Effects of Exogenous Protease on in Vitro Nutrient Digestibility of Soybean Meal under Different Bionic Parameter Conditions

WU Shiqiao; ZHANG Lianhua; CHEN Liang

doi:10.12418/CJAN2025.448

2025 , Vol. 37 >Issue 8: 5524 - 5534

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.448

RESEARCH PAPER

Effects of Exogenous Protease on in Vitro Nutrient Digestibility of Soybean Meal under Different Bionic Parameter Conditions

WU Shiqiao ,
ZHANG Lianhua ^,^* ,
CHEN Liang

Expand

National Key Laboratory of Animal Nutrition and Feeding, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China

^*assistant professor, E-mail: zhanglh921210@163.com

Received date: 2024-12-23

Online published: 2025-08-14

Fold

Abstract

This experiment was conducted to study the effects of exogenous protease on in vitro nutrient digestibility of soybean meal under different bionic parameter conditions. Through the bionic digestive system of monogastric animals, the orthogonal experimental design was adopted, the effects of add exogenous protease or not add exogenous protease on nutrient digestibility of soybean meal at different addition amount (1 and 2 g) in stomach and intestinal digestion simulated digestion stages were explored, and the effects of exogenous protease under different conditions of simulated gastric fluid digestion time, pH, volume and endogenous protease activity were studied. The results showed as follows: 1) in stomach and intestinal digestion simulated digestion stages, the dry matter digestibility (DMD), gross energy digestibility (GED) and enzymatic hydrolyzate gross energy (EHGE) of soybean meal add exogenous protease were significantly higher than those of not add exogenous protease (P<0.01), and the GED and EHGE of soybean meal of 1 g sample amount than were significantly higher than those of 2 g sample amount (P<0.01). 2) The DMD, GED and EHGE of soybean meal were significantly increased with gastric fluid digestion time increased (P<0.01). 3) The DMD, GED and EHGE of soybean meal were significantly decreased with gastric fluid pH increased (P<0.01). 4) The DMD, GED and EHGE of soybean meal were significantly increased with gastric fluid volume decreased (P<0.01). 5) The DMD, GED and EHGE of soybean meal were significantly increased with gastric fluid endogenous protease activity increased (P<0.01). 6) Under the conditions of simulated gastric fluid digestion time, pH and endogenous protease activity, the DMD, GED and EHGE of soybean meal add exogenous protease were significantly higher than those of not add exogenous protease (P<0.01). In conclusion, add exogenous protease can improve the in vitro nutrient digestibility of soybean meal.

Key words： exogenous protease; soybean meal; bionic method; nutrient digestibility

Cite this article

WU Shiqiao , ZHANG Lianhua , CHEN Liang . Effects of Exogenous Protease on in Vitro Nutrient Digestibility of Soybean Meal under Different Bionic Parameter Conditions[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2025 , 37(8) : 5524 -5534 . DOI: 10.12418/CJAN2025.448

近年来,全球地缘政治冲突频发与供应链结构性矛盾加剧,引发饲料原料价格持续攀升,对畜禽养殖业成本控制形成严峻压力。在此背景下,饲料企业及养殖主体亟需通过技术创新实现降本增效,其中提升现有饲料资源(尤其是高成本蛋白质原料)的利用效率成为核心突破方向。我国畜禽饲粮以玉米-豆粕型及其复合杂粕型为主,但抗营养因子显著制约营养物质的消化利用率,限制蛋白质资源的高效开发。外源蛋白酶作为饲用酶制剂的关键组分,通过激活内源蛋白酶活性,降解抗营养因子(如胰蛋白酶抑制因子)含量及减少氮磷排放^[1-3],已成为优化饲料效价的研究热点。然而,饲用酶潜在价值的商业化应用需以多维验证为基础:既需体外仿生模型量化酶解效率,亦需体内试验确证其对动物生长性能及环境效益的协同增益^[4]。随着全球酶制剂市场扩张,建立快速、精准的饲用酶有效性评价体系迫在眉睫。

