Chinese Journal of Animal Nutrition >

2025 , Vol. 37 >Issue 8: 5198 - 5213

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.423

RESEARCH PAPER

Bone-Protective Effects and Mechanisms of Dietary Supplementation with Epimedium Extract in Laying Hens during Late Laying Period

  • LIU Yaqing , 1, 2 ,
  • XU Jianfang 2 ,
  • ZHANG Huiyan 2 ,
  • ZHAO Qingyu 2 ,
  • TANG Chaohua 2 ,
  • ZHANG Junmin 2 ,
  • DONG Huansheng , 1, * ,
  • SI Wei , 2, *
Expand
  • 1 College of Animal Science and Technology, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China
  • 2 State Key Laboratory of Animal Nutrition and Feeding, Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China
*DONG Huansheng, professor, E-mail: ;
SI Wei, professor, E-mail:

Received date: 2024-12-04

  Online published: 2025-08-14

Fold

Abstract

This experiment aimed to investigate the bone-protective effect and mechanism of Epimedium extract in laying hens during late laying period. A total of 180 healthy 60-week-old Hy-Line Brown laying hens with similar egg production rates were selected and randomly divided into 2 groups, each containing 6 replicates of 15 hens. The pre-feeding period lasted one week, while the trial period lasted 15 weeks. The control group was fed a basal diet, whereas the Epimedium extract group was fed the basal diet supplemented with 200 mg/kg Epimedium extract. The results showed that: compared with the control group, 1) the hens in the Epimedium extract group significantly increased the laying rate at 62 to 65 weeks of age (P<0.05) and significantly decreased the feed-to-egg ratio at 66 to 69 weeks of age and 70 to 76 weeks of age (P<0.05); 2) at 76 weeks of age, the eggs in the Epimedium extract group exhibited a tendency to increase eggshell thickness (P=0.097) and significantly increased albumen height and Haugh unit at 69 and 76 weeks of age (P<0.05); 3) at 76 weeks of age, the hens in the Epimedium extract group significantly decreased the serum osteocalcin (BGP) content and tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP) activity (P<0.05); 4) at 69 weeks of age, the hens in the Epimedium extract group significantly increased the femur index (P<0.05); 5) at 76 weeks of age, the hens in the Epimedium extract group tended to increase tibia strength (P=0.085); 6) at 76 weeks of age, the hens in the Epimedium extract group significantly increased femur bone mineral density and bone mineral content (P<0.05); 7) at 76 weeks of age, the addition of 200 mg/kg Epimedium extract to the diet improved the microstructure of bone tissue; 8) the addition of 200 mg/kg Epimedium extract to the diet up-regulated the relative mRNA expression of osteoprotegerin (OPG), runt-related transcription factor 2 (RUNX2), bone morphogenetic protein 2 (BMP2) and SMAD family member 4 (Smad4) in the bone tissue (P<0.05). Overall, these results indicate that the dietary supplementation with 200 mg/kg Epimedium extract increases the laying rate during the late laying period, reduces the feed-to-egg ratio, enhances egg quality by increasing albumen height and Haugh unit, decreases bone turnover, promotes osteoblast differentiation, improves bone density and bone microstructure, and exerts a protective effect on bones.

Key words： Epimedium extract; laying hens during late laying period; osteoporosis; bone health

Cite this article

LIU Yaqing , XU Jianfang , ZHANG Huiyan , ZHAO Qingyu , TANG Chaohua , ZHANG Junmin , DONG Huansheng , SI Wei . Bone-Protective Effects and Mechanisms of Dietary Supplementation with Epimedium Extract in Laying Hens during Late Laying Period[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2025 , 37(8) : 5198 -5213 . DOI: 10.12418/CJAN2025.423

