在畜禽养殖中,由于畜禽产品药物残留、病原菌产生耐药性等会严重危害畜禽和人体健康,我国已全面禁止饲用抗生素的应用。因此,探寻安全健康、高效的抗生素替代品对畜禽养殖发展具有重要意义。与传统化学抗菌剂相比,植物精油(essential oils,EOs)具有低毒和高效等优点,被列为公认安全的物质,可作为抗生素的替代品,并且在制药、化妆品、食品等领域被广泛应用[1]。EOs作为植物组织中提取的天然次生代谢产物,可广泛地应用于畜禽生产中[2],已发现EOs及其挥发性成分具有很强的抗菌活性,可用于提高畜禽生产性能,改善动物肠道免疫状态,丰富有益微生物群,促进动物健康,并减少病原微生物感染的不利影响。EOs的抗菌活性是其生物活性的重要标志,受到其生物活性成分及官能团的影响[3-4]。EOs的活性成分丰富,作用机理多样,表现出不同的抗菌能力。因此,本文将重点介绍EOs的抗菌活性和作用机理及其在畜禽肠道微生物群调节中的应用,为EOs在生产中作为天然安全的替抗产品提供理论参考。
1 EOs的抗菌作用
EOs不仅抗菌活性较强,更重要的是可抑制多重耐药菌。相较于传统抗生素的广谱抗菌活性,部分EOs还具有一定的选择性抗菌活性。此外,Eos之间的协同作用还可提高其抗菌活性,降低成本。已有大量研究证明EOs对多种致病菌具有较强的抗菌活性,包括革兰阴性菌如大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)、沙门氏菌(Salmonella)等,以及革兰阳性菌如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)、脂环芽孢杆菌(Alicyclobacillus spp.)、单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,L.monocytogenes)等[5-8]。
1.1 抗耐药菌活性
已有研究证明EOs对多重耐药菌具有抗菌活性。Bastida-Ramírez等[9]通过微量稀释试验测定牛至精油和百里香精油对产广谱β-内酰胺酶E.coli的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)分别为632和738 μg/mL,最低杀菌浓度(minimal bactericidal concentration,MBC)分别为892和940 μg/mL,表明2种EOs具有较强的抗耐药菌活性。仙人掌、茶树、天竺葵和百里香精油对抗耐甲氧西林S.aureus的评估结果表明,4种EOs均对人畜共患S.aureus具有强大的抗菌作用[10]。因此,EOs可能是减少细菌对传统抗生素的耐药性的抗生素替代品候选者之一。
1.2 选择性抗菌活性
1.3 协同抗菌活性
EOs复合使用后具有的协同抗菌活性,即较其单独使用时的抗菌活性更高,也是提高EOs抗菌活性有效的途径之一。Ouedrhiri等[16]研究表明,野洋柑橘精油和波旁天竺葵精油复合对S.aureus和E.coli有协同抗菌作用;香菜精油和孜然精油混合后对E.coli、S.aureus、蜡样芽孢杆菌和L.monocytogenes具有较高的抑菌活性[17];Zhang等[18]研究发现,大蒜、生姜和甜菜EOs联合使用对降低E.coli、S.aureus和P.aeruginosa的数量有更好的效果;牛至精油和肉桂精油联合使用后的协同抗菌活性使E.coli生长变得更缓慢,且具有剂量效应[19]。在畜牧业中,EOs之间发挥协同作用有助于提高其协同抗菌活性,减少使用剂量,降低成本[20]。综上所述,可深入挖掘不同EOs之间组合效应,提高其协同抗菌活性。
2 EOs的抗菌作用机理
EOs的不同抗菌机制如图1所示,本部分主要介绍EOs通过不同途径发挥抗菌作用的机制。