饲料生物学效价评定主要利用化学分析法、体内法和体外法。其中,体外法通过对动物消化道pH、消化酶种类及活性、养分吸收等参数的模拟,在体外建立一套与畜禽消化道内环境相近的操作程序,能够快速评定饲料的生物学效价。我国动物营养学国家重点实验室构建的单胃动物仿生消化系统,兼具高效性与可控优势,已实现食糜在家禽肠道中的全程仿生消化环境^[5]。目前,现有研究多聚焦复合酶谱筛选,针对单一外源蛋白酶的体外评价体系仍待完善。基于此,本研究利用单胃动物仿生消化系统,探究不同仿生参数(胃液消化时间、pH、体积、内源蛋白酶活性)对外源蛋白酶调控豆粕干物质消化率(dry matter digestibility,DMD)、总能消化率(gross energy digestibility,GED)和酶水解物能值(enzymatic hydrolyzate gross energy,EHGE)的影响,以期为外源蛋白酶的快速评价、蛋白质饲料资源高效利用及酶制剂工艺优化提供方法论支撑与数据参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

外源蛋白酶(DP100)为白色颗粒状,于-20 ℃保存备用。蛋白酶活性参照GB/T 28715—2012,采用分光光度法测定,其实测活性为11 924.90 U/g。

饲料原料样品为豆粕,四分法取样并粉碎过60目筛,在豆粕中添加2 500 mg/kg的外源蛋白酶,充分混合后-20 ℃保存备用。

1.2 试验设计

本试验在不同模拟胃液消化时间、pH、体积、内源蛋白酶活性条件下,研究外源蛋白酶对豆粕体外养分消化率的影响。在仿生消化系统中,以鸡模拟消化流程测定DMD、GED和EHGE。试验共设5个部分,具体试验设计如下。

试验1:研究外源蛋白酶对不同添加量的豆粕在胃和小肠模拟消化阶段养分消化率的影响。采用2×2因子设计,在1和2 g豆粕原料中添加或不添加外源蛋白酶,分别模拟胃和小肠消化阶段,共4个组,每组5个重复,每个重复1根消化管。

试验2:研究不同模拟胃液消化时间条件下外源蛋白酶的作用效果。采用2×5因子设计,在1 g豆粕原料中不添加或添加外源蛋白酶,模拟胃液消化时间分别为0、30、60、120、240 min,共10个组,每组5个重复,每个重复1根消化管。

试验3:研究不同模拟胃液pH条件下外源蛋白酶的作用效果。采用2×3因子设计,在1 g豆粕原料中不添加或添加外源蛋白酶,模拟胃液pH分别为2.0、3.0、4.0,共6个组,每组5个重复,每个重复1根消化管。

试验4:研究不同模拟胃液体积条件下外源蛋白酶的作用效果。采用2×3因子设计,在1 g豆粕原料中不添加或添加外源蛋白酶,模拟胃液体积分别为20、15、10 mL,共6个组,每组5个重复,每个重复1根消化管。

试验5:研究不同模拟胃液内源蛋白酶活性条件下外源蛋白酶的作用效果。采用2×3因子设计,在1 g豆粕原料中不添加或添加外源蛋白酶,模拟胃液内源蛋白酶活性分别为1 550、2 067、3 100 U/mL,共6个组,每组5个重复,每个重复1根消化管。

1.3 试验方法

1.3.1 缓冲液的配制

仿生消化操作过程中透析袋的型号和前处理、模拟及胃肠液及缓冲液的配置和仪器运行参数等试验操作参照赵峰等^[6]。

模拟胃液:称取387.5 kU的胃蛋白酶,溶解于250 mL、pH 2.0的盐酸缓冲溶液中(41 ℃下标定pH),缓慢搅拌至溶解,现配现用。

模拟小肠液:称取11.40 kU的淀粉酶、13.55 kU胰蛋白酶和3.11 kU糜蛋白酶,溶解于25 mL去离子水中,缓慢搅拌直至溶解,现配现用。

模拟胃缓冲液:称取2.17 g的氯化钠和1.57 g的氯化钾,溶解于2 000 mL的去离子水中,并在41 ℃下利用2 mol/L的盐酸溶液调节pH至2.0。

模拟小肠缓冲液:称取9.35 g的无水磷酸氢二钠、40.09 g的无水磷酸二氢钠、11.13 g的氯化钠和3.09 g的氯化钾,青霉素160万U,溶解于2 000 mL的去离子水中,并在41 ℃下利用1 mol/L的磷酸溶液或者1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至6.5。

