Effects of Thymol on Growth Performance of Broilers and Its Mechanism

CHEN Yongzhen; HU Yue; QIAO Jiayun; LI Haihua

doi:10.12418/CJAN2025.420

Chinese Journal of Animal Nutrition >

2025 , Vol. 37 >Issue 8: 5156 - 5167

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.420

RESEARCH PAPER

Effects of Thymol on Growth Performance of Broilers and Its Mechanism

CHEN Yongzhen ^,¹ ,
HU Yue ¹ ,
QIAO Jiayun ^,²^,^* ,
LI Haihua ^,¹^,^*

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¹ Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China
² Tianjin Key Laboratory of Conservation and Utilization of Animal Diversity, College of Life Sciences, Tianjin Normal University, Tianjin 300387, China

^*QIAO Jiayun, professor, E-mail: qiaojy1979@126.com;

LI Haihua, professor, E-mail: lihaihuaok@126.com

Received date: 2025-01-07

Online published: 2025-08-14

Fold

Abstract

This study aimed to evaluate the effects of thymol on growth performance of broilers and its mechanism. A total of 200 one-day-old 817 broilers were randomly assigned into 4 groups with 5 replicates per group and 10 broilers per replicate. Broilers in the control group (group C) were fed a basal diet, and the others in experimental groups were fed the basal diet supplemented with 100 (group T1), 200 (group T2) and 300 mg/kg (group T3) thymol, respectively. The experiment lasted for 42 days, which was divided into two phases: 1 to 21 days of age and 22 to 42 days of age. The results showed as follows: 1) during 1 to 42 days of age, the feed to gain ratio of group T2 was significantly lower than that of group C and group T1 (P<0.05). 2) At 21 days of age, the serum aspartate aminotransferase (AST) activity of group T1, group T2 and group T3 was significantly lower than that of group C (P<0.05). At 42 days of age, the serum alkaline phosphatase (ALP) activity of group T1 was significantly lower than that of group C and group T3 (P<0.05). 3) At 21 days of age, the serum malondialdehyde (MDA) content of group T2 and group T3 was significantly lower than that of group C (P<0.05), and the serum immunoglobulin M (IgM) content of group T2 and group T3 was significantly higher than that of group C (P<0.05). At 42 days of age, the serum the serum MDA content of group T2 and group T3 was significantly lower than that of group C (P<0.05), and the serum glutathione peroxidase (GSH-Px) activity and IgM content of group T2 were significantly higher than those of group C (P<0.05). 4) At 21 days of age, the serum Newcastle disease virus (NDV) antibody titer of group T1, group T2 and group T3 was significantly higher than that of group C (P<0.05). 5) At 42 days of age, the jejunal villus height of group T2 and group T3 was significantly higher than that of group C (P<0.05). 6) At 21 days of age, the mRNA relative expression level of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) in jejunum of group T1 and group T2 was significantly higher than that of group C (P<0.05). At 42 days of age, the mRNA relative expression level of Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1) in jejunum of group T1 was significantly lower than that of group C (P<0.05). In conclusion, dietary thymol can improve the antioxidant capacity and immune function of broilers, promote intestinal morphology, maintain flock health, and thus improve their growth performance. In addition, thymol may improve the antioxidant capacity of broilers by activating p62-Nrf2-Keap1 signaling pathway. Under the experimental conditions, when dietary thymol supplemental level is 200 mg/kg, the feeding effect is the best.

Key words： thymol; broilers; growth performance; intestinal morphology; immune function

Cite this article

CHEN Yongzhen , HU Yue , QIAO Jiayun , LI Haihua . Effects of Thymol on Growth Performance of Broilers and Its Mechanism[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2025 , 37(8) : 5156 -5167 . DOI: 10.12418/CJAN2025.420

目前,家禽是世界上消费量最大的畜牧商品,特别是肉鸡,由于其生长周期短,在全球动物性蛋白质生产中占重要地位^[1]。如何提高鸡肉产品的安全性是肉鸡生产中面临的首要问题。为了克服对抗生素长期使用的依赖性,提高肉鸡免疫力,增强其抗病性和生产性能,一些替代抗生素的饲料添加剂正在被积极地开发和应用^[2]。植物提取物是直接来源于植物的天然生物活性物质,具有促生长、抗氧化、抗菌和增强免疫等多种生物学功能,可作为抗生素替代品在肉鸡生产中使用,且具有副作用小、不产生耐药性、安全性高等优点^[3]。

