Effects of Low Crude Protein Diets Supplemented with Amino Acids on in Vitro Nutrient Degradation Rate and Cecal Fermentation Characteristics of Donkeys

WEN Le; GUO Xiaoyu; YAN Sumei; ZHAO Yanli; ZHENG Yaguang; GUO Yongmei; GUO Xiangdong; ZHAO Jiaxin

doi:10.12418/CJAN2025.449

2025 , Vol. 37 >Issue 8: 5535 - 5546

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.449

RESEARCH PAPER

Effects of Low Crude Protein Diets Supplemented with Amino Acids on in Vitro Nutrient Degradation Rate and Cecal Fermentation Characteristics of Donkeys

WEN Le ,
GUO Xiaoyu ^,^* ,
YAN Sumei ,
ZHAO Yanli ,
ZHENG Yaguang ,
GUO Yongmei ,
GUO Xiangdong ,
ZHAO Jiaxin

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Inner Mongolia Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science, College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China

^*associate professor, E-mail: gxy_2594@163.com

Received date: 2024-12-31

Online published: 2025-08-14

Fold

Abstract

This experiment utilized the “three-step in vitro method” (pepsin-pancreatin-cecal fluid method) to simulate the gastrointestinal environment of donkeys in vitro, aiming to investigate the effects of amino acid (AA) supplementation in low crude protein (CP) diets on nutrient degradation rates and cecal fermentation characteristics. Adult female Dezhou donkeys were selected as donors for cecal fluid. A 2×4 factorial completely randomized design was adopted, with factor 1 being AA supplementation: non-AA-supplementation (no lysine or methionine added) and AA-supplementation (lysine and methionine added); with the AA-supplemented treatments adding different levels of lysine (0.07%, 0.13%, 0.20% and 0.25%) and methionine (0.01%, 0.02%, 0.04% and 0.05%); factor 2 included four CP levels: 13.5%, 12.5% (the normal CP level), 11.5%, and 10.5%, resulting in eight dietary treatments with six replicates each. Feed residues degraded through gastric (1 h) and small intestinal (24 h) phases were further incubated in vitro with cecal fluid for 48 h. The results demonstrated that compared to the no AA supplementation, AA supplementation improved the degradation rates of dry matter (DM), ether extract (EE), neutral detergent fiber (NDF), and acid detergent fiber (ADF) in the gastric-small intestinal-cecal phases extremely significantly by 2.55%, 4.72%, 3.31% and 3.62%, respectively (P<0.01), and significantly increased crude protein (CP) degradation rate by 0.66% (P<0.05), supplementation with AA improved the in vitro feed utilization rate in donkeys, thereby promoting nutrient degradation and enhancing digestion and absorption. Compared to the normal CP level treatment (12.5% CP), the 10.5% CP treatment exhibited an extremely significant reduction in CP degradation rate by 1.49% (P<0.01), with no significant effects on other nutrient degradation rates (P>0.05). Compared to the no AA supplementation, AA supplementation extremely significantly increased ammonia nitrogen (NH₃-N) content by 1.89% (P<0.01), which remained within the optimal range for microbial growth, and extremely significantly elevated bacterial crude protein (BCP) content by 2.14% (P<0.01). The 13.5% CP treatment showed extremely significantly higher BCP content than other groups (P<0.01), while no significant difference was observed between the 10.5% CP and 11.5% CP treatments (P>0.05). Dietary CP levels and AA supplementation had no significant effects on gas production at different time points (P>0.05). Compared to the no AA supplementation treatment, AA supplementation extremely significantly increased total volatile fatty acid (TVFA) content (P<0.01), improving cecal fermentation. Comprehensive analysis indicates that the 10.5% CP diet supplemented with AA achieved optimal in vitro nutrient degradation rates and cecal fermentation characteristics in donkeys.

Key words： low crude protein diet; donkey; in vitro method; nutrient degradation rate; cecal fermentation

Cite this article

WEN Le , GUO Xiaoyu , YAN Sumei , ZHAO Yanli , ZHENG Yaguang , GUO Yongmei , GUO Xiangdong , ZHAO Jiaxin . Effects of Low Crude Protein Diets Supplemented with Amino Acids on in Vitro Nutrient Degradation Rate and Cecal Fermentation Characteristics of Donkeys[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2025 , 37(8) : 5535 -5546 . DOI: 10.12418/CJAN2025.449