骨质疏松症是一种骨代谢疾病,其特点为骨量减少,骨强度降低,骨折的风险增加[1]。在蛋鸡养殖过程中骨质疏松症的发病率较高,很大一部分原因与其骨骼的特殊性有关。蛋鸡具有3种类型的骨骼:皮质骨、松质骨和髓质骨。皮质骨是一种致密的结构性骨;松质骨即小梁骨,是位于骨骼末端的网格状蜂窝结构;髓质骨是位于骨髓腔中的高度不稳定的编织骨,可以在产蛋周期中快速形成和吸收[2-3]。正常情况下,破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成处于动态平衡过程中,然而蛋鸡每天要面临着高强度的产蛋压力,骨转换较为活跃。随着时间的积累,破骨细胞介导的骨吸收大于成骨细胞介导的骨形成,髓质骨所释放的骨钙无法满足蛋鸡产蛋需要,结构性骨逐渐被吸收,骨质逐渐流失,容易造成骨质疏松[4-5]。患骨质疏松症的蛋鸡骨骼脆性增加,容易发生骨折,继而导致患病蛋鸡持续性疼痛和体型消瘦,严重影响动物福利[6]。在养殖过程中,产蛋鸡常突然瘫痪,马健[7]在2006年1月到2008年12月共调查苏中蛋鸡养殖密集区域的8 622批产蛋鸡,发现11.65%的笼养蛋鸡瘫痪是由骨质疏松造成的。患骨质疏松症的蛋鸡还会出现产蛋率下降、鸡蛋品质变差、薄壳蛋和软壳蛋增多以及鸡蛋的破损率上升等问题[8]。严重时该疾病甚至可能导致蛋鸡死亡。Mccoy等[9]研究发现,在整个产蛋周期中,蛋鸡的死亡率为9.7%,其中35%的死亡病例与骨质疏松直接相关。以山东省为例,有研究表明,2008—2022年,山东省大、中、小3种规模的蛋鸡养殖平均净利润分别为840.2、881.2、499.1元/百只,目前虽无直接数据表明蛋鸡骨质疏松症造成的综合经济损失占养殖总成本的具体比例,但根据上述发病率、死亡率及产蛋量下降等综合来看,其对养殖产业的经济损失影响巨大[10-11]。因此,如何改善蛋鸡骨骼健康这一问题引起了越来越多人的关注。
如今防治骨质疏松的饲料添加剂主要包括钙制剂(如碳酸钙、磷酸钙)、维生素D3以及有机微量元素(如蛋氨酸锌、蛋氨酸锰)等,这些添加剂通过调节钙磷代谢、促进骨形成或抑制骨吸收等机制改善蛋鸡骨骼健康[12-15]。然而,现有饲料添加剂仍存在一些不足:首先,随着蛋鸡年龄的增长,钙和维生素D3的吸收利用率较低[4],长期使用易导致钙磷比例失衡;另外,维生素D3的不足或过量,都会导致骨骼受损,骨吸收腔增多,对防治骨质疏松起到相反的作用[16];其次,有机微量元素的长期或过度补充会对动物机体多个系统造成不良甚至毒性影响。有研究发现,过量补充蛋氨酸锌会对蛋鸡产蛋性能产生不利影响,扰乱肝肾功能,并且还会导致蛋鸡内脏器官的组织学病变[17]。因此,亟需开发高效、安全且经济的新型抗骨质疏松饲料添加剂,以弥补现有方案的不足。近年来,关于淫羊藿提取物在动物骨质疏松防治领域的研究取得了显著进展。传统中药淫羊藿已被证明具有改善骨质疏松的作用,同时还具有抗肿瘤、抗炎和抗氧化的作用[18]。研究表明,从淫羊藿叶中分离制备的淫羊藿黄酮类化合物可改善卵巢切除大鼠的骨强度,提高骨密度和骨组织微观结构,从而减轻骨质疏松程度[19]。此外,淫羊藿骨碎补联合骨营养补剂对去卵巢大鼠的研究结果显示,该联合治疗方案能显著增加骨密度和骨钙含量,进一步增强抗骨质疏松效果[20]。淫羊藿提取物的总类黄酮能够通过抑制卵巢切除小鼠的尿钙排泄,从而有效抑制远端股骨骨量减少和骨强度下降[21]。在其他动物模型中,淫羊藿活性成分也展现出良好的骨保护作用。例如,朝藿定A和宝藿苷Ⅰ在斑马鱼骨质疏松模型中可显著改善骨矿化状况,表明其具有显著的抗骨质疏松的作用[22]。淫羊藿主要活性成分淫羊藿苷及其他活性成分(淫羊藿素、朝藿定C、宝藿苷Ⅰ)可通过促进成骨细胞增殖与分化、抑制破骨细胞形成,在分子水平上调控骨形态发生蛋白(BMP)、细胞外信号调节激酶(ERK)、氨基末端激酶(JNK)等信号通路,并通过调控骨硬化蛋白(SOST)基因表达,发挥骨保护作用[23-28]。此外,研究还发现,淫羊藿苷能够通过激活自噬,对骨髓中的衰老巨噬细胞发挥显著的抗炎作用,并恢复骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨活性,从而减轻骨质疏松小鼠的骨质流失[29]。尽管在啮齿类动物模型和斑马鱼模型中,淫羊藿及其活性成分已展现出良好的抗骨质疏松作用,但目前关于淫羊藿提取物在家禽,特别是蛋鸡骨质疏松防治中的研究仍较少。因此,进一步探索其在蛋鸡骨骼健康中的作用机制具有良好的研究前景和现实意义。本研究旨在通过淫羊藿提取物饲喂产蛋后期蛋鸡,研究其对产蛋后期蛋鸡的骨保护作用及其机制,为开发安全、高效的抗骨质疏松饲料添加剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪(HPLC)(美国Agilent Technologies);547-360厚度仪(日本Mitutoyo);EFR-01蛋壳强度测试仪(以色列ORKA);EA-01鸡蛋全功能测定仪(以色列ORKA);Prodigy Advance双能X线骨密度检测仪(美国GE Healthcare);TA-XT plus质构仪(英国Stable Micro Systems);HDP/3PB质构仪探头(英国Stable Micro Systems);Applied Biosystems QuantStudio 7 Flex实时荧光定量PCR仪(美国Thermo Fisher Scientific);Bio-Drop-μLite超微量核酸/蛋白分析仪(英国Biochrom);Tecan Infinite 200 Pro多功能酶标仪(瑞士Tecan)。

1.2 试验设计

所有试验程序均经过中国农业科学院北京畜牧兽医研究所(IAS)实验动物福利和伦理委员会的审查和批准(批准号:IAS2023-116)。
试验在北京绿都兴瑞养殖专业合作社进行。选取60周龄产蛋率相近的海兰褐蛋鸡180只,随机分为2组,每组6个重复,每个重复15只鸡。对照组饲喂基础饲粮,淫羊藿提取物组在基础饲粮中添加200 mg/kg淫羊藿提取物。预试期1周,正试期15周。基础饲粮参考NRC(1994)[30],结合《海兰褐蛋鸡饲养手册》配制,其组成及营养水平见表1。采用GB/T 6432—2018[31]中的方法检测饲粮中粗蛋白质的含量。采用GB/T 6436—2018[32]中的方法检测饲粮中钙的含量。根据GB/T 6437—2018[33]中的方法检测饲粮中总磷的含量。饲粮中其他成分参照《中国饲料成分及营养价值表(2019年第30版)》[34]计算。
表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

项目Items 含量Content
原料Ingredients
玉米Corn 62.00
豆粕Soybean meal 23.00
小麦麸Wheat bran 3.70
石粉Limestone 9.50
磷酸氢钙CaHPO4 0.80
DL-蛋氨酸DL-Met 0.20
沸石粉Zeolite powder 0.11
食盐NaCl 0.30
预混料Premix1) 0.39
合计Total 100.00
营养水平Nutrient levels2)
代谢能ME/(MJ/kg) 10.98
粗蛋白质CP 14.73
钙Ca 4.07
总磷TP 0.51
有效磷AP 0.21
赖氨酸Lys 0.79
蛋氨酸Met 0.45
蛋氨酸+胱氨酸Met+Cys 0.71
色氨酸Trp 0.17
苏氨酸Thr 0.59