百里香酚(thymol,THY)是一种天然单萜酚的环烯衍生物,主要来源于百里香、牛至和马鞭草等药用植物,具有抗炎、抗氧化、抗菌和抗肿瘤等多种生物活性^[4]。百里香酚作为潜在的抗生素替代品,被应用于多种动物的饲粮中。有研究表明,百里香酚可能通过改善猪饲粮适口性改善高饲养密度引起的低采食量,从而提高生长性能;同时,百里香酚可通过改善营养消化率、降低促炎因子产生等积极作用,缓解高饲养密度对猪的负面影响^[5]。据报道,百里香酚可以增加应激大鼠肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,并降低促炎细胞因子的表达,发挥保肝作用^[6]。Champati等^[7]研究发现,百里香酚能够调节肠道微生物,并改善火鸡的肠道健康和免疫状态。此外,百里香酚可以加速肠绒毛上皮细胞的代谢和更新速度,保护肠道屏障,降低病原体入侵的风险^[8]。美国食品和药物管理局(FDA)将百里香酚划为普遍安全的化合物,可添加到食品中^[9]。我国尚未将百里香酚正式归入禽类饲料添加剂品类,关于其安全性、应用效果以及作用机制仍需要进一步研究和探讨。因此,本研究以817肉鸡为研究对象,通过探究百里香酚对其生长性能、肠道发育、肝脏功能、抗氧化能力及免疫功能等方面的影响,揭示其可能的作用机制,为其在生产中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用的百里香酚为市售产品,纯度在99%以上。

1.2 试验设计和饲养管理

本试验通过天津师范大学伦理委员会审查批准(批准编号:202412090)。

选择200只1日龄健康817肉鸡,随机分成4组,每组5个重复,每个重复10只鸡。对照组(C组)饲喂基础饲粮,试验组分别在基础饲粮中添加100(T1组)、200(T2组)和300 mg/kg(T3组)百里香酚。试验期为42 d,分为1~21日龄和22~42日龄2个阶段。基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) %

项目 Items	1~21日龄 1 to 21 days of age	22~42日龄 22 to 42 days of age
原料Ingredients
玉米Corn	55.30	51.78
小麦麸Wheat bran		3.40
去皮豆粕Peeled soybean meal	37.20	35.00
大豆油Soybean oil	3.00	5.80
磷酸氢钙CaHPO₄	1.40	1.10
石粉Limestone (38%)	1.20	1.20
氯化胆碱 Choline chloride (50%)	0.10	0.10
小苏打NaHCO₃	0.20	0.20
氯化钠NaCl	0.30	0.30
DL-蛋氨酸DL-Met	0.22	0.12
赖氨酸Lys	0.05	0.00
苏氨酸Thr	0.03	0.00
预混料Premix¹⁾	1.00	1.00
合计Total	100.00	100.00
营养水平Nutrient levels²⁾
代谢能ME/(MJ/kg)	12.23	12.69
粗蛋白质CP	20.28	19.58
钙Ca	0.86	0.81
总磷TP	0.62	0.60
有效磷AP	0.37	0.34
赖氨酸Lys	1.19	1.08
蛋氨酸+胱氨酸Met+Cys	0.90	0.78

1)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of diets:Fe 40 mg,Zn 100 mg,Mn 100 mg,Cu 15 mg,Se 0.35 mg,I 1 mg,VA 12 000 IU,VD₃ 5 000 IU,VE 30 IU,VK 3 mg,VB₁ 3 mg,VB₂ 8 mg,VB₆ 4 mg,VB₁₂ 12 μg,烟酸 niacin 35 mg,泛酸 pantothenate acid 15 mg,叶酸 folic acid 0.7 mg,生物素 biotin 0.15 mg。
2)代谢能和有效磷为计算值,参考NY/T 33—2004进行计算;粗蛋白质、钙、总磷和氨基酸为实测值,分别参考GB/T 6432—2018、GB/T 6436—2018、GB/T 6437—2018和GB/T 18246—2019进行测定。ME and AP were calculated values referred to NY/T 33—2004, while CP, Ca, TP and amino acids were measured values referred to GB/T 6432—2018, GB/T 6436—2018, GB/T 6437—2018 and GB/T 18246—2019, respectively.

试验采用自然通风的3层重叠笼养,于山东某鸡场进行试验。试验前对鸡舍进行清洗与消毒,每个笼子10只鸡为1个重复,每组5个重复均匀分布在1~3层。试验期间对鸡只常规免疫,舍内温度第1周控制在34 ℃左右,随后1周内温度逐步降低,直至28 ℃。每日保持鸡只24 h光照,自由采食和饮水。

1.3 样品采集

每组随机选取10只试验鸡(每个重复2只),于21和42日龄早晨取样(取样前禁食12 h,禁水2 h)。称重后,颈静脉采血,分离血清,置于-20 ℃储存,用于血清生化、抗氧化和免疫指标的测定。采血后解剖肉鸡,采集肠道组织,一部分固定在4%多聚甲醛中用于组织切片制备,用于肠道组织形态的测定;另一部分经液氮速冻后置于-80 ℃冰箱,以备荧光定量PCR检测。

每组随机选取10只试验鸡(每个重复2只),于14、21和42日龄进行翅静脉采血,分离血清,用于测定血清新城疫病毒(NDV)抗体效价。

1.4 指标测定

1.4.1 生长性能

试验鸡1、21和42日龄时,记录所有鸡只空腹重量、饲料消耗量,计算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