驴作为重要的马属动物之一,具有耐寒冷、耐干旱、发病率低及抗逆能力强等诸多优势,在中国的饲养历史十分悠久^[1]。目前我国也是全球驴存栏量最多的国家。随着农业生产逐步迈向产业化、集约化及机械化等原因,驴的使用范围已经由役用逐步转化为肉用、奶用及药用等。驴作为一种单胃草食动物,其胃肠道结构和功能与反刍动物以及杂食动物不同,具有独特性^[2]。驴的盲肠发酵功能是研究其营养与饲料最重要的一类指标,但由于活体试验动物数量大、试验周期长、环境参数变异大且成本高等因素,研究工作常受到限制。因此,对于盲肠发酵的真实情况可采取体外法进行模拟,即将缓冲液、发酵底物及盲肠液在厌氧容器中按一定比例混合并加入培养装置进行固定时间的培养,以研究饲粮底物的降解情况和微生物合成量。该方法可以在体外一定程度地重现盲肠内的消化过程,具有操作简单、省时省力的特点^[3]。

目前我国面临着粮食资源紧缺、蛋白质资源及饲料原料供应不足的问题,蛋白质利用率低,已经严重阻碍了畜牧业的发展。已有研究表明,动物无法完全消化吸收过量摄取的蛋白质,同时这些过量蛋白质会以氮的形式随粪便和尿液排出体外,最终导致环境的局部氮堆积和氮污染^[4]。为了有效利用蛋白质饲料资源并减少氮排放,近年来,低粗蛋白质(CP)饲粮补充氨基酸(AA)已成为畜禽生产营养与应用研究的热点。马罗莹等^[5]研究表明,低CP饲粮在不影响肉鸡生长性能的同时,还能显著提高CP、粗脂肪(EE)和干物质(DM)的利用率,适度降低1~10日龄肉仔鸡饲粮的CP水平并补加AA,可有效提高机体对营养物质的吸收代谢能力。基于奶牛的研究也表明,在补加AA的基础上适当降低饲粮CP水平不会影响奶牛产奶性能,且能同时减少氮排泄^[6]。郭凯等^[7]研究表明,荷斯坦公犊牛饲粮CP水平从22%降到19%时,对瘤胃发酵类型及门水平和属水平上的瘤胃菌群的影响均不显著。以上研究结果表明,适当降低饲粮CP水平同时补加AA,在不降低生产性能的情况下,可以提高营养物质肠道吸收率进而提高经济效益。目前,低CP饲粮补充AA在驴上的研究鲜见报道,张士敏^[8]给断奶驴驹分别饲喂CP水平为12.10%、13.95%、15.85%的饲粮,发现饲喂12.10%CP水平饲粮的驴驹对营养物质消化代谢的效果最佳。

因此,本试验利用“体外三步法”研究低CP饲粮补充AA(蛋氨酸+赖氨酸)对驴体外营养物质降解和盲肠发酵的影响规律,研究低CP饲粮补充AA对驴盲肠发酵功能的调控作用,通过比较体外营养物质降解率、盲肠发酵参数,以期筛选出适宜CP水平的饲粮,为低CP饲粮补充AA在驴生产中的应用、提高驴养殖业经济效益、缓解我国畜牧业中蛋白质饲料资源紧缺及降低动物源氮排放提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

纤维分析仪(200i,ANKOM,美国)、自动凯氏定氮仪(K9840,Hanon,中国)、微生物发酵微量产气仪(AGRS-Ⅲ,AGRS,中国)、体外培养装置(DAISY INCUBATOR,ANKOM,美国)、酶标仪(SynergyH1,BioTek,美国)、冷冻离心机(5810R,Eppendorf,德国)、气相色谱仪(GC-2014型,岛津,日本)、手持便携式pH计(CT-6022型,CT,中国)、滤袋(F57,ANKOM,美国)等。

1.2 盲肠液供体动物

所有试验程序和动物保护方案均经过内蒙古农业大学实验动物福利与伦理委员会的批准,批准号为NND2022115。

挑选年龄为4岁(体重230~240 kg)的健康成年德州母驴作为盲肠液的供体。空腹状态下屠宰后立即将盲肠内容物用2层纱布过滤后放入事先预热至39 ℃并通入CO₂的保温瓶中,运送到实验室备用。