1.3.2 单胃动物仿生消化系统模拟鸡消化过程主要步骤

单胃动物仿生消化系统模拟鸡消化操作按照以下程序进行:在消化管透析袋中加入样品以及20 mL的模拟胃液,并将消化管固定至消化平台上,连接好管道。在主界面上选择鸡的仿生消化程序后,开始胃阶段的消化。4.0 h后,胃阶段的消化停止,开始清洗。6.5 h后,将2.2 mL(实际进入模拟消化器内的模拟肠液为2 mL)的模拟小肠液准确移入小肠消化液储备室中,开始小肠阶段的消化。21.5 h后,小肠后段模拟消化结束,开始清洗。25.5 h后,清洗结束。消化结束后,将透析袋内的未消化残渣转移至干燥培养皿(己测绝干重)中,65 ℃烘干后再调节温度105 ℃烘至恒重。将烘干的消化残渣转移至破璃砂坩埚(已测绝干重)中,利用无水乙醇脱脂至滤出无色溶液为止。之后将上述培养皿和玻璃砂坩埚置于105 ℃烘箱内烘至恒重。将玻璃砂坩埚内的残渣样品转移至称样纸上,测定残渣能量,同时将带有部分剩余残渣的玻璃砂坩埚置于105 ℃烘箱内烘至恒重。

1.4 检测指标与方法

干物质含量参照GB/T 6435—2014的方法,采用烘干法测定;粗蛋白质含量参照GB/T 6432—2018的方法,采用凯氏定氮法测定;总能采用PARR6200氧弹量热仪测定;氨基酸含量参照GB/T 14924.10—2008的方法测定。豆粕原料营养成分分析见表1。

表1 豆粕原料营养成分分析(饲喂基础)

Table 1 Analysis of nutritional components of soybean meal (as-fed basis) %

项目Items	含量Content
干物质DM	92.41
粗蛋白质CP	45.55
总能GE/(MJ/kg)	18.15
精氨酸Arg	3.97
组氨酸His	1.54
异亮氨酸Ile	2.19
亮氨酸Leu	4.05
赖氨酸Lys	2.76
蛋氨酸Met	0.23
苯丙氨酸Phe	2.78
苏氨酸Thr	2.11
缬氨酸Val	2.20
丙氨酸Ala	2.35
天冬氨酸Asp	4.17
半胱氨酸Cys	1.54
谷氨酸Glu	2.32
甘氨酸Gly	2.19
脯氨酸Pro	2.65
丝氨酸Ser	2.79
酪氨酸Tyr	1.70

1.5 计算公式

豆粕DMD、GED和EHGE计算公式如下:

DMD(%)=(M1-M2)/M1×100;

GED(%)=(GE1-GE2)/GE1×100;

EHGE(MJ/kg)=(GE1-GE2)/(M1×1 000)。

式中:M1为上样量(g);M2为未消化残渣重(g);GE1为样品总能(MJ);GE2为未消化残渣总能(J)。

1.6 统计与分析

试验数据经Excel 2021整理后,用SAS 9.3软件进行方差分析,试验结果以“平均值±标准差”表示,以P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 外源蛋白酶对不同上样量的豆粕在胃和小肠模拟消化阶段养分消化的影响

2.1.1 模拟胃消化阶段

由表2可知,2组的豆粕DMD、GED和EHGE显著高于其他各组(P<0.05),且1、2组显著高于3、4组(P<0.05)。上样量1 g的豆粕DMD、GED和EHGE极显著高于上样量2 g(P<0.01),添加外源蛋白酶的豆粕DMD、GED和EHGE极显著高于未添加外源蛋白酶(P<0.01),上样量和外源蛋白酶之间互作效应极显著影响豆粕DMD、GED和EHGE(P<0.01)。

表2 模拟胃消化阶段外源蛋白酶对豆粕DMD、GED和EHGE的影响

Table 2 Effects of exogenous protease on DMD, GED and EHGE of soybean meal in simulated stomach digestion stage

项目 Items			干物质消化率 DMD/%	总能消化率 GED/%	酶水解物能值 EHGE/(MJ/kg)
组别 Groups	上样量 Sample amount/g	外源蛋白酶 Exogenous protease
1	1	-	42.46±0.19^b	42.08±0.20^b	8.27±0.04^b
2		+	45.62±0.35^a	45.32±0.40^a	8.95±0.08^a
3	2	-	31.52±0.57^c	28.31±0.70^c	5.69±0.14^c
4		+	31.34±0.45^c	28.35±0.88^c	5.70±0.18^c
主效应Main effects
上样量 Sample amount/g	1		44.04±1.68^A	43.70±1.73^A	8.61±0.37^A
	2		31.43±0.49^B	28.33±0.75^B	5.70±0.15^B
外源蛋白酶 Exogenous protease	-		36.99±5.78^B	35.19±7.27^B	6.98±1.36^B
	+		38.48±7.54^A	36.84±8.97^A	7.33±1.72^A
P值 P-value	上样量Sample amount		<0.001	<0.001	<0.001
	外源蛋白酶Exogenous protease		0.005	0.006	0.004
	上样量×外源蛋白酶 Sample amount×exogenous protease		<0.001	<0.001	<0.001

	同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著(P<0.01),相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。“-”表示未添加外源蛋白酶,“+”表示添加外源蛋白酶。下表同。
	In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). “-” indicated not added exogenous protease, “+” indicated added exogenous protease. The same as below.