1.4.2 血清生化指标

使用BS-240全自动生化分析仪(深圳博兴生物科技有限公司)检测试验鸡21和42日龄血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及碱性磷酸酶(ALP)活性。

1.4.3 血清抗氧化和免疫指标

使用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(杭州联科生物技术有限公司),于肉鸡21和42日龄时,测定血清丙二醛(MDA)含量和SOD、GSH-Px活性,以及血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)含量。

采血结束后对鸡群进行新城疫免疫接种,采用血凝抑制试验测定血清NDV抗体效价。

1.4.4 肠道组织形态

参考胡月等^[10]的方法制备组织切片和染色,分析肠道组织形态。通过Revolve正倒置一体荧光显微镜(苏州艾普拜生物科技有限公司)观察肠道组织切片,每个样品选取3个视野,每个视野内取2根绒毛和2个隐窝,测量和记录绒毛高度(VH)和隐窝深度(CD),计算绒隐比(V/C)。

1.4.5 空肠抗氧化相关基因mRNA表达

参考胡月等^[10]的方法进行组织RNA提取、反转录和荧光定量PCR反应,并通过NCBI数据库和Primer Premier 5.0软件设计引物,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参基因,采用2^-△△Ct的方法计算空肠抗氧化相关基因p62、Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)和核因子E2相关因子2(Nrf2)的mRNA相对表达水平,引物序列信息见表2。

表2 引物序列信息

Table 2 Primer sequence information

基因名称 Gene names	引物序列 Primer sequences (5'—3')	片段大小 Fragment size/bp	退火温度 Annealing temperature/℃
p62	F:TTACGTGCAGGACGGAGTT R:CTTGTGGATGCCTTTACCC	220	56
Kelch样ECH相关蛋白1 Keap1	F:TACCGGCAGTCGCTGGGTT R:GTCGGGCGAGTTGTTCCTC	153	62
核因子E2相关因子2 Nrf2	F:GCACCAAAGAAAGACCCTC R:GAACTGCTCCTTCGACATCA	198	54
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 GAPDH	F:CCCCCATGTTTGTGATGGGT R:TGATGGCATGGACAGTGGTC	162	60

1.5 数据统计分析

试验数据用SPSS 27.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD法多重比较,同时进行线性和二次回归分析。试验数据以平均值和均值标准误(SEM)表示,P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 百里香酚对肉鸡生长性能的影响

由表3可知,1~21日龄和22~42日龄时,饲粮百里香酚添加水平对肉鸡末重、ADFI、ADG和F/G均无显著影响(P>0.05)。1~42日龄时,饲粮百里香酚添加水平对肉鸡ADFI和ADG均无显著影响(P>0.05);T2组F/G显著低于C组和T1组(P<0.05)。随着饲粮百里香酚添加水平的增加,22~42日龄时,末重呈线性增加(P<0.05);1~42日龄时,ADG呈线性增加(P<0.05),F/G呈线性降低(P<0.05)。

表3 百里香酚对肉鸡生长性能的影响

Table 3 Effects of thymol on growth performance of broilers

项目 Items	组别Groups				均值标准误 SEM	P值P-value
项目 Items	C	T1	T2	T3	均值标准误 SEM	方差分析 ANOVA	线性 Linear	二次 Quadratic
1~21日龄1 to 21 days of age
末重FBW/g	646.71	673.08	701.86	683.76	8.988	0.175	0.081	0.196
平均日采食量ADFI/g	41.25	42.20	42.94	42.58	0.525	0.730	0.327	0.550
平均日增重ADG/g	28.94	30.23	31.62	30.73	0.421	0.147	0.071	0.175
料重比F/G	1.43	1.39	1.36	1.39	0.009	0.052	0.058	0.068
22~42日龄22 to 42 days of age
末重FBW/g	1 822.86	1 879.81	1 920.17	1 898.33	15.127	0.118	0.045	0.161
平均日采食量ADFI/g	96.72	99.64	97.83	98.93	0.932	0.735	0.577	0.645
平均日增重ADG/g	56.01	57.46	58.01	57.84	0.390	0.261	0.083	0.278
料重比F/G	1.73	1.73	1.69	1.71	0.009	0.212	0.233	0.652
1~42日龄1 to 42 days of age
平均日采食量ADFI/g	68.99	70.92	70.38	70.75	0.638	0.732	0.417	0.559
平均日增重ADG/g	42.47	43.85	44.82	44.29	0.357	0.105	0.041	0.149
料重比F/G	1.62^a	1.62^a	1.57^b	1.60^ab	0.007	0.011	0.037	0.170

	同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05),不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。
	In the same row, values with no letter or same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 百里香酚对肉鸡血清生化指标的影响

由表4可知,21日龄时,饲粮百里香酚添加水平对肉鸡血清ALT和ALP活性均无显著影响(P>0.05);T1组、T2组、T3组血清AST活性显著低于C组(P<0.05)。42日龄时,饲粮百里香酚添加水平对肉鸡血清ALT和AST活性均无显著影响(P>0.05);T1组血清ALP活性显著低于C组和T3组(P<0.05)。随着饲粮百里香酚添加水平的增加,21日龄时,血清ALP活性呈线性降低(P<0.05);42日龄时,血清ALT、AST和ALP活性呈先降低后增加的二次变化(P<0.05)。