图1 EOs的不同抗菌机制ATP:三磷酸腺苷 adenosine triphosphate;TCA cycle:三羧酸循环 tricarboxylic acid cycle;LPS:脂多糖 lipopolysaccharide;TLR4:Toll样受体4 Toll like receptor 4;NLRP3:核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3 nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3;ROS:活性氧 reactive oxygen species。 Fig.1 Different antimicrobial mechanisms of Eos |
2.1 破坏细菌细胞完整性
2.1.1 破坏细胞包膜结构
细菌细胞包膜是一个复杂的多层结构,用来保护细菌免受破坏,EOs可破坏该结构,干扰细菌正常功能(图2-A)。EOs通过降低膜电位、改变膜蛋白的构象以及膜中脂肪酸的比例和结构等方式增加细胞膜的通透性,破坏其正常的生命活动。生姜精油处理E.coli和S.aureus可降低细菌膜电位,使细胞膜受损,蛋白质和核酸等大分子物质外流,导致细菌死亡[21]。Li等[22]研究发现,罗勒精油可与L.monocytogenes的磷脂双层相互作用并破坏脂肪酰基链的顺序,增加其细胞膜通透性,促进细胞内离子、电解质和β-半乳糖苷酶等大量外流,从而导致细菌死亡。肉桂醛精油可氧化E.coli细胞膜中的不饱和脂肪酸,破坏细胞膜完整性[23]。此外,已有研究表明0.4和0.8 μL/mL的肉桂精油处理肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis,S.enteritidis)可显著增加其外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)中OmpF、OmpA和OmpX的蛋白相对表达量[24],干扰细菌细胞包膜功能,从而发挥抗菌作用。
2.1.2 抑制生物膜的形成
细菌形成生物膜后会产生一种紧密的保护性基质,使其能够附着和定植于不同的表面,增强其耐药性。细菌生物膜形成过程中受到细菌群体感应(quorum sensing,QS)的调节。EOs对不同致病菌的生物膜形成具有抗性作用(图2-B),降低相关基因的表达,清除成熟的生物膜,从而发挥抗菌作用[19,25-26]。此外,QS受到干扰后可减少细菌黏附、附着和定植,破坏细菌分散[27],重要的是EOs可作为QS抑制剂,减少细菌毒力因子和生物膜的产生,从而发挥抗菌作用。牛至精油可减少S.aureus参与QS通信,对生物膜的形成有很强的抑制作用[26]。印加孔雀草精油可减少P.aeruginosa PAO1约50%毒力因子绿脓菌素的产生,且抑制Las系统、Rhl系统以及假单胞菌喹诺酮信号系统等3个QS系统,使得QS通路受阻,抑制生物膜形成[28]。
2.2 影响细菌生物分子物质
2.3 干扰细菌呼吸和能量代谢
2.4 调控信号转导通路
EOs可影响细菌细胞内的信号通路,导致细胞功能障碍(图1-D)。姜黄精油可以抑制肠道微生物群-脂多糖/Toll样受体4信号通路和阻断小鼠核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体的激活,从而增加有益菌相对丰度,降低有害菌相对丰度[37]。同样有研究报道了大蒜精油可抑制大鼠NLRP3炎性小体途径,增加了有益的产短链脂肪酸细菌的相对丰度[38]。肠道菌群还可通过代谢物实现对宿主的生理功能的调控,色氨酸就是肠道微生物与宿主相互影响的代谢物之一。EOs可重塑1日龄公鸭肠道微生物群来调节色氨酸代谢并激活芳烃受体信号通路[39]。