1)预混料为每千克饲粮提供The premix provided the following per kg of the diet:VA 8 000 IU,VB1 1.05 mg,VB2 8.52 mg,VB6 8.07 mg,VB12 3 mg,VD3 450 IU,VE 15 IU,VC 99 mg,泛酸钙 calcium pantothenate 50.18 mg,生物素 biotin 1.95 mg,叶酸 folic acid 0.50 mg,烟酸 nicotinic acid 29.70 mg,植酸酶 phytase 100 mg,氯化胆碱 choline chloride (50%) 1 000 mg,Cu (as copper sulfate) 8.03 mg,Fe (as ferrous sulfate) 60 mg,Mn (as manganese sulfate) 65.03 mg,Zn (as zinc sulfate) 66.10 mg,I (as potassium iodide) 1.09 mg,Se (as sodium selenite) 0.31 mg。
2)粗蛋白质、钙和总磷为实测值,其余营养水平均为计算值。CP, Ca and TP were measured values, while the other nutrient levels were calculated values.

将淫羊藿提取物溶于70%甲醇中,利用HPLC进行分析。标准品及淫羊藿提取物溶液HPLC色谱图见图1,9种标准品(纯度≥98%)均购自上海源叶生物科技有限公司。淫羊藿提取物活性成分及含量见表2,其中淫羊藿苷的含量最高,为200.811 mg/g,占总量的20.081%。其他成分分别为朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、宝藿苷Ⅰ及淫羊藿素。
图1 100 μg/mL标准品HPLC色谱图(A)与淫羊藿提取物溶液HPLC色谱图(B)

Sig:信号 signal; Ref:参考 reference;1:朝藿定A epimedin A;2:朝藿定B epimedin B;3:朝藿定C epimedin C;4:淫羊藿苷 icariin;5:箭藿苷A sagittatoside A;6:箭藿苷B sagittatoside B;7:鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ 2'-O-rhamnosylicariside Ⅱ;8:宝藿苷Ⅰ baohuoside Ⅰ;9:淫羊藿素 icaritin。

Fig.1 HPLC chromatograms of 100 μg/mL standard (A) and Epimedium extract solution (B)

表2 淫羊藿提取物活性成分及含量

Table 2 Active components and contents of Epimedium extracts mg/g

项目Items 含量Content
朝藿定A Epimedin A 26.612
朝藿定B Epimedin B 58.620
朝藿定C Epimedin C 101.313
淫羊藿苷Icariin 200.811
箭藿苷A Sagittatoside A 3.942
箭藿苷B Sagittatoside B 5.412
鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ
2'-O-rhamnosylicariside Ⅱ		 11.465
宝藿苷Ⅰ Baohuoside Ⅰ 19.711
淫羊藿素Icaritin 8.259

1.3 饲养管理

在试验期间每天06:00、11:00和15:00各饲喂1次,蛋鸡自由采食和饮水。舍内通风良好,卫生清洁,光照充足。每天鸡舍保持光照16 h(05:00—21:00)。鸡舍温度维持在22~24 ℃。

1.4 指标测定与方法

1.4.1 生产性能测定

每天14:00定时捡蛋,记录每个重复蛋鸡的产蛋数、蛋重及破蛋数,用于计算产蛋率、平均蛋重及破蛋率。每2周记录各重复蛋鸡的饲粮消耗量,用于计算平均日采食量及料蛋比。

1.4.2 蛋品质测定

分别在蛋鸡65、69和76周龄时,每个重复随机选择3枚鸡蛋用于蛋品质检测。用鸡蛋全功能测定仪测定蛋白高度和哈氏单位;用厚度仪测定鸡蛋钝端、中端和锐端3个部位的蛋壳厚度,取平均值;用蛋壳强度测试仪测定蛋壳强度。用电子秤测定蛋壳重量。用游标卡尺测量鸡蛋的长径及短径,计算蛋形指数;用电子秤测定蛋黄重量和蛋重量,计算蛋黄比例。

1.4.3 血清骨代谢相关指标测定

分别在蛋鸡65、69和76周龄时,每组每个重复随机选取1只鸡进行翅静脉采血,室温静置2 h后在4 ℃、1 000×g条件下离心10 min收集血清,分装后于-80 ℃冰箱保存。根据试剂盒内说明书提供的方法检测血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙素(BGP)含量。TRAP和ALP活性试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司,BGP含量试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

1.4.4 股骨和胫骨骨指数测定

分别在蛋鸡65、69和76周龄时,将采血后的蛋鸡进行称重、屠宰,用手术刀和手术剪分离蛋鸡胫骨和股骨,去除骨表面附着的肌肉和筋膜。使用电子秤测定股骨和胫骨的重量,使用游标卡尺测量股骨和胫骨的长度,并计算骨指数。随后将胫骨和股骨分别用锡箔纸包裹后放入液氮中速冻,采样结束后转移至-80 ℃冰箱内保存备用。

骨指数=骨重(g)/活体重(kg)。

1.4.5 骨强度测定

质构仪使用前先进行力量矫正和高度矫正,在骨中间位置做标记,使质构仪探头准确在骨骼中间位置施加压力,利用三点弯曲装置检测蛋鸡骨骼强度。股骨:测试速度为15 mm/min,跨距为40 mm。胫骨:测试速度为50 mm/min,跨距为60 mm。

1.4.6 股骨骨密度及骨矿物质含量测定

通过双能X线骨密度检测仪进行扫描检测骨密度及骨矿物质含量。仪器的检测灵敏度为0.001 g/cm2,开机精度质量控制的变异系数(CV)值小于1%,金属铝体模型值在预设值范围内[(1.247±0.020) g/cm2]。