表4 百里香酚对肉鸡血清生化指标的影响

Table 4 Effects of thymol on serum biochemical indices of broilers U/L

项目 Items	组别Groups				均值标准误 SEM	P值P-value
项目 Items	C	T1	T2	T3	均值标准误 SEM	方差分析 ANOVA	线性 Linear	二次 Quadratic
21日龄21 days of age
谷丙转氨酶ALT	2.49	2.37	2.08	2.24	0.076	0.276	0.128	0.355
谷草转氨酶AST	248.23^a	220.47^b	205.96^b	216.84^b	5.199	0.014	0.015	0.027
碱性磷酸酶ALP	4 676.43	4 436.34	4 221.76	4 354.77	67.617	0.101	0.048	0.137
42日龄42 days of age
谷丙转氨酶ALT	1.71	1.45	1.37	1.57	0.053	0.114	0.294	0.028
谷草转氨酶AST	210.88	179.89	176.71	187.86	5.452	0.100	0.143	0.042
碱性磷酸酶ALP	4 343.20^a	3 850.82^b	4 158.31^ab	4 209.20^a	64.033	0.031	0.874	0.034

2.3 百里香酚对肉鸡血清抗氧化和免疫指标的影响

由表5可知,21日龄时,饲粮百里香酚添加水平对肉鸡血清SOD、GSH-Px活性和IgA、IgG含量无显著影响(P>0.05);T2组和T3组血清MDA含量显著低于C组(P<0.05),T2组和T3组血清IgM含量显著高于C组(P<0.05)。42日龄时,饲粮百里香酚添加水平对肉鸡血清SOD活性和IgA、IgG含量无显著影响(P>0.05);T2组和T3组血清MDA含量显著低于C组(P<0.05),T2组血清GSH-Px活性和IgM含量均显著高于C组(P<0.05)。随着饲粮百里香酚添加水平的增加,21日龄时,血清MDA含量呈线性降低(P<0.05),血清IgA和IgM含量和GSH-Px活性均呈线性增加(P<0.05);42日龄时,血清MDA含量呈线性降低(P<0.05),血清IgG和IgM含量和SOD、GSH-Px活性均呈线性增加(P<0.05)。

表5 百里香酚对肉鸡血清抗氧化和免疫指标的影响

Table 5 Effects of thymol on serum antioxidant and immune indices of broilers

项目 Items	组别Groups				均值标准误 SEM	P值P-value
项目 Items	C	T1	T2	T3	均值标准误 SEM	方差分析 ANOVA	线性 Linear	二次 Quadratic
21日龄21 days of age
丙二醛MDA/(nmol/mL)	2.56^a	2.23^ab	1.70^b	1.47^b	0.157	0.039	0.003	0.846
超氧化物歧化酶SOD/(U/mL)	68.61	80.23	87.97	76.59	3.384	0.245	0.308	0.088
谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-Px/(U/mL)	691.86	697.68	725.54	745.32	8.506	0.078	0.009	0.475
免疫球蛋白A IgA/(μg/mL)	197.51	214.23	233.89	229.15	6.214	0.150	0.035	0.355
免疫球蛋白G IgG/(μg/mL)	878.68	889.04	1 001.53	932.96	27.105	0.388	0.267	0.479
免疫球蛋白M IgM/(μg/mL)	517.23^b	572.37^ab	608.56^a	616.08^a	14.388	0.044	0.006	0.331
42日龄42 days of age
丙二醛MDA/(nmol/mL)	3.15^a	2.76^ab	2.29^b	2.55^b	0.110	0.026	0.017	0.092
超氧化物歧化酶SOD/(U/mL)	103.57	120.26	140.30	134.17	6.062	0.136	0.035	0.312
谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-Px/(U/mL)	802.35^b	835.39^ab	953.01^a	919.91^ab	22.613	0.046	0.015	0.416
免疫球蛋白A IgA/(μg/mL)	316.05	323.79	355.19	341.32	6.243	0.102	0.052	0.363
免疫球蛋白G IgG/(μg/mL)	1 959.41	2 048.83	2 100.22	2 145.13	28.350	0.104	0.012	0.660
免疫球蛋白M IgM/(μg/mL)	743.33^b	788.83^ab	838.20^a	810.63^ab	12.729	0.043	0.023	0.107

2.4 百里香酚对肉鸡血清NDV抗体效价的影响

由表6可知,14和42日龄时,饲粮百里香酚添加水平对肉鸡血清NDV抗体效价无显著影响(P>0.05)。21日龄时,T1组、T2组和T3组血清NDV抗体效价显著高于C组(P<0.05)。随着饲粮百里香酚添加水平的增加,14、21日龄时,血清NDV抗体效价呈先增加后降低的二次变化(P<0.05)。