此外,EOs诱导细菌发生氧化应激,积累过量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)使得细胞内氧化还原平衡被打破,促进细菌氧化损伤从而导致死亡。0.4、0.8和1.6 μL/mL的肉桂精油显著增加细菌ROS含量,破坏细胞抗氧化酶系统平衡,增加膜脂质代谢物丙二醛含量,增加蛋白质羰基化,从而引起细胞的氧化和损伤,最终抑制了S.enteritidis的生长[24]。同样也有报道称,迷迭香精油和桃金娘精油以剂量依赖方式增加ROS的产生,并降低过氧化氢酶的活性,导致S.aureus死亡[40]。总之,EOs可导致细菌细胞内的信号通路发生障碍从而发挥抗菌作用,保护宿主免受细菌感染。
3 EOs对畜禽胃肠道微生物群的调控作用
由于EOs具有较强的抗菌作用,在畜禽饲粮中添加EOs可通过多方面途径发挥对畜禽胃肠道微生物群组成和功能的调控作用(图3),从而影响畜禽肠道健康,提高动物生产性能。
3.1 EOs调控畜禽肠道微生物群的组成和功能
在畜禽饲粮中添加EOs可调节肠道微生物组成,提高生产力。已有研究报道了在家禽饲粮中补充茴香精油、大蒜精油、牛至精油、薄荷精油和迷迭香精油等EOs,可引起肠道中微生物群的变化,抑制特定细菌病原体的生长,改善机体免疫力,促进有益菌定植,从而促进肠道健康,最终改善家禽的生长速率和/或料重比[2]。E.coli种群会释放毒素导致微生物群与宿主肠上皮细胞之间发生密切的相互作用,从而破坏肠黏膜[41]。Zou等[42]研究表明,在猪饲粮中补充25 mg/kg牛至精油可降低猪空肠、回肠和结肠中的E.coli数量,促进肠道屏障完整性。此外,Zhang等[43]在小尾寒羊饲粮中添加5、10、15 mL/kg的花椒精油后发现小肠中细菌组成产生差异,影响了营养物质的消化吸收和肠道健康状况,因此增加了小尾寒羊的终体重、平均日增重、干物质摄入量和饲料转化率。
肠道微生物组成与免疫反应和肠道屏障密切相关,EOs可通过调节肠道微生物群从而发挥免疫调节作用和保护肠道健康。在断奶仔猪的基础饲粮中补充1.5 g/kg大蒜精油后,发挥了免疫调节作用,这可能与大蒜精油改变了微生物群组成有关[44]。在断奶仔猪基础饲粮中添加400 mg/kg EOs(由香芹酚、百里香酚和肉桂醛组成的混合物)的结肠菌群分析,结果显示丹毒菌科、霍尔德曼氏菌属、考拉杆菌属和弧菌属显著富集,这可能与仔猪炎症通路抑制有关[45]。以上研究表明,EOs可通过调节仔猪肠道微生物群组成从而发挥免疫调节作用。此外,在黄羽肉鸡饲粮中添加150和300 mg/kg牛至精油可增加肠道厚壁菌门相对丰度,降低变形菌门和放线菌门相对丰度,增强肠道屏障功能,降低炎症反应[46]。在绵羊基础饲粮中补充52 mg/d的牛至精油,增加了肠道瘤胃球菌属、双歧杆菌属、肠球菌属相对丰度,但降低了优杆菌属相对丰度,有助于改善其生长性能和肠道屏障功能[47]。综上所述,EOs可通过调节畜禽肠道微生物群改善免疫能力和肠道屏障功能。
3.2 EOs调控畜禽肠道微生物群的代谢
微生物产生的代谢物可充当信号分子,触发肠道黏膜的免疫系统并控制炎症。短链脂肪酸代谢物可以通过与特定受体结合来释放炎症介导的信号。Ruan等[46]研究发现,牛至精油增加了黄羽肉鸡肠道中芽孢梭状杆菌属的相对丰度,该菌可产生短链脂肪酸,表明牛至精油具有为肠道细胞提供能量和保护肠道屏障的能力,同时改善氨基糖和核苷酸糖代谢、膜转运、复制和修复系统等功能,促进营养吸收并增强肠道屏障功能,减少肠道病原菌的数量,提高了上皮细胞的再生能力,从而增加了营养物质的吸收。此外,色氨酸衍生的代谢物还通过与肠黏膜上的芳香烃受体结合,增强肠上皮屏障,在控制免疫反应中发挥作用。有研究报道,补充牛至精油会促进绵羊肠道中瘤胃球菌、双歧杆菌和肠球菌的富集,影响肠道微生物群的组成和代谢物,表现出嘧啶代谢和色氨酸代谢的改变并增加代谢物吲哚-3-乙酸和吲哚乙醛的水平[47]。Choi等[48]利用FishTaco分析发现,在韩国本地山羊饲粮中补充1 g/d红松松果精油后改变了瘤胃原核微生物群的组成和代谢途径如丙酮酸代谢,且理研菌属可能是参与瘤胃组氨酸生物合成和丙酮酸氧化代谢途径富集的微生物类群。总之,微生物代谢物通过与肠上皮和黏膜免疫细胞相互作用,间接影响宿主健康和肠道免疫,而EOs可通过影响畜禽肠道微生物群的代谢来保护肠道健康。