1.4.7 骨组织微观结构观察

蛋鸡76周龄时采集股骨置于4%多聚甲醛中固定。固定结束后,放入乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙液中脱钙,当脱钙后的组织用针刺没有阻力感时即可终止脱钙。然后对组织进行常规脱水、包埋、制成切片并对组织进行Goldner三色染色(试剂购自北京索莱宝科技有限公司),于光学显微镜下观察并拍照。

1.4.8 蛋鸡骨相关基因表达测定

蛋鸡76周龄时采集胫骨,取1小块胫骨用灭菌研钵研磨,用TRIzol(赛默飞世尔科技公司)试剂提取组织总RNA。检测RNA的纯度、浓度及完整性,确保RNA符合使用标准,然后使用PerfectStart Uni RT & qPCR Kit试剂盒(北京全式金生物技术股份有限公司)对RNA进行反转录。以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参基因,进行实时荧光定量PCR检测。反应体系为10 μL,其中cDNA为0.2 μL,上、下游引物各0.2 μL,2×PerfectStart Green qPCR SuperMix 5 μL,Universal Psaaive Reference Dye(50×) 0.2 μL,Nuclease-free Water 4.2 μL。采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA相对表达量。实时荧光定量PCR引物见表3。
表3 实时荧光定量PCR引物

Table 3 Primers for RT-qPCR

基因
Genes		 登录号
Accession No.		 引物序列
Primer sequences (5'—3')
β-肌动蛋白
β-actin		 NM_205518.1 F: CACGATCATGTTTGAGACCTT
R: CATCACAATACCAGTGGTACG
Runt相关转录因子2
Runx2		 NM_204128.2 F: GATTACAGACCCCAGGCAGG
R: TGGCTCAAGTAGGACGGGTA
骨保护素
OPG		 NM_001033641.2 F: GTTCCTACTCGTTTCACACC
R: GCTCTTGTGAACTGTGCCTTTG
骨形态发生蛋白2
BMP2		 NM_001398170.1 F: TCAGCTCAGGCCGTTGTTAG
R: GTCATTCCACCCCACGTCAT
骨形态发生蛋白4
BMP4		 NM_205237.4 F: AGTGATGAAGCCGCTGTCG
R: GCCCTGATGAGTCTGTGCC
核因子-κB受体活化因子配体
RANKL		 NM_001083361.1 F: CACGATCATGTTTGAGACCTT
R: CATCACAATACCAGTGGTACG
SMAD家族成员4
Smad4		 XM_040652581.2 F: CGCAGTGTTCGTGCAGAGTT
R: GCCGCAGGTCAAACACCTTA

1.5 数据统计分析

试验数据采用SPSS 27.0进行统计分析,采用独立样本t检验分析对照组和淫羊藿提取物组数据的显著性。试验结果用平均值±均值标准误表示,P<0.05表示差异显著,0.05≤P<0.10表示有显著趋势。

2 结果

2.1 淫羊藿提取物对产蛋后期蛋鸡生产性能的影响

由表4可知,在62~65周龄时,淫羊藿提取物组产蛋率显著高于对照组(P<0.05);在66~69周龄时,与对照组相比,淫羊藿提取物组产蛋率具有增加的趋势(P=0.090);在70~76周龄时,淫羊藿提取物组与对照组相比产蛋率没有显著差异(P>0.05)。在62~65周龄时,淫羊藿提取物组与对照组相比破蛋率没有显著差异(P>0.05);在66~69周龄和70~76周龄时,淫羊藿提取物组破蛋率相比于对照组有降低的趋势(P=0.073)。在62~65周龄时,与对照组相比,淫羊藿提取物组料蛋比有降低的趋势(P=0.092);在66~69周龄和70~76周龄时,淫羊藿提取物组料蛋比均显著低于对照组(P<0.05)。2组间平均蛋重和平均日采食量各阶段相比都没有显著差异(P>0.05)。
表4 淫羊藿提取物对产蛋后期蛋鸡生产性能的影响

Table 4 Effects of Epimedium extract on performance of laying hens during late laying period

项目
Items		 对照组
Control group		 淫羊藿提取物组
Epimedium extract group		 P值
P-value
产蛋率Laying rate/%
62~65周龄62 to 65 weeks of age 92.147±1.107b 95.166±0.501a 0.032
66~69周龄66 to 69 weeks of age 88.342±2.134 92.997±1.061 0.090
70~76周龄70 to 76 weeks of age 87.918±1.989 91.717±0.837 0.118
平均蛋重Average egg weight/g
62~65周龄62 to 65 weeks of age 63.698±0.611 65.029±0.466 0.114
66~69周龄66 to 69 weeks of age 64.217±0.614 65.081±0.640 0.353
70~76周龄70 to 76 weeks of age 64.670±0.852 65.828±0.403 0.247
破蛋率Egg breaking rate/%
62~65周龄62 to 65 weeks of age 2.001±0.348 1.465±0.094 0.162
66~69周龄66 to 69 weeks of age 3.050±0.494 1.914±0.365 0.094
70~76周龄70 to 76 weeks of age 3.596±0.528 2.027±0.578 0.073
平均日采食量ADFI/g
62~65周龄62 to 65 weeks of age 132.888±1.334 135.044±2.058 0.400
66~69周龄66 to 69 weeks of age 131.156±1.441 128.674±1.086 0.199
70~76周龄70 to 76 weeks of age 135.067±2.056 131.639±1.039 0.178
料蛋比Feed/egg
62~65周龄62 to 65 weeks of age 2.266±0.028 2.183±0.034 0.092
66~69周龄66 to 69 weeks of age 2.317±0.041a 2.159±0.026b 0.009
70~76周龄70 to 76 weeks of age 2.345±0.039a 2.226±0.015b 0.016