2.1.2 模拟小肠消化阶段

由表3可知,2组的豆粕DMD、GED和EHGE显著高于其他各组(P<0.05),4组的豆粕GED和EHGE显著高于1、3组(P<0.05)。上样量1 g的豆粕GED和EHGE极显著高于上样量2 g(P<0.01),添加外源蛋白酶的豆粕DMD、GED和EHGE极显著高于未添加外源蛋白酶(P<0.01),上样量和外源蛋白酶之间互作效应极显著影响豆粕DMD、GED和EHGE(P<0.01)。

表3 模拟小肠消化阶段外源蛋白酶对豆粕DMD、GED和EHGE的影响

Table 3 Effects of exogenous protease on DMD, GED and EHGE of soybean meal in simulated intestinal digestion stage

项目 Items			干物质消化率 DMD/%	总能消化率 GED/%	酶水解物能值 EHGE/(MJ/kg)
组别 Groups	上样量 Sample amount/g	外源蛋白酶 Exogenous protease
1	1	-	47.34±0.36^c	50.68±0.37^c	9.95±0.07^c
2		+	51.78±0.17^a	55.91±0.56^a	11.05±0.11^a
3	2	-	48.81±1.01^b	48.77±0.64^d	9.80±0.13^c
4		+	49.68±0.83^b	51.80±0.75^b	10.41±0.15^b
主效应Main effects
上样量 Sample amount/g	1		49.56±2.35	53.30±2.80^A	10.50±0.58^A
	2		49.24±0.99	50.29±1.73^B	10.11±0.35^B
外源蛋白酶 Exogenous protease	-		48.08±1.05^B	49.73±1.11^B	9.88±0.13^B
	+		50.73±1.24^A	53.86±2.25^A	10.73±0.36^A
P值 P-value	上样量Sample amount		0.325	0.004	0.005
	外源蛋白酶Exogenous protease		<0.001	<0.001	0.002
	上样量×外源蛋白酶 Sample amount×exogenous protease		0.004	0.004	0.006

2.2 不同模拟胃液消化时间条件下外源蛋白酶的作用效果

由表4可知,豆粕DMD、GED和EHGE随胃液消化时间延长而极显著增加(P<0.01),添加外源蛋白酶的豆粕DMD、GED和EHGE极显著高于未添加外源蛋白酶(P<0.01),胃液消化时间和外源蛋白酶之间互作效应极显著影响豆粕DMD、GED和EHGE(P<0.01)。

表4 不同模拟胃液消化时间条件下外源蛋白酶对豆粕DMD、GED和EHGE的影响

Table 4 Effects of exogenous protease on DMD, GED and EHGE of soybean meal under condition of different simulated gastric juice digestion time

项目 Items			干物质消化率 DMD/%	总能消化率 GED/%	酶水解物能值 EHGE/(MJ/kg)
组别 Groups	消化时间 Digestion time/min	外源蛋白酶 Exogenous protease
1	0	-	20.31±0.36ⁱ	15.17±0.22^h	2.91±0.13^g
2		+	21.62±0.63^h	18.33±0.92^g	3.63±0.18^f
3	30	-	33.21±0.69^f	32.04±0.83^f	6.26±0.16^e
4		+	32.33±0.92^g	31.37±0.90^gf	6.22±0.20^e
5	60	-	33.77±0.53^f	32.27±0.79^f	6.59±0.38^de
6		+	34.88±0.95^e	34.17±1.25^e	6.77±0.25^d
7	120	-	38.02±0.35^d	37.20±0.25^d	7.50±0.31^c
8		+	43.92±0.19^b	43.79±0.39^b	8.86±0.91^a
9	240	-	42.34±0.19^c	41.67±0.22^c	8.14±0.04^b
10		+	45.57±0.35^a	45.43±0.40^a	9.00±0.08^a
主效应Main effects
消化时间 Digestion time/min	0		21.03±0.85^E	16.92±1.79^E	3.27±0.41^E
	30		32.77±0.90^D	31.70±0.93^D	6.24±0.17^D
	60		34.46±0.96^C	33.49±1.39^C	6.68±0.32^C
	120		40.97±3.24^B	40.50±3.63^B	8.18±0.96^B
	240		43.95±1.72^A	43.55±2.00^A	8.57±0.46^A
外源蛋白酶 Exogenous protease		-	33.71±7.78^B	31.89±9.42^B	6.28±1.86^B
		+	34.94±8.89^A	33.82±10.04^A	6.90±2.05^A
P值 P-value	消化时间Digestion time		<0.001	<0.001	<0.001
	外源蛋白酶Exogenous protease		0.007	0.005	0.006
	消化时间×外源蛋白酶 Digestion time×exogenous protease		0.005	0.004	0.007