表6 百里香酚对肉鸡血清NDV抗体效价的影响

Table 6 Effects of thymol on serum of NDV antibody titer of broilers

项目 Items	组别Groups				均值标准误 SEM	P值P-value
项目 Items	C	T1	T2	T3	均值标准误 SEM	方差分析 ANOVA	线性 Linear	二次 Quadratic
14日龄14 days of age	2.25	2.75	2.53	2.29	0.093	0.186	0.910	0.046
21日龄21 days of age	4.06^b	5.46^a	5.42^a	4.98^a	0.169	0.002	0.071	0.001
42日龄42 days of age	6.11	6.94	7.29	7.03	0.188	0.129	0.062	0.122

2.5 百里香酚对肉鸡肠道组织形态的影响

由表7可知,21日龄时,饲粮百里香酚添加水平对肉鸡十二指肠、空肠和回肠绒毛高度、隐窝深度和V/C均无显著影响(P>0.05)。42日龄时,饲粮百里香酚添加水平对肉鸡十二指肠和回肠绒毛高度、隐窝深度和V/C均无显著影响(P>0.05),对肉鸡空肠隐窝深度和V/C均无显著影响(P>0.05);T2组和T3组空肠绒毛高度显著高于C组(P<0.05)。随着饲粮百里香酚添加水平的增加,21日龄时,十二指肠、空肠和回肠绒毛高度均呈线性增加(P<0.05);42日龄时,十二指肠、空肠和回肠绒毛高度和V/C均呈线性增加(P<0.05)。

表7 百里香酚对肉鸡肠道组织形态的影响

Table 7 Effects of thymol on intestinal tissue morphology of broilers

项目 Items		组别Groups				均值标准误 SEM	P值P-value
项目 Items		C	T1	T2	T3	均值标准误 SEM	方差分析 ANOVA	线性 Linear	二次 Quadratic
21日龄21 days of age
十二指肠 Duodenum	绒毛高度VH/μm	1 289.46	1 336.26	1 395.25	1 373.87	16.868	0.119	0.034	0.276
	隐窝深度CD/μm	134.35	131.19	133.28	137.33	2.238	0.832	0.595	0.445
	绒隐比V/C	9.62	10.22	10.50	10.04	0.148	0.195	0.254	0.066
空肠 Jejunum	绒毛高度VH/μm	853.04	907.60	970.04	954.21	18.166	0.085	0.020	0.283
	隐窝深度CD/μm	94.30	91.92	97.51	98.08	1.792	0.620	0.303	0.691
	绒隐比V/C	9.06	9.93	10.01	9.78	0.221	0.443	0.271	0.222
回肠 Ileum	绒毛高度VH/μm	543.85	580.69	596.29	619.49	12.052	0.152	0.020	0.758
	隐窝深度CD/μm	67.41	62.40	63.47	65.82	1.794	0.785	0.825	0.332
	绒隐比V/C	8.11	9.40	9.59	9.55	0.314	0.300	0.109	0.282
42日龄42 days of age
十二指肠 Duodenum	绒毛高度VH/μm	1 409.59	1 454.21	1 474.37	1 516.30	17.247	0.173	0.023	0.967
	隐窝深度CD/μm	151.37	149.28	137.25	145.23	2.925	0.354	0.278	0.502
	绒隐比V/C	9.34	9.86	10.77	10.47	0.218	0.077	0.026	0.411
空肠 Jejunum	绒毛高度VH/μm	968.33^b	1 049.64^ab	1 139.81^a	1 128.51^a	24.787	0.035	0.006	0.272
	隐窝深度CD/μm	118.64	112.63	116.94	120.64	2.218	0.656	0.616	0.296
	绒隐比V/C	8.20	9.38	9.78	9.37	0.225	0.057	0.047	0.050
回肠 Ileum	绒毛高度VH/μm	710.28	746.01	795.72	810.05	16.617	0.116	0.014	0.721
	隐窝深度CD/μm	87.62	81.47	80.71	82.28	2.513	0.791	0.471	0.464
	绒隐比V/C	8.24	9.24	9.95	9.91	0.263	0.060	0.011	0.254

2.6 百里香酚对肉鸡空肠抗氧化相关基因mRNA表达的影响

由表8可知,21日龄时,饲粮百里香酚添加水平对肉鸡空肠p62和Keap1的mRNA相对表达水平均无显著影响(P>0.05);T1组和T2组空肠Nrf2的mRNA相对表达水平显著高于C组(P<0.05)。42日龄时,饲粮百里香酚添加水平对肉鸡空肠p62和Nrf2的mRNA相对表达水平均无显著影响(P>0.05);T1组空肠Keap1的mRNA相对表达水平显著低于C组(P<0.05)。随着饲粮百里香酚添加水平的增加,21日龄时,空肠p62的mRNA相对表达水平呈线性升高(P<0.05),空肠Keap1的mRNA相对表达水平呈先降低后升高的二次变化(P<0.05);42日龄时,空肠p62和Nrf2的mRNA相对表达水平呈先升高后降低的二次变化(P<0.05),空肠Keap1的mRNA相对表达水平呈先降低后升高的二次变化(P<0.05)。