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 淫羊藿提取物对产蛋后期蛋鸡蛋品质的影响

由表5可知,在65和69周龄时,对照组与淫羊藿提取物组相比蛋壳厚度没有显著差异(P>0.05);在76周龄时,与对照组相比,淫羊藿提取物组蛋壳厚度有增加的趋势(P=0.097)。在65周龄时,2组之间蛋白高度和哈氏单位均没有显著差异(P>0.05);在69和76周龄时,与对照组相比,淫羊藿提取物组蛋白高度及哈氏单位显著高于对照组(P<0.05)。2组间蛋壳强度、蛋壳重量、蛋形指数和蛋黄比例在各阶段均没有显著差异(P>0.05)。
表5 淫羊藿提取物对产蛋后期蛋鸡蛋品质的影响

Table 5 Effects of Epimedium extract on egg quality of laying hens during late laying period

项目
Items		 对照组
Control group		 淫羊藿提取物组
Epimedium extract group		 P值
P-value
蛋壳厚度Eggshell thickness/mm
65周龄65 weeks of age 0.369±0.005 0.375±0.005 0.470
69周龄69 weeks of age 0.398±0.019 0.404±0.013 0.265
76周龄76 weeks of age 0.365±0.005 0.377±0.005 0.097
蛋壳强度Eggshell strength/N
65周龄65 weeks of age 37.220±1.831 37.561±0.987 0.871
69周龄69 weeks of age 35.794±1.500 36.046±0.814 0.883
76周龄76 weeks of age 35.766±1.200 35.998±1.468 0.903
蛋壳重量Eggshell weight/g
65周龄65 weeks of age 5.981±0.100 6.097±0.111 0.442
69周龄69 weeks of age 5.803±0.117 5.875±0.083 0.619
76周龄76 weeks of age 5.773±0.091 5.961±0.100 0.173
蛋白高度Albumen height/mm
65周龄65 weeks of age 6.750±0.252 6.772±0.235 0.949
69周龄69 weeks of age 5.828±0.220b 6.450±0.209a 0.048
76周龄76 weeks of age 5.934±0.203b 6.556±0.172a 0.026
哈氏单位Haugh unit
65周龄65 weeks of age 81.089±1.779 80.889±1.422 0.931
69周龄69 weeks of age 74.975±1.522b 79.389±1.188a 0.029
76周龄76 weeks of age 75.369±1.037b 78.883±0.909a 0.016
蛋形指数Egg shape index
65周龄65 weeks of age 1.321±0.012 1.310±0.010 0.500
69周龄69 weeks of age 1.305±0.010 1.304±0.013 0.944
76周龄76 weeks of age 1.329±0.009 1.313±0.009 0.201
蛋黄比例Egg yolk ratio/%
65周龄65 weeks of age 25.949±0.464 25.895±0.450 0.933
69周龄69 weeks of age 28.768±0.380 28.285±0.481 0.437
76周龄76 weeks of age 28.106±0.508 28.454±0.842 0.706

2.3 淫羊藿提取物对产蛋后期蛋鸡血清骨相关指标的影响

由表6可知,与对照组相比,淫羊藿提取物组血清BGP含量和TRAP活性在65周龄时没有显著差异(P>0.05),在69周龄时血清BGP含量(P=0.075)和TRAP活性(P=0.094)均呈现降低的趋势,在76周龄时血清BGP含量和TRAP活性显著降低(P<0.05)。在各试验阶段,各组间血清ALP活性没有显著差异(P>0.05)。
表6 淫羊藿提取物对产蛋后期蛋鸡血清骨相关指标的影响

Table 6 Effects of Epimedium extract on serum bone-related indexes of laying hens during late laying period

项目
Items		 对照组
Control group		 淫羊藿提取物组
Epimedium extract group		 P值
P-value
骨钙素BGP/(ng/mL)
65周龄65 weeks of age 0.387±0.065 0.305±0.036 0.297
69周龄69 weeks of age 0.361±0.033 0.268±0.033 0.075
76周龄76 weeks of age 0.626±0.079a 0.429±0.037b 0.048
抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP/(U/mL)
65周龄65 weeks of age 5.225±0.464 5.213±0.980 0.992
69周龄69 weeks of age 5.510±0.480 4.357±0.400 0.094
76周龄76 weeks of age 7.330±1.134a 4.101±0.798b 0.042
碱性磷酸酶ALP/(U/L)
65周龄65 weeks of age 202.366±31.287 289.587±40.308 0.118
69周龄69 weeks of age 147.280±22.383 167.937±19.804 0.505
76周龄76 weeks of age 150.642±26.740 121.027±18.196 0.381

2.4 淫羊藿提取物对产蛋后期蛋鸡骨指数的影响

由表7可知,与对照组相比,饲粮中添加200 mg/kg的淫羊藿提取物显著提高了69周龄时的股骨指数(P<0.05);在整个试验阶段,饲粮中添加200 mg/kg的淫羊藿提取物对蛋鸡股骨长度、股骨重、胫骨长度、胫骨重和胫骨指数均没有显著影响(P>0.05)。
表7 淫羊藿提取物对产蛋后期蛋鸡骨指数的影响

Table 7 Effects of Epimedium extract on bone indexes of laying hens during late laying period

项目
Items		 对照组
Control group		 淫羊藿提取物组
Epimedium extract group		 P值
P-value
股骨长度Femur length/mm
65周龄65 weeks of age 85.715±1.328 85.782±1.048 0.969
69周龄69 weeks of age 86.020±0.777 86.398±0.922 0.760
76周龄76 weeks of age 84.123±0.607 86.542±1.613 0.631
股骨重Femur weight/g
65周龄65 weeks of age 11.217±0.712 11.748±0.457 0.544
69周龄69 weeks of age 10.617±0.182 11.283±0.351 0.122
76周龄76 weeks of age 11.330±0.427 11.688±0.663 0.659
股骨指数Femur index/(g/kg)
65周龄65 weeks of age 5.522±0.331 5.651±0.272 0.768
69周龄69 weeks of age 4.709±0.205b 5.304±0.116a 0.030
76周龄76 weeks of age 5.716±0.167 5.944±0.290 0.512
胫骨长度Tibia length/mm
65周龄65 weeks of age 117.230±2.483 116.965±0.971 0.923
69周龄69 weeks of age 117.937±0.882 117.702±0.425 0.815
76周龄76 weeks of age 116.880±1.129 117.348±1.680 0.822
胫骨重Tibia weight/g
65周龄65 weeks of age 13.493±0.731 13.587±0.421 0.914
69周龄69 weeks of age 14.583±0.532 14.283±0.749 0.751
76周龄76 weeks of age 13.375±0.366 13.120±0.972 0.648
胫骨指数Tibia index/(g/kg)
65周龄65 weeks of age 7.147±0.308 7.253±0.348 0.823
69周龄69 weeks of age 6.537±0.260 6.681±0.164 0.650
76周龄76 weeks of age 6.259±0.289 6.769±0.159 0.153