2.3 不同模拟胃液pH条件下外源蛋白酶的作用效果

由表5可知,豆粕DMD、GED和EHGE随胃液pH升高而极显著降低(P<0.01),添加外源蛋白酶的豆粕DMD、GED和EHGE极显著高于未添加外源蛋白酶(P<0.01),胃液pH和外源蛋白酶之间互作效应显著影响豆粕GED和EHGE(P<0.05)。

表5 不同模拟胃液pH条件下外源蛋白酶对豆粕DMD、GED和EHGE的影响

Table 5 Effects of exogenous protease on DMD, GED and EHGE of soybean meal under condition of different simulated gastric juice pH

项目 Items			干物质消化率 DMD/%	总能消化率 GED/%	酶水解物能值 EHGE/(MJ/kg)
组别 Groups	pH	外源蛋白酶 Exogenous protease
1	2.0	-	42.34±0.19^d	41.67±0.21^c	8.14±0.04^d
2		+	45.57±0.35^a	45.43±0.40^a	9.00±0.08^a
3	3.0	-	41.89±0.72^d	41.42±0.77^cd	8.10±0.15^d
4		+	44.11±0.38^b	43.95±0.42^b	8.71±0.08^b
5	4.0	-	40.90±0.33^e	40.89±0.45^d	7.99±0.09^d
6		+	43.23±0.83^c	43.46±0.80^b	8.52±0.25^c
主效应Main effects
pH	2.0		43.95±1.72^A	43.55±2.00^A	8.57±0.46^A
	3.0		43.00±1.29^B	42.69±1.46^B	8.40±0.34^B
	4.0		41.94±1.35^C	42.03±1.48^C	8.26±0.33^C
外源蛋白酶 Exogenous protease	-		41.71±0.76^B	41.33±0.59^B	8.08±0.12^B
	+		44.38±1.10^A	44.34±1.00^A	8.74±0.25^A
P值 P-value	pH		0.002	0.008	0.007
	外源蛋白酶Exogenous protease		<0.001	<0.001	<0.001
	pH×外源蛋白酶 pH×exogenous protease		0.072	0.031	0.038

2.4 不同模拟胃液体积条件下外源蛋白酶的作用效果

由表6可知,豆粕DMD、GED和EHGE随胃液体积减少而极显著增加(P<0.01),添加外源蛋白酶豆粕DMD、GED和EHGE极显著低于未添加外源蛋白酶(P<0.01),胃液体积和外源蛋白酶之间互作效应对豆粕DMD、GED和EHGE影响不显著(P>0.05)。

表6 不同模拟胃液体积条件下外源蛋白酶对豆粕DMD、GED和EHGE的影响

Table 6 Effects of exogenous protease on DMD, GED and EHGE of soybean meal under condition of different simulated gastric juice volume

项目 Items			干物质消化率 DMD/%	总能消化率 GED/%	酶水解物能值 EHGE/(MJ/kg)
组别 Groups	体积 Volume/mL	外源蛋白酶 Exogenous protease
1	20	-	45.27±0.66^d	44.60±0.69^c	8.72±0.13^c
2		+	44.29±0.81^e	43.48±0.86^d	8.50±0.17^d
3	15	-	47.22±0.72^bc	46.53±0.80^b	9.10±0.16^b
4		+	46.62±0.73^c	45.93±0.90^b	8.98±0.18^b
5	10	-	48.38±0.98^a	47.69±0.96^ab	9.32±0.19^ab
6		+	47.70±0.27^ab	46.78±0.36^a	9.14±0.07^a
主效应Main effects
体积 Volume/mL	20		44.72±0.87^C	43.98±0.95^C	8.59±0.19^C
	15		46.92±0.76^B	46.23±0.86^B	9.04±0.17^B
	10		48.04±0.77^A	47.24±0.83^A	9.23±0.16^A
外源蛋白酶 Exogenous protease		-	47.08±1.49^A	46.39±1.49^A	9.07±0.29^A
		+	46.20±1.59^B	45.40±1.61^B	8.87±0.31^B
P值 P-value	体积Volume		0.003	0.003	0.006
	外源蛋白酶Exogenous protease		0.002	0.007	0.007
	体积×外源蛋白酶 Volume×exogenous protease		0.842	0.773	0.773