1.3 试验设计

采用2×4二因素完全随机试验设计,因素1为AA补充,分为未补充AA(不添加赖氨酸和蛋氨酸)和补充AA(添加赖氨酸与蛋氨酸),补充AA的试验处理分别添加不同水平赖氨酸(0.07%、0.13%、0.20%、0.25%)和蛋氨酸(0.01%、0.02%、0.04%、0.05%);因素2为4个CP水平,分别为13.5%、12.5%、11.5%、10.5%(其中12.5%为正常CP水平,由课题组前期试验结果得出),共设8个处理,每个处理6个重复。采用体外三步法(胃蛋白酶-胰酶-盲肠液法),研究低CP饲粮补充AA对驴的体外营养物质降解率及盲肠发酵特性的影响,饲粮精粗比为30∶70,其组成及营养水平如表1所示。

表1 饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of diets (air-dry basis) %

项目 Items	未补充氨基酸No AA supplementation				补充氨基酸AA supplementation
项目 Items	13.5%CP	12.5%CP	11.5%CP	10.5%CP	13.5%CP	12.5%CP	11.5%CP	10.5%CP
原料Ingredients
谷草Millet straw	16.50	16.50	16.50	16.50	16.50	16.50	16.50	16.50
玉米秸秆Corn stover	16.50	16.50	16.50	16.50	16.50	16.50	16.50	16.50
苜蓿干草Alfalfa hay	27.00	27.00	27.00	27.00	27.00	27.00	27.00	27.00
玉米青贮Corn silage	10.00	10.00	10.00	10.00	10.00	10.00	10.00	10.00
玉米Corn	9.50	11.00	13.00	18.50	9.36	10.80	12.50	18.00
豆粕Soybean meal	9.00	6.00	3.00	1.00	9.00	6.00	3.00	1.00
麸皮Bran	8.00	9.50	10.50	7.00	8.06	9.55	10.76	7.20
干酒糟及其可溶物DDGS	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
膨化全脂大豆 Extruded full-fat soybean	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
预混料Premix¹⁾	1.50	1.50	1.50	1.50	1.50	1.50	1.50	1.50
蛋氨酸Met					0.01	0.02	0.04	0.05
赖氨酸Lys					0.07	0.13	0.20	0.25
合计Total	100.00	100.00	100.00	100.00	100.00	100.00	100.00	100.00
营养水平Nutrient levels²⁾
消化能DE/(MJ/kg)	11.08	11.04	11.01	11.10	11.07	11.02	10.97	11.06
粗蛋白质CP	13.50	12.50	11.50	10.50	13.50	12.50	11.50	10.50
粗脂肪EE	5.50	5.63	5.76	5.91	5.50	5.63	5.76	5.91
中性洗涤纤维NDF	47.81	48.10	48.22	46.93	47.81	48.10	48.22	46.93
酸性洗涤纤维ADF	27.94	28.00	28.00	27.49	27.94	28.00	28.00	27.49
钙Ca	1.27	1.28	1.28	1.29	1.27	1.28	1.28	1.29
磷P	0.33	0.33	0.33	0.29	0.33	0.33	0.33	0.29
蛋氨酸Met	0.18	0.17	0.15	0.14	0.19	0.19	0.19	0.19
赖氨酸Lys	0.82	0.76	0.69	0.64	0.89	0.89	0.89	0.89

1)每千克预混料含有 One kg of the premix contained the following: VA 270 000 IU,VD 65 000 IU,VE 2 000 IU,烟酰胺 nicotinamide 710 mg,Zn 3 500 mg,Mn 2 570 mg,Fe 2 350 mg,Mg 1 350 mg,Cu 360 mg,I 40 mg,Se 18 mg,Co 15 mg。
2)消化能参考《中国饲料成分及营养价值表(2021年第32版)》计算得出,其余均为实测值。DE was calculated referring to Tables of Feed Composition and Nutritive Values in China (32nd edition,2021), while the others were measured values.

1.4 体外培养液的配制

模拟胃液的配制:将0.9 mL浓盐酸注入蒸馏水中定容至1 L,配制成稀盐酸溶液,然后将1 g胃蛋白酶溶解在1 L盐酸溶液中,得到模拟胃液。

模拟小肠液的配制:在烧杯中称量9.47 g Na₂HPO₄和9.08 g KH₂PO₄,分别溶解在蒸馏水中并定容至1 L,将2种溶液按915∶85的比例混合,得到磷酸盐缓冲液。将3 g胰酶和1 mL细菌生长抑制剂(0.5%氯霉素溶液)溶于1 L磷酸盐缓冲液中,得到模拟小肠液。