2.5 淫羊藿提取物对产蛋后期蛋鸡骨强度的影响

由表8可知,在65和69周龄时,与对照组相比,饲粮中添加200 mg/kg淫羊藿提取物对产蛋后期蛋鸡胫骨和股骨强度没有显著影响(P>0.05)。在76周龄时,与对照组相比,淫羊藿提取物组蛋鸡的胫骨强度出现了增加的趋势(P=0.085),股骨强度没有显著差异(P>0.05)。
表8 淫羊藿提取物对产蛋后期蛋鸡骨强度的影响

Table 8 Effects of Epimedium extract on bone strength of laying hens during late laying period N

项目
Items		 对照组
Control group		 淫羊藿提取物组
Epimedium extract group		 P值
P-value
胫骨强度Tibia strength
65周龄65 weeks of age 188.795±10.031 192.171±12.388 0.836
69周龄69 weeks of age 197.327±10.889 221.630±9.400 0.122
76周龄76 weeks of age 193.071±4.600 217.499±11.158 0.085
股骨强度Femur strength
65周龄65 weeks of age 228.285±10.192 220.239±13.343 0.642
69周龄69 weeks of age 180.187±10.011 199.675±8.360 0.166
76周龄76 weeks of age 210.006±19.421 205.793±12.536 0.859

2.6 淫羊藿提取物对产蛋后期蛋鸡股骨骨密度及骨矿物质含量的影响

由表9可知,在65和69周龄时,与对照组相比,淫羊藿提取物组股骨骨密度及骨矿物质含量均无显著差异(P>0.05);在76周龄时,与对照组相比,淫羊藿提取物组股骨骨密度及骨矿物质含量显著增加(P<0.05)。
表9 淫羊藿提取物对产蛋后期蛋鸡骨密度及骨矿物质含量的影响

Table 9 Effects of Epimedium extract on bone mineral density and bone mineral contents of laying hens during late laying period

项目
Items		 对照组
Control group		 淫羊藿提取物组
Epimedium extract group		 P值
P-value
骨密度BMD/(g/cm2)
65周龄65 weeks of age 0.166±0.013 0.180±0.017 0.510
69周龄69 weeks of age 0.207±0.015 0.223±0.011 0.382
76周龄76 weeks of age 0.181±0.018b 0.228±0.016a 0.027
骨矿物质含量BMC/g
65周龄65 weeks of age 1.233±0.150 1.500±0.165 0.260
69周龄69 weeks of age 1.817±0.119 1.967±0.105 0.369
76周龄76 weeks of age 1.517±0.095b 2.026±0.164a 0.023

2.7 淫羊藿提取物对产蛋后期蛋鸡骨组织微观结构的影响

如图2显示,对照组蛋鸡股骨的皮质骨吸收腔增加,骨小梁数目减小,骨小梁网状结构被破坏,说明产蛋后期蛋鸡发生骨质疏松。与对照组相比,淫羊藿提取物组蛋鸡股骨的皮质骨吸收腔减小,皮质骨面积和宽度增加,骨小梁结构比较完整,骨小梁数量和厚度增加,髓质骨面积和数量增加。
图2 淫羊藿提取物对产蛋后期蛋鸡骨组织微观结构的影响

A:对照组;B:淫羊藿提取物组。图片为骨组织Goldner三色染色(放大倍数,8×)。黑色箭头所指的是髓质骨;蓝色箭头所指的是皮质骨;紫色箭头所指的是皮质骨吸收腔。

Fig. 2 Effects of Epimedium extract on microstructure of bone tissue of laying hens during late laying period

A: control group; B: Epimedium extract group. Image shows Goldner trichrome staining of bone tissue (magnification, 8×). Black arrows point to medullary bone; blue arrows point to cortical bone; purple arrows point to cortical bone resorption cavities.

2.8 淫羊藿提取物对产蛋后期蛋鸡骨相关基因mRNA表达水平的影响

由表10可知,淫羊藿提取物组蛋鸡骨组织中骨保护素(OPG)、Runt相关转录因子2(Runx2)、骨形态发生蛋白2(BMP2)及SMAD家族成员4(Smad4)的mRNA相对表达量显著高于对照组(P<0.05);2组间骨组织中核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)和骨形态发生蛋白4(BMP4)的mRNA相对表达量均无显著差异(P>0.05)。
表10 淫羊藿提取物对产蛋后期蛋鸡骨相关基因mRNA表达水平的影响

Table 10 Effects of Epimedium extract on mRNA expression levels of bone-related genes of laying hens during late laying period

项目
Items		 对照组
Control group		 淫羊藿提取物组
Epimedium extract group		 P值
P-value
骨保护素OPG 1.006±0.062b 2.386±0.351a 0.008
Runt相关转录因子2 Runx2 1.019±0.117b 1.539±1.156a 0.037
核因子-κB受体活化因子配体RANKL 1.065±0.210 0.685±0.136 0.180
骨形态发生蛋白2 BMP2 1.007±0.070b 3.162±0.599a 0.036
骨形态发生蛋白4 BMP4 1.023±0.123 0.944±0.061 0.585
SMAD家族成员4 Smad4 1.019±0.112b 2.206±0.337a 0.033