2.5 不同模拟胃液内源蛋白酶活性条件下外源蛋白酶的作用效果

由表7可知,豆粕DMD、GED和EHGE随胃液内源蛋白酶活性增加而极显著增加(P<0.01),添加外源蛋白酶豆粕DMD、GED和EHGE极显著高于未添加外源蛋白酶(P<0.01),胃液内源蛋白酶活性和外源蛋白酶之间的互作效应极显著影响豆粕DMD、GED和EHGE(P<0.01)。

表7 不同模拟胃液内源蛋白酶活性条件下外源蛋白酶对豆粕DMD、GED和EHGE的影响

Table 7 Effects of exogenous protease on DMD, GED and EHGE of soybean meal under condition of different simulated gastric juice endogenous protease activity

项目 Items			干物质消化率 DMD/%	总能消化率 GED/%	酶水解物能值 EHGE/(MJ/kg)
组别 Groups	内源蛋白酶活性 Endogenous protease activity/(U/mL)	外源蛋白酶 Exogenous protease
1	1 550	-	42.34±0.19^e	41.67±0.21^d	8.14±0.04^e
2		+	44.97±0.35^c	44.06±0.41^c	8.82±0.08^c
3	2 067	-	44.06±0.61^d	44.06±0.99^c	8.61±0.19^d
4		+	45.01±0.30^c	46.73±0.38^b	9.23±0.07^b
5	3 100	-	47.90±0.67^a	47.99±0.84^a	9.38±0.16^ab
6		+	46.77±0.56^b	47.61±0.58^a	9.40±0.11^a
主效应Main effects
内源蛋白酶活性 Endogenous protease activity/(U/mL)	1 550		43.65±1.41^C	43.16±1.61^C	8.48±0.36^C
	2 067		44.53±0.68^B	45.39±1.57^B	8.92±0.35^B
	3 100		47.34±0.83^A	47.80±0.71^A	9.39±0.13^A
外源蛋白酶 Exogenous protease	-		44.76±2.46^B	44.57±2.79^B	8.71±0.55^B
	+		45.58±0.95^A	46.33±1.35^A	9.15±0.27^A
P值 P-value	内源蛋白酶活性Endogenous protease activity		<0.001	<0.001	<0.001
	外源蛋白酶Exogenous protease		<0.001	<0.010	0.002
	内源蛋白酶活性×外源蛋白酶 Endogenous protease activity×exogenous protease		0.005	0.005	0.007

3 讨论

在仿生消化系统中,恒温控制、缓冲液流速等参数固定且可重复^[6-8],外源蛋白酶作用效果受消化液体积、pH、酶活性、底物浓度等因素影响较大^[9-11]。

3.1 外源蛋白酶对不同上样量的豆粕在胃和小肠模拟消化阶段养分消化的影响

在肉仔鸡饲粮中添加外源蛋白酶,能够降低饲粮中不可消化氨基酸的比例,从而有效提升肉仔鸡对蛋白质和氨基酸的消化率^[12]。在试验1中,在胃模拟消化阶段,添加外源蛋白酶提高了豆粕DMD、GED和EHGE,这一结果与王永花^[13]的试验结论一致。在小肠模拟消化阶段,添加外源蛋白酶同样能提高豆粕DMD、GED和EHGE。这可能是因为外源蛋白酶能够减少抗营养因子含量,增强消化酶活性,进而促进营养物质的吸收。

