和表面黏附特性,提高了嗜盐四联球菌在强酸、乙醇、高温和氧化胁迫下的存活率。
3.2 免疫调节
益生菌可通过调节树突状细胞、激活巨噬细胞和促进抗体产生等机制,增强宿主固有免疫和适应性免疫能力,调控炎症因子表达,改善机体免疫能力[54]。生物被膜态的益生菌相较于浮游态的益生菌具有更强的免疫调节能力[55]。Liu等[56]研究发现,相较于浮游态的植物乳杆菌L-ZS9,生物被膜态的副植物乳杆菌L-ZS9可显著提高犬血清免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)和分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,sIgA)水平,并降低细胞因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)水平,增强机体免疫力。Michael等[57]研究报道,DMs负载的大肠杆菌Nissle 1917生物被膜可增强新生营养不良猪对人轮状病毒的免疫反应,减少猪粪便中人类状病毒脱落,降低腹泻率,并增强血液单核细胞的自然杀伤细胞毒性,促进肠道浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells,pDCs)和传统树突状细胞(conventional dendritic cells,cDCs)活化,增强全身组织中的B细胞免疫反应和促进特异性免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)抗体分泌细胞增殖,从而提高营养不良猪免疫能力,改善由人轮状病毒引起的腹泻。乳酸菌和双歧杆菌能在蒙脱石层间紧密黏附并形成生物被膜,通过Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)介导树突状细胞的成熟,刺激CD8+T细胞增殖,并上调细胞因子白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)的表达,进而抑制肿瘤生长[43]。M1型巨噬细胞是由IFN-γ、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)等诱导巨噬细胞分化而来,调控促炎因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、IL-6、IL-12等表达[58]。CD14是LPS受体,能够识别并结合LPS/脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)复合物,进而将LPS呈递给TLR受体[59]。研究表明,干酪乳杆菌生物被膜可促进小鼠骨髓来源巨噬细胞CD14表达,激活TLR2信号通路,促进M1型巨噬细胞极化,调控相关炎症因子表达,增强间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的成骨分化[60]。由此可见,益生菌生物被膜可通过多种机制调节宿主的免疫反应,包括影响树突状细胞的抗原呈递、巨噬细胞的激活以及促进抗体产生来增强机体免疫反应。
3.3 抑菌
益生菌生物被膜可通过抑制病原菌生物被膜形成、竞争性占位来对抗致病菌[61]。研究表明,相较于浮游态的乳酸菌,生物被膜态的乳酸菌可分泌更高水平的抗菌因子[62]。在生物医用材料领域,许多研究利用大肠杆菌83972、植物乳杆菌、干酪乳杆菌等益生菌,在生物医用材料表面形成高密度且稳定的生物被膜作为抗菌涂层,从而具有生物稳定性和耐久性。Carvalho等[63]通过使用植物乳杆菌生物被膜来涂层有机硅以预防尿路感染,结果表明,有机硅表面的植物乳杆菌生物被膜涂层与大肠杆菌接触3、6和12 h后,大肠杆菌活菌数分别降低了76%、77%和99%,这可能是通过竞争排斥抑制致病菌在材料表面的初始黏附,从而有效抑制致病菌的后续生物被膜形成。甘露糖苷表面与Ⅰ型菌毛末端的FimH受体特异性结合,可促进大肠杆菌83972的初始黏附[64]。Lopez等[65]研发了一种改性聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料,可通过甘露糖衍生物共价修饰PDMS以增强大肠杆菌83972的初始黏附;结果表明,经甘露糖衍生物共价修饰48 h,PDMS表面形成致密且稳定的大肠杆菌83972生物被膜,且在72 h对致病性的粪肠球菌的黏附性降低了104倍,而未经修饰的PDMS表面对致病菌的黏附率仅降低了5.5倍。Tan等[60]研究发现,干酪乳杆菌可富集钛植入体表面并形成生物被膜,其代谢产物乳酸和细菌素在体内和体外对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌表现出优异的抗菌性能。综上所述,生物被膜态的益生菌可分泌更高水平的抗菌因子,并通过竞争黏附位点以抑制致病菌的黏附和生长,进而达到抑菌效果。
3.4 调节肠道微生物群落
益生菌可通过竞争营养物质、分泌抗菌物质以及抑制有害菌增殖,改善肠道健康[66]。陈则东等[67]研究发现,生物被膜态的植物乳杆菌LR-39显著提高了比格犬肠道乳杆菌属、双歧杆菌属、异杆菌属、消化链球菌属的相对丰度,有效调整肠道菌群结构。生物被膜态的植物乳杆菌Y42的自聚集能力、疏水性、酸电荷和黏附性均高于浮游态的植物乳杆菌Y42,具有较强的黏附性能[68]。研究报道,生物被膜态的植物乳杆菌Y42可显著提高小鼠血清IgA含量[51];此外,生物被膜态的植物乳杆菌Y42还可显著提高单核细胞增生李斯特菌ATCC 19115感染的小鼠肠道中紧密连接蛋白-1(claudin-1)、闭合蛋白(occludin)、闭锁小带蛋白-1(zonula occluden-1,ZO-1)和黏蛋白2(mucin 2,MUC2)的表达,并抑制了核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体通路的激活,降低小鼠血清中炎症因子白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)水平[69]。研究报道,在海藻酸钠-果胶-乳清珠粒微胶囊中原位培养形成的类植物乳杆菌LR-1生物被膜可调节葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导溃疡性结肠炎(UC)小鼠肠道微生物菌群,提高厚壁菌门和拟杆菌门比值、乳酸杆菌相对丰度,促进肠道健康,缓解小鼠炎症[31]。
3.5 其他作用
4 小结
益生菌生物被膜的形成是一个复杂的多因素调控过程,涉及益生菌自身的调控行为和外界环境因素的相互作用。益生菌可通过自封装和载体封装形成稳定的生物被膜,增强其在生产加工过程和胃肠道中的耐受性。益生菌生物被膜的递送系统具有较强的黏附性和抗逆性,可有效调节免疫功能、抑制病原菌生长、调节肠道微生物平衡,在改善畜禽生产性能、肠道健康等方面具有巨大潜力。然而,益生菌生物被膜的研究尚处于起步阶段,对其形成机制的深入理解、递送系统的优化以及实际应用中的稳定性和效率问题仍存在挑战。未来研究需全面深入探索分子机制,以及如何准确评估益生菌生物被膜在体内的定植效果和功能发挥。此外,研究还需关注如何通过活性物质促进益生菌生物被膜的形成以及生物被膜的安全性问题。