3 讨论

3.1 淫羊藿提取物对产蛋后期蛋鸡生产性能和蛋品质的影响

现代商品蛋鸡,通常会饲养到80~90周龄。老龄蛋鸡通常会面临着生产性能和蛋品质降低的问题[35]。蛋重、产蛋率和料蛋比是反映蛋鸡生产性能的重要指标[36]。蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋白高度、哈氏单位、蛋形指数和蛋黄比率等指标能够综合评价蛋品质[37-38]。产蛋与骨之间存在紧密且相互的关系,产蛋量的增加在一定程度上会消耗蛋鸡的骨骼,引起骨代谢失衡。髓质骨是现存羊膜动物中雌性鸟类特有的一种依赖雌激素的性别特异性组织,被称为蛋壳形成过程中的动态钙库,能够为蛋壳形成提供35%~40%的钙[3,39]。髓质骨由随机分布的羟基磷灰石晶体组成[40-41],当未发生钙化时,髓质骨进行矿化,然后在蛋壳形成过程中破骨细胞进行骨吸收,将羟基磷灰石中的钙和磷进行快速分解和代谢为离子钙和无机磷酸盐,该矿物质离子被释放到循环中,用于蛋壳形成或排泄钙[4]。研究表明,淫羊藿素处理BMSCs能够促进其成骨分化,增加钙沉积物的形成[25]。地塞米松是骨细胞分化的经典诱导剂,淫羊藿苷在没有地塞米松的情况下仍具有显著的体外成骨细胞分化的能力,并且10-5 mol/L淫羊藿苷比最佳浓度10-8 mol/L的地塞米松更能促进成骨矿化[42]。杨鹤云等[43]在蛋鸡饮水中混入黄芪和淫羊藿口服液发现,中剂量和高剂量组蛋鸡产蛋率显著增加,料蛋比和软破异形蛋率显著降低。本研究发现,饲粮中添加200 mg/kg淫羊藿提取物能够显著提高蛋鸡62~65周龄时的产蛋率,在蛋鸡66~69周龄时具有增加的趋势,而在蛋鸡70~76周龄时2组产蛋率差异并不显著。在本研究中,淫羊藿提取物处理增加了蛋鸡62~65周龄时的产蛋率,说明淫羊藿提取物可能能够促进骨钙形成,随后用于蛋壳形成。蛋鸡70~76周龄时2组产蛋率差异不显著,可能是由于在蛋鸡62~65周龄时,仍然有较多活性卵泡,然而随着年龄的增长,蛋鸡卵巢功能衰退[44],可能即使添加了200 mg/kg淫羊藿提取物虽然能够起到一定的改善作用但也无法逆转这种因衰老带来的生殖系统功能的衰退。童小峰等[45]研究发现,饲粮中添加0.2%的淫羊藿苷能够显著提高平均蛋重,平均日采食量具有降低的趋势,蛋白高度显著升高,而添加0.05%的淫羊藿苷没有出现上述变化。本研究发现,饲粮中添加200 mg/kg淫羊藿提取物能够降低料蛋比,降低产蛋后期蛋鸡破蛋率,蛋壳厚度具有增加的趋势,增加了蛋白高度和哈氏单位。由此可见,饲粮中添加淫羊藿提取物能够提高蛋鸡的饲料利用率,节约养殖成本,对降低产蛋后期蛋鸡的破蛋率具有一定的积极作用,在一定程度上可以改善蛋壳的质量,减少破蛋的发生,增加养殖场的经济效益。

3.2 淫羊藿提取物对产蛋后期蛋鸡骨指数、骨强度、骨密度及骨矿物质含量和骨组织微观结构的影响

骨骼能够为身体和运动提供机械支撑,适当的骨重量与体重比可能能够保证蛋鸡有良好的身体结构。在本研究中,饲粮中添加200 mg/kg淫羊藿提取物显著增加蛋鸡69周龄时的股骨指数。朱贵忱等[46]研究发现,维甲酸所致的骨质疏松大鼠用50、100或200 mg/kg淫羊藿苷干预后均能够提高大鼠的骨强度。本研究中,饲粮中添加200 mg/kg淫羊藿提取物在蛋鸡69周龄时具有增加产蛋后期蛋鸡胫骨骨强度的趋势,对股骨骨强度没有产生显著的影响。这可能是由于骨强度的升高是一个积累的过程,在本试验中淫羊藿提取物的作用时间和剂量还不能够使骨强度发生显著的改变。马慧萍等[47]用不同剂量的淫羊藿总黄酮治疗维甲酸诱发大鼠骨质疏松症,发现淫羊藿总黄酮各剂量组大鼠股骨的干重、灰重、骨钙、骨磷和骨密度等均明显升高。Huang等[48]研究发现,淫羊藿苷可以通过干扰蛋鸡嘧啶代谢、牛磺酸代谢和脂质代谢从而增加骨密度,改善骨组织微观结构。Shi等[49]招募1 017名骨质疏松患者,进行口服淫羊藿联合常规药物治疗与常规药物治疗、单独口服淫羊藿与常规药物治疗,发现淫羊藿能够改善骨密度,并作为辅助或替代药物缓解疼痛。淫羊藿类黄酮化合物具有类雌激素的作用。雌激素在维持骨稳态方面具有重要作用。雌激素能够直接促进BMSCs向成骨细胞分化,从而增强骨形成。此外,雌激素还可以抑制破骨细胞形成并诱导破骨细胞凋亡,从而抑制骨吸收。有研究表明,淫羊藿苷能够通过膜雌激素受体介导的非核作用在体外对成骨细胞的增殖发挥雌激素样作用[50]。本试验研究发现,饲粮中添加200 mg/kg淫羊藿提取物在蛋鸡65和69周龄时骨密度及骨矿物质含量与饲喂基础饲粮的蛋鸡相比差异并不显著;在蛋鸡76周龄时,饲粮中添加200 mg/kg淫羊藿提取物蛋鸡骨密度及骨矿物质含量显著升高,蛋鸡皮质骨吸收腔减小、数量减少,骨小梁更加完整,髓质骨数量增多、分布更广。这表明饲粮中添加200 mg/kg淫羊藿提取物能够改善产蛋后期蛋鸡骨骼健康。