在小肠模拟消化阶段,上样量1 g的豆粕GED和EHGE显著高于上样量2 g。同时,小肠模拟消化阶段外源蛋白酶的作用效果低于胃模拟消化阶段。一方面,蛋白酶作为具有生物活性的蛋白质,其三维结构的活性中心易受破坏而失活。胃内pH在2.5~3.0,对酶的破坏极大,且大部分饲用酶为中性,需经过胃部才能到达小肠发挥作用。苗华彪等^[14]对8种饲用蛋白酶的过胃能力进行评估,用人工胃液处理2 h后,半数酶活性在12%以下,4 h后仅有2种酶活性仍在50%以上。结果表明,大部分中性、碱性蛋白酶在通过胃液时,其活性会发生不可逆失活,且失活程度与耐受时间相关。白燕^[15]采用pH为3.0的缓冲液处理中性蛋白酶、碱性蛋白酶和角蛋白酶61 min,发现中性蛋白酶的剩余酶活性(复性)为0,碱性蛋白酶为0.48%,角蛋白酶最高也仅为37.68%。另一方面,经过胃消化后,上样量为2 g的豆粕在小肠消化阶段所含底物量充足,能够相对增加酶促反应,从而提高消化率。

此外,单独测定小肠模拟消化阶段效果时,发现其消化率提升更高,且更接近胃肠道全段消化率,这可能是由于外源蛋白酶对胰蛋白酶活性的增强效果优于胃蛋白酶。耿丹等^[16]研究结果显示,在肉鸡饲粮中添加复合酶制剂能够提高42日龄肉鸡小肠的淀粉酶和蛋白酶活性。艾晓杰等^[17]在雏鹅饲粮中添加0.1%的粗酶制剂后,十二指肠、空肠、回肠食糜淀粉酶活性均显著高于对照组。奚刚等^[18]研究结果表明,在丝毛乌骨鸡饲粮中添加中性外源蛋白酶后,37和67日龄时,加酶组鸡胃蛋白酶活性比对照组分别提高了5.39%和5.27%,差异不显著;但小肠上段的胰蛋白酶活性比对照组分别提高了13.41%和9.27%,差异显著。这些研究结果说明,外源蛋白酶主要在鸡小肠消化阶段发挥主导作用。不过,在实际生产中,酶制剂如何顺利通过胃酸环境进入小肠发挥作用,仍有待进一步研究。此外,本试验关于外源蛋白酶在1和2 g豆粕上样量时的添加效果,再次证明了外源蛋白酶在1 g豆粕上样量时的促消化能力更强,效果更佳。

3.2 不同模拟胃液消化时间条件下外源蛋白酶的作用效果

试验2结果表明,豆粕DMD、GED和EHGE随胃液消化时间延长而极显著增长。在初始阶段(30~60 min),DMD仅提升2.55%,可能与酶-底物结合尚未达到稳态有关;随着消化时间延长至60~120 min,DMD增速显著提升9.04%,此时外源蛋白酶与豆粕中抗营养因子充分接触,释放更多酶切位点;而当消化时间超过120 min后,DMD增速趋缓,最终在240 min达到平台期。这种动力学特征符合米氏方程的预测,即反应初期底物充足,速率由酶活性主导;后期则受产物反馈抑制(如多肽链空间位阻效应)限制^[16]。左建军^[19]的研究也证实,豆粕磷体外消化率在240 min时达到最大值,与本研究结果一致。

3.3 不同模拟胃液pH条件下外源蛋白酶的作用效果

畜禽消化道pH是影响蛋白酶活性的主要因素之一,消化道pH能够影响酶构象,改变酶活性;同时影响底物解离,降低酶的催化效率^[20]。在以往的研究中,均以达到最大消化率或透析率时所选初始pH作为体外模拟胃液的酸度参考标准^[21]。而试验3根据前期的试验研究,以胃蛋白酶为主配制鸡模拟胃液,并调节不同的pH进行消化,结果表明,当模拟胃液pH从2.0升至4.0时,豆粕DMD、GED和EHGE显著下降;添加外源蛋白酶的豆粕DMD、GED和EHGE显著高于未添加外源蛋白酶,这与计成等^[22]研究结果一致,说明本试验所用外源蛋白酶具有宽泛的pH适应性,且pH为2.0时,豆粕DMD、GED和EHGE达最大值。席鹏彬等^[23]在测定菜籽粕的粗蛋白质消化率时,同样采用了pH 2.0的胃缓冲液进行试验。这一特性对实际生产尤为重要,因肉鸡胃液pH随日龄波动(2.5~3.5),宽pH适应性可保障酶效稳定性。