表8 百里香酚对肉鸡空肠抗氧化相关基因mRNA表达的影响

Table 8 Effects of thymol on mRNA expression of antioxidant related genes in jejunum of broilers

项目 Items	组别Groups				均值标准误 SEM	P值P-value
项目 Items	C	T1	T2	T3	均值标准误 SEM	方差分析 ANOVA	线性 Linear	二次 Quadratic
21日龄21 days of age
p62	1.00	1.20	1.19	1.31	0.043	0.052	0.010	0.604
Kelch样ECH相关蛋白1 Keap1	1.00	0.78	0.83	0.84	0.042	0.281	0.243	0.173
核因子E2相关因子2 Nrf2	1.00^b	1.45^a	1.32^a	1.28^ab	0.059	0.035	0.190	0.030
42日龄42 days of age
p62	1.00	1.07	1.20	1.05	0.028	0.059	0.234	0.047
Kelch样ECH相关蛋白1 Keap1	1.00^a	0.66^b	0.84^ab	0.91^ab	0.047	0.048	0.800	0.026
核因子E2相关因子2 Nrf2	1.00	1.31	1.42	1.26	0.065	0.107	0.127	0.049

3 讨论

3.1 百里香酚对肉鸡生长性能的影响

百里香酚具有抗菌、抗氧化等生物活性,可能通过增加食欲、提高营养物质利用率、调节肠道菌群、促进短链脂肪酸(SCFAs)的产生、加强肠道屏障的完整性以及调节机体免疫力等实现其促生长作用^[11-14]。目前,百里香酚在肉鸡饲粮中单独添加的报道较少。Liu等^[14]报道,饲粮中单独添加百里香酚(40 mg/kg)可以提高肉鸡1~21日龄的ADG。本研究发现,饲粮中添加百里香酚可以降低肉鸡F/G,且随着饲粮百里香酚添加水平的增加,肉鸡1~42日龄ADG呈线性增加,F/G呈线性降低,且在200 mg/kg百里香酚的添加水平下表现出较好的应用效果。也有百里香酚与其他植物提取物或有机酸等混合应用效果方面的报道。有研究发现,发现百里香酚与橙皮苷和迷迭香酸的混合补充剂可显著提高22~42日龄肉鸡的F/G,以及1~42日龄时的ADG和F/G^[14]。Li等^[15]研究发现,饲喂添加百里香酚和香芹酚混合物的饲粮可以显著提高42日龄肉鸡体重以及22~42日龄和1~42日龄的ADG。Jin等^[16]研究也发现,饲喂百里香酚和香芹酚混合补充剂可显著提高肉鸡体增重,并扭转产气荚膜梭菌攻毒引起的采食量下降。此外,Yang等^[17]研究发现,饲粮中添加山梨酸、富马酸和百里香酚的混合物可显著增加肉鸡肠道消化酶活性,提高42日龄肉鸡的饲料利用率。本研究也发现,饲粮中添加不同水平的百里香酚可提高肉鸡的生长性能,尤其是添加水平为200 mg/kg时提高了肉鸡1~21日龄和22~42日龄的末重,并降低了1~21日龄和1~42日龄的F/G。由此可见,百里香酚单独使用或者与其他植物提取物等混合使用均具有提高肉鸡生长性能的作用。

3.2 百里香酚对肉鸡血清生化指标的影响

血清生化指标是评估肉鸡健康和生理状态的关键参数。血清中ALT、AST和ALP的活性可指示肝脏功能正常与否。正常情况下,ALT和AST存在于肝脏、心脏等脏器细胞内,当细胞受损导致细胞膜通透性增加时,它们会溢到胞外进而使血液中二者活性升高^[18]。有研究发现,在蛋鸡饲粮中添加百里香酚(300 mg/kg)可显著降低胆固醇、尿素、肌酐含量及ALT、AST活性^[19]。此外,Madkour等^[20]利用热应激肉鸡模型研究牛至提取物(主要是百里香酚)对其肝脏功能和肾脏功能的影响,结果发现,牛至提取物可以降低热应激肉鸡血浆中ALT、AST活性和尿素、肌酐含量,减轻热应激对肉鸡造成的不利影响。在本研究中,肉鸡42日龄时血清ALT、AST和ALP活性随着饲粮百里香酚添加水平的增加呈现先降低后增加的二次变化,这与前人的研究结果一致。另有报道,迷迭香、香芹酮和柠檬烯等植物提取物可以通过其抗氧化和抗炎作用,降低肝脏酶活性,从而保护肝脏免受氧化应激损害^[4,20-22]。由此可见,百里香酚作为一种植物提取物,对肉鸡维持肝脏的正常功能具有积极作用。