3.3 淫羊藿提取物对血清骨相关指标的影响

血清骨转换生化标志物可以在一定程度上反映成骨细胞和破骨细胞的活动,有助于鉴别原发性和继发性骨质疏松症、判断骨转换类型、预测骨丢失速率、评估骨折风险、了解病情进展等[51]。BGP在骨中由成骨细胞分泌,当骨吸收时,腔隙内的酸性环境会导致BGP释放到体循环中,血清BGP含量能够反映骨转换速率[52];TRAP是由破骨细胞产生的,能够与其他酶一起参与骨基质中固体钙磷矿化物的降解,反映破骨活性[53];在骨形成过程中,成骨细胞分泌并合成一种名为ALP的糖蛋白,ALP在骨中发挥着关键作用,通过水解磷酸酯和焦磷酸盐,为骨的形成提供支持[54]。当发生高转换型骨质疏松时,这3种指标均升高[55]。雌激素缺乏导致的骨质疏松属于高转换型骨质疏松,骨形成和骨吸收均增加,骨吸收影响大于骨形成,骨量减少,易发生骨折[56]。有研究发现,淫羊藿苷可以降低产蛋后期蛋鸡的骨转换,降低血清ALP、TRAP的活性及BGP的含量[48]。淫羊藿苷还可有效降低糖尿病骨质疏松大鼠血清中骨转换标志物的水平(Ⅰ型胶原C端肽、ALP、TRAP-5b、BGP和Ⅰ型原胶原N端前肽),增加骨组织中Runx2、OPG mRNA表达和OPG/RANKL mRNA比率,使骨密度增加,防止骨质流失[57]。在本研究中,饲粮中添加200 mg/kg淫羊藿提取物显著降低蛋鸡76周龄时血清BGP含量及TRAP活性,但对ALP的活性没有显著影响。BGP含量降低说明淫羊藿提取物能够调节成骨细胞和破骨细胞的活性。成骨细胞在骨重塑过程中起着重要的作用。成骨细胞能够分泌OPG,OPG通过阻断RANKL与核因子-κB受体活化因子(RANK)的结合来抑制破骨细胞的激活,从而在骨转换中发挥核心作用[58-59]。在本试验中TRAP活性降低,ALP活性没有变化,说明成骨细胞的活跃程度下降不显著,破骨细胞的活跃程度下降可能是成骨细胞分泌的OPG抑制了破骨细胞活性。由此可见,饲粮中添加200 mg/kg淫羊藿提取物能够降低骨转换率,使净影响为骨形成大于骨吸收。

3.4 淫羊藿提取物对产蛋后期蛋鸡骨相关基因表达的影响

Runx2属于Runt结构域家族转录因子的成员之一,通过结合特定DNA序列来调控众多基因的转录,从而控制BMSCs向成骨细胞的分化以及成骨细胞向骨细胞的成熟[60]。成骨细胞是由BMSCs分化而来,在此过程中受到多种信号通路的调控,其中BMP/Smad信号通路已被证明。BMP2或BMP4与细胞表面受体结合,使Smad1、Smad5或Smad8发生磷酸化后与Smad4结合形成复合物,靶向下游Runx2促进成骨细胞分化[61]。在本研究中,淫羊藿提取物能够上调蛋鸡骨组织中OPG、BMP2、Smad4和Runx2基因的表达。淫羊藿提取物中的主要活性成分淫羊藿苷可能是发挥调控作用的关键物质。研究表明,淫羊藿苷可通过激活相对年轻和年老大鼠的BMP2/Smad5/Runx2通路来加速骨折愈合[62]。此外,淫羊藿苷还能够通过BMP信号传导上调脑和肌肉芳香烃受体核转运样蛋白1(BMAL1)表达,而BMAL1的过表达可进一步促进成骨基因(如BMP2、Runx2、ALP和OC)的表达,从而促进BMSCs向成骨细胞分化[24]。Jiao等[63]发现,淫羊藿苷促进BMSCs软骨分化和细胞增殖,上调BMP2的表达,而BMP-Smad信号通路抑制剂Noggin能够逆转淫羊藿苷对BMSCs的修复作用。本研究中,淫羊藿提取物中除淫羊藿苷外,还含有朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、宝藿苷Ⅰ及淫羊藿素等多种活性成分。这些成分可能通过不同的机制协同调控骨代谢。例如,朝藿定A可能通过OPG/RANKL、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和蛋白激酶B(AKT)信号通路抑制破骨细胞的形成、分化和骨细胞吸收[64]。朝藿定C可能调控磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-AKT信号通路发挥骨保护作用[65]。而宝藿苷Ⅰ通过改善MAPK和核因子-κB(NF-κB)信号通路的激活和降低尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)的表达来抑制破骨细胞分化,减少骨吸收[66]。然而,本研究中,淫羊藿苷作为淫羊藿提取物中含量最高的活性成分(占总量的20.081%),其通过BMP/Smad信号通路调控成骨分化的作用最为显著。综上所述,在本研究中,淫羊藿提取物主要通过其核心成分淫羊藿苷激活BMP2/Smad4/Runx2信号通路,促进成骨分化。同时,其他活性成分可能通过协同作用进一步增强骨保护效果。未来研究可进一步分离和鉴定淫羊藿提取物中各成分的具体作用机制,以明确其在骨代谢调控中的贡献。

4 结论

饲粮中添加200 mg/kg淫羊藿提取物能够提高产蛋后期蛋鸡的产蛋率,降低料蛋比,提高蛋白高度和哈氏单位;降低骨转换,通过BMP/Smad信号通路促进成骨细胞分化,上调OPG mRNA表达水平,降低破骨细胞活性,提高骨密度,改善骨微观结构,使骨折风险降低,从而发挥骨保护作用。

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