3.3 EOs调控反刍动物瘤胃微生物群的组成和功能
反刍动物瘤胃微生物在饲料发酵、甲烷产生和氮利用过程中起着关键性作用,其活性直接影响反刍动物的生产性能和健康状况,EOs可通过调节瘤胃微生物群组成,提高营养物质利用率、生产性能和健康状况。在体外瘤胃发酵试验中,牛至精油增加了普雷沃氏菌和迪亚利斯特细菌的相对丰度,改变了瘤胃微生物群落,进而改变了瘤胃发酵和由此产生的挥发性脂肪酸浓度,表明它有可能调控了瘤胃发酵和减少甲烷排放[49]。在动物体内,在饲粮中添加500 mg/d的桉叶和茴香精油会影响肉羊体内瘤胃产甲烷菌区系,显著降低瘤胃甲烷短杆菌的相对丰度,从而降低瘤胃甲烷产量,调节瘤胃发酵[50]。Wang等[51]同样发现,在绵羊饲粮中添加桉叶和茴香精油改变了瘤胃微生物种群,降低了肠道甲烷排放。在韩国本地山羊饲粮中添加1 g/d红松松果精油,改变了瘤胃原核微生物群组成和功能,降低了甲烷排放[48]。此外,Belanche等[52]研究发现,给奶牛饲喂1 g/d的精油混合物时,甲烷排放量减少,并提高奶产量。EOs具有调节瘤胃生态系统和微生物群的巨大能力,更重要的是可在瘤胃发育的早期阶段提高营养利用率、性能和健康状况。如在断奶期为新生犊牛补充3.75 g/次的精油混合物(香芹酚、石竹烯、对伞花酚、桉树脑、松油烯和百里香酚)后,可增加瘤胃普雷沃氏菌科的相对丰度,改善短链脂肪酸丙酸盐的产生,调节瘤胃细菌群的生长[53]。总之,EOs可调节反刍动物瘤胃微生物的组成,影响瘤胃发酵,减少甲烷的排放。
综上所述,EOs的抗菌活性在动物生产中的应用主要在于调节胃肠道菌群、提高畜禽免疫力、增强胃肠道屏障功能和提高饲料利用率,从而提高畜禽的生产性能。然而,EOs的在畜禽生产中的应用也具有一定局限性。EOs活性成分的化学结构和物理特性对其发挥抗菌活性最为重要[54]。研究表明,EOs中含有多种生物活性化合物,其中以醛类或酚类化合物为主的EOs抗菌活性最高,其次是萜醇类,其他以酮或酯类化合物为主的EOs抗菌活性要弱得多,而以萜烯烃类为主的EOs通常不活跃[3]。Patra等[55]也报道了具有酚类结构的化合物(如牛至精油),相比其他EOs,在减少厚壁菌门、梭菌纲和丁弧菌属的相对丰度方面表现出更强的抗菌活性。由此可见,EOs的抗菌作用会因EOs的来源、化学组成和剂量的不同而存在较大差异。也就是说,EOs活性成分易挥发、组成复杂、易氧化且易受环境影响等特点会限制其应用,且单一EOs很难完全抑制多种细菌的生长,未来的研究可通过研究不同EOs的协同作用,开发出具有广谱抗菌活性、抗菌效果更好的EOs。另外,EOs在畜禽胃肠道中的复杂作用机理并不十分清楚。因此,需要加强开发EOs的应用技术,比如包埋技术,减少活性成分的限制,提高其抗菌活性,并且应用多组学等生物技术进一步深入研究EOs在畜禽体内的作用靶点,以解决EOs在畜禽生产中的应用问题。
4 小结
EOs能破坏细菌细胞结构,破坏细菌分子物质,并进一步干扰细胞的能量代谢以及抑制细菌信号通路,从而发挥抗菌作用。此外,EOs在畜禽体内的抗菌作用可调节胃肠道菌群组成和功能及其代谢,从而增强畜禽免疫力、保护肠道屏障功能以及提高饲料利用率,从而提高动物的生产性能。未来,应进一步研究EOs发挥抗菌作用的活性成分以及作用机理,提高EOs活性成分的稳定性,筛选其在畜禽体内发挥作用的靶点,为EOs在畜禽生产中的进一步开发与应用提供理论依据。总之,EOs因其具有独特的抗菌作用,可作为一种绿色安全的新型饲料添加剂,在禁抗趋势下具有潜在的应用前景。