3.3 百里香酚对肉鸡血清抗氧化指标的影响

氧化应激是由于过量的氧化剂引起体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态。正常情况下,机体的抗氧化系统包括酶类(SOD、GSH-Px等)和非酶类(维生素A、维生素E等)等共同清除过量的活性氧(ROS)和活性氮(RNS)等氧化剂,保护细胞免受氧化损伤。但是当ROS和RNS等氧化剂产生过多,超出机体的抗氧化能力时,会损伤DNA、脂质、蛋白质等生物分子,引发氧化应激、炎症反应,严重时损伤组织细胞^[23]。例如,机体发生氧化应激时可导致脂质过氧化,使其内源性标志物MDA的生成增加^[24]。有研究表明,在连续14 d每天限制活动2.5 h的条件下诱导的大鼠应激模型中,百里香酚可以增加应激大鼠的GSH-Px和SOD活性,降低MDA含量,抑制氧化应激和炎症反应^[6]。此外,Li等^[25]研究发现,百里香酚和香芹酚混合物可降低肉鸡胸肌中MDA含量,提高总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和总抗氧化能力(T-AOC),增强2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)自由基清除能力。本研究发现,随着饲粮百里香酚添加水平的增加,血清MDA含量呈线性降低,GSH-Px活性呈线性升高,在百里香酚添加水平为200和300 mg/kg时可降低肉鸡血清MDA含量,添加水平为200 mg/kg可提高血清GSH-Px和SOD活性,增强肉鸡抗氧化活性,与前人研究结果一致。线粒体具有最高水平的ROS氧化剂和抗氧化剂,是细胞中氧化还原状态的重要传感器和调节剂,线粒体功能障碍和电子泄露增加会增加ROS生成,较高的线粒体ROS生成与肉鸡的低饲料利用效率有关^[26]。百里香酚具有优异的还原能力及DPPH、超氧化物和羟基自由基清除活性,并能保护脂质免受氧化损伤,有助于维持线粒体中脂质过氧化水平,并通过清除ROS改善线粒体抗氧化防御系统^[4,24]。本研究中,百里香酚在提高肉鸡抗氧化反应的同时,提高了肉鸡饲料利用效率由此可见,百里香酚在提高肉鸡抗氧化能力和促生长方面具有明显的优势。

3.4 百里香酚对肉鸡血清免疫指标的影响

机体的免疫系统和氧化还原系统之间相互影响、相互作用,共同维护动物健康。免疫球蛋白是免疫活性分子的一类,分为膜免疫球蛋白和抗体。前者是B细胞膜上的抗原受体,能特异性识别抗原分子。后者主要存在与血清中,其主要功能是特异性结合抗原,直接发挥抗抗细菌、病毒、抗寄生虫感染等作用。IgG是血清中含量最高的一种免疫球蛋白,是机体感染或接种疫苗后产生的主要抗体类型。IgM是一种巨球蛋白,在机体感染早期产生的抗体,在感染早期发挥重要的抗感染作用。IgA的免疫作用与前2种相比,由于其含量较低,所以免疫作用较弱。Su等^[27]研究发现,饲粮中添加百里香酚和肉桂醛混合精油可以增加断奶仔猪血清、十二指肠和回肠黏膜以及胰腺谷胱甘肽(GSH)含量,增加空肠黏膜和脾脏T-SOD活性,并降低血清、空肠黏膜和胰腺MDA含量,提高仔猪血清IgG和IgA含量,减少了仔猪断奶应激,提高了断奶仔猪的免疫力。本研究发现,饲粮中添加200 mg/kg百里香酚可以显著增加肉鸡21和42日龄血清IgM含量,与前人研究结果一致。为了评价百里香酚对肉鸡特异性体液免疫的影响,本研究检测了特定时间点的血清NDV抗体效价,结果发现,饲粮中添加百里香酚可以提高肉鸡血清NDV抗体效价,其中以200 mg/kg的百里香酚添加水平时效果较好。与此类似的研究结果表明,饲粮中添加百里香酚可提高肉鸡^[28]和蛋鸡^[19]血清NDV抗体效价,且后者还发现百里香酚提高了鸡群的细胞免疫力。由此可见,百里香酚能够提高肉鸡的特异性免疫力,提高鸡群的抗病能力。然而,关于百里香酚影响免疫功能的确切机制尚不明确,有研究表明,百里香酚可能通过延长维生素C活性发挥抗氧化作用,并增强免疫功能^[29]。也有研究推测,百里香酚可能充当Fc受体的附加配体,与IgG结合并刺激免疫反应^[30]。因此,百里香酚影响肉鸡特异性免疫的确切机制尚需进一步研究。