3.4 不同模拟胃液体积条件下外源蛋白酶的作用效果

试验4结果表明,胃液体积从20 mL缩减至10 mL时,豆粕DMD、GED和EHGE极显著增加,添加外源蛋白酶的豆粕DMD、GED和EHGE极显著低于未添加外源蛋白酶。原因可能是体积缩减通过提高酶-底物碰撞频率加速反应。此外,本试验保持内源蛋白酶即胃蛋白酶的活性不变,外源蛋白酶活性随胃液体积减少而升高,外源蛋白酶作用于豆粕上的效率增加,同样使得消化率提高。但添加外源蛋白酶豆粕DMD、GED和EHGE极显著低于未添加外源蛋白酶,可能是外源蛋白酶与内源蛋白酶在有限体系中产生底物竞争,导致协同效应降低。张铁鹰^[24]建立的体外模型进一步证实,当液固比<1∶10时,酶自聚集现象加剧,有效活性下降22%。

3.5 不同模拟胃液内源蛋白酶活性条件下外源蛋白酶的作用效果

酶促反应中,酶与底物浓度均能影响反应速率。一方面改变了酶与底物的接触面积,另一方面改变酶活性也影响了底物的解离效率。试验5结果表明,豆粕DMD、GED和EHGE随内源蛋白酶活性增加而极显著增加。这可能是高活性内源蛋白酶通过预消化产生更多外源酶作用位点。但过量外源酶可引发竞争性抑制,其与内源蛋白酶的底物结合能导致催化效率下降。马俊孝等^[25]利用酸和蛋白酶处理木聚糖酶后发现,木聚糖酶参与活性最高为39.2%,最低为6.9%。而李卫芬等^[26]证实,胃蛋白酶预处理会破坏外源酶结构(木聚糖酶活性降低至24.49%)。王雄等^[12]通过单胃动物仿生消化系统来模拟饲粮在肉鸡的胃肠道中的消化过程,以此体外模型评价蛋白酶的降解效率,发现随着蛋白酶添加量的增加,肉鸡基础饲粮体外DMD、GED等呈现先升高后降低的趋势,可能是因为蛋白酶添加适量能提高内源蛋白酶活性,添加比例过高则会抑制内源蛋白酶活性。

4 结论

不同模拟胃液消化时间、pH、内源蛋白酶活性条件下,外源蛋白酶均能提高豆粕DMD、GED和EHGE。胃仿生参数对外源蛋白酶活性具有调控作用:最适条件为胃液pH 2.0,消化时间240 min,体积10 mL,内源蛋白酶活性3 100 U/mL。

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1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验设计

1.3 试验方法

1.3.1 缓冲液的配制

1.3.2 单胃动物仿生消化系统模拟鸡消化过程主要步骤

1.4 检测指标与方法

表1 豆粕原料营养成分分析(饲喂基础)

1.5 计算公式

1.6 统计与分析

2 结果与分析

2.1 外源蛋白酶对不同上样量的豆粕在胃和小肠模拟消化阶段养分消化的影响

2.1.1 模拟胃消化阶段

表2 模拟胃消化阶段外源蛋白酶对豆粕DMD、GED和EHGE的影响

2.1.2 模拟小肠消化阶段

表3 模拟小肠消化阶段外源蛋白酶对豆粕DMD、GED和EHGE的影响

2.2 不同模拟胃液消化时间条件下外源蛋白酶的作用效果

表4 不同模拟胃液消化时间条件下外源蛋白酶对豆粕DMD、GED和EHGE的影响

2.3 不同模拟胃液pH条件下外源蛋白酶的作用效果

表5 不同模拟胃液pH条件下外源蛋白酶对豆粕DMD、GED和EHGE的影响

2.4 不同模拟胃液体积条件下外源蛋白酶的作用效果

表6 不同模拟胃液体积条件下外源蛋白酶对豆粕DMD、GED和EHGE的影响

2.5 不同模拟胃液内源蛋白酶活性条件下外源蛋白酶的作用效果

表7 不同模拟胃液内源蛋白酶活性条件下外源蛋白酶对豆粕DMD、GED和EHGE的影响

3 讨论

3.1 外源蛋白酶对不同上样量的豆粕在胃和小肠模拟消化阶段养分消化的影响

3.2 不同模拟胃液消化时间条件下外源蛋白酶的作用效果

3.3 不同模拟胃液pH条件下外源蛋白酶的作用效果

3.4 不同模拟胃液体积条件下外源蛋白酶的作用效果

3.5 不同模拟胃液内源蛋白酶活性条件下外源蛋白酶的作用效果

4 结论

References