3.5 百里香酚对肉鸡肠道组织形态的影响

肠道发育对畜禽生长性能和肠道健康至关重要。肠道绒毛高度决定了肠道营养吸收面积,隐窝深度决定了肠绒毛分裂生成上皮细胞的速度,绒毛高度越高,隐窝深度越浅,即V/C越大,表明细胞成熟率越高,分泌功能越强,肠道消化吸收能力也越强。绒毛高度和V/C是小肠吸收能力的指标,二者的改善通常伴随着动物生长性能的提高。当毒素等因素引起肠道感染时可能会损害绒毛高度,导致隐窝深度增加,进而引起组织周转率的加快,由于组织更新过程需要更多的能量和蛋白质,所以导致饲料转化率的降低^[3,30]。有研究发现,饲粮中添加150 mg/kg阿育魏果精油(AEO)(含41%百里香酚)后肉鸡空肠的绒毛高度增加,添加300 mg/kg AEO后肉鸡空肠的V/C增加^[31]。Li等^[15]研究发现,饲粮中添加百里香酚和香芹酚混合补充剂(二者均为15 mg/kg)显著增加了肉鸡21和42日龄的空肠绒毛高度,并显著降低了21日龄的回肠隐窝深度,同时还发现添加百里香酚提高了十二指肠和回肠中淀粉酶和脂肪酶活性。然而Liu等^[14]研究发现,在肉鸡饲粮中添加40 mg/kg百里香酚对绒毛高度、隐窝深度和V/C没有积极的影响,但将其与橙皮苷(40 mg/kg)和迷迭香酸(20 mg/kg)混合添加时增加了回肠绒毛高度、V/C,降低了隐窝深度。这种对肠道组织形态发育影响的差异可能是由于百里香酚单独添加时浓度较低,或者是百里香酚与其他精油混合使用时功效增强所致。在本研究中,饲粮中添加百里香酚对小肠的组织形态和完整性均有积极影响,添加200和300 mg/kg百里香酚时显著增加了肉鸡42日龄空肠绒毛高度,与前人的研究结果一致。另有研究发现,仔猪的生长性能分别与绒毛高度和小肠黏膜消化酶活性呈正相关^[32]。由此可见,百里香酚在改善小肠组织形态发育时,也可能会增加肠道黏膜消化酶活性,从而促进小肠对营养物质的吸收。因此,笔者推测百里香酚的抗氧化活性能够抵抗消化过程中产生的氧自由基对肠黏膜的损伤,诱导绒毛高度的增加,改善V/C,从而改善肠道健康,提高肉鸡的生长性能。

3.6 百里香酚对肉鸡空肠抗氧化相关基因mRNA表达的影响

p62-Nrf2-Keap1信号通路作为机体重要的内源性抗氧化信号通路,在调控抗氧化酶活性中发挥重要作用。Nrf2作为下游抗氧化酶的中枢调节剂,与SOD和GSH-Px的激活密切相关,在细胞抗氧化应答中扮演核心角色。Keap1是Nrf2的负调控蛋白,在正常生理条件下,Keap1与Nrf2形成复合物,通过促进Nrf2降解以抑制其转录活性。氧化应激时,p62作为一种适配蛋白与Keap1和Nrf2相互作用,通过封存Keap1,阻止Keap1调控Nrf2的降解,从而使Nrf2积聚并转移到细胞核,与启动子中的抗氧化反应元件(ARE)结合,激活抗氧化基因的表达^[33],最终对抗氧化应激,增强细胞防御机制,维持细胞平衡。由此可见,p62-Nrf2-Keap1信号通路在保护机体免受氧化损伤中具有重要作用。已有研究发现,植物化学物质能够激活Nrf2级联反应,通过调节抗氧化防御酶和解毒酶最大限度减少氧化应激,增强机体抗炎、抗癌等作用^[34]。Liu等^[35]研究发现,补充单宁酸可以激活p62-Nrf2-Keap1信号通路,显著降低大肠杆菌诱导的猪肠上皮细胞Keap1基因的表达,增加p62和Nrf2基因的表达,并且提高抗氧化酶活性,减少氧化产物。然而,百里香酚对p62-Nrf2-Keap1信号通路是否有影响尚不清楚,为了进一步探讨百里香酚提高肉鸡抗氧化防御能力的潜在机制,本研究检测了空肠p62、Nrf2和Keap1的mRNA相对表达水平,结果显示,饲粮中添加百里香酚可以降低肉鸡空肠中Keap1的mRNA相对表达水平,增加空肠p62和Nrf2的mRNA相对表达水平。因此,结合本研究中百里香酚对血清抗氧化指标GSH-Px和SOD活性的正向调控作用,笔者推测百里香酚可能具有促进Keap1与Nrf2的解离,有利于p62与Keap1的结合,从而促进Nrf2进入细胞核,提高抗氧化酶的表达,最终发挥百里香酚的抗氧化作用。

4 结论

① 饲粮中添加百里香酚可以提高肉鸡抗氧化能力和免疫功能,改善肠道形态,从而提高生长性能。

② 百里香酚可能通过激活p62-Nrf2-Keap1信号通路提高肉鸡的抗氧化能力,改善肠道形态,以利于营养物质吸收,促进肉鸡生长。

③ 本试验条件下,饲粮中百里香酚添加水平为200 mg/kg时饲喂效果最佳。

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