体外盲肠液的配制:400 mL盲肠液、1 330 mL缓冲液A和266 mL缓冲液B。

Menke缓冲液的配制:参考Menke等^[9]方法。

Kansas缓冲液的配制:用于饲粮样品的体外降解过程,配制方法参考武霞霞等^[10],包括溶液A和溶液B。将10 g KH₂PO₄、0.5 g MgSO₄·7H₂O、0.5 g NaCl、0.1 g CaCl₂·2H₂O、0.5 g尿素溶解后定容至1 L得到溶液A;将15 g Na₂CO₃、1 g Na₂S·9H₂O溶解后定容至1 L得到溶液B。

1.5 测定指标与方法

1.5.1 胃-小肠及胃-小肠-盲肠体外营养物质降解率

胃-小肠及胃-小肠-盲肠体外营养物质降解率参考Gargallo等^[11]建立的MTSP法测定。操作过程参考DaisyⅡ培养箱使用说明书,每罐中放6个样品袋,隔板两侧每侧各3个。取6.50 g的试验饲粮装入尼龙袋,用尼龙线系紧,在模拟胃液中培养1 h后,再于模拟小肠液中培养24 h,收集残渣用于测定胃-小肠的DM降解率和营养物质降解率;重复上述步骤,继续在体外盲肠液中培养48 h,收集残渣用于测定胃-小肠-盲肠的DM降解率和营养物质降解率。DM、CP、EE、钙(Ca)和磷(P)含量的测定分别参考GB/T 6435—2014、GB/T 6432—2018、GB/T 6433—2006、GB/T 6436—2018、GB/T 6437—2018中方法,中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量的测定参考Van Soest等^[12]的方法,AA含量参照GB/T 18246—2019中的方法,使用L-8900型氨基酸自动分析仪测定。某营养物质的降解率计算公式如下:

A(%)= $m 1 x 1 - m 2 x 2 m 1 x 1$ 。

式中:A为营养物质降解率;m₁为降解前饲粮样重(g);x₁为降解前饲粮某营养物质含量(%);m₂为降解后的饲粮残渣重(g);x₂为降解后饲粮残渣中某营养物质含量(%)。

1.5.2 盲肠体外发酵指标与产气量

准确称取发酵底物(8种不同CP水平的饲粮经胃-小肠消化后的残渣)1.00 g于容积为100 mL的经高压灭菌的发酵瓶中,打开微生物发酵仪软件,将过滤后的盲肠液与Menke缓冲液按1∶2的比例混合,然后向每个发酵瓶中加入60 mL液体,此步骤中CO₂贯穿整个过程,然后在39 ℃下连续培养48 h。培养结束后加碎冰置于冰浴中停止发酵。

用单层纱布过滤发酵液30 mL于离心管中,采用手持便携式pH计测定pH。同时,采用比色法测定氨态氮(NH₃-N)含量^[13];考马斯亮蓝法与差速离心法测定菌体蛋白(BCP)含量;气相色谱法测定挥发性脂肪酸(VFA)含量^[14];利用微生物发酵微量产气记录仪记录实时产气量。

1.6 数据统计与分析

试验数据采用SAS 9.4软件进行二因素设计的MIXED程序分析,混合模型包括AA、CP水平主效应以及AA与CP水平的互作效应,Duncan氏多重比较分析不同处理之间的差异。P<0.01表示差异极显著,P<0.05表示差异显著,P>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 低CP饲粮补充AA对胃-小肠体外营养物质降解率的影响

如表2所示,与未补充AA处理相比,补充AA处理极显著提高胃-小肠CP、EE的降解率(P<0.01),显著提高DM的降解率(P<0.05)。与12.5%CP和13.5%CP处理相比,10.5%CP和11.5%CP处理极显著降低CP降解率(P<0.01),12.5%CP与13.5%CP处理间差异不显著(P>0.05)。

表2 低CP饲粮补充AA对胃-小肠体外营养物质降解率的影响

Table 2 Effects of AA supplementation of low CP diets on degradation rate of nutrients in stomach-small intestine in vitro

项目 Items		干物质 DM/%	粗蛋白质 CP/% DM	粗脂肪 EE/% DM	中性洗涤纤维 NDF/% DM	酸性洗涤纤维 ADF/% DM
氨基酸AA	粗蛋白质水平CP level/%
-	13.5	59.98	89.32^Aa	55.01	37.41	34.94
	12.5	58.90	89.20^Aa	53.73	36.23	33.88
	11.5	58.87	88.31^Aa	51.54	36.79	35.82
	10.5	58.39	85.94^Bb	58.86	35.66	36.13
+	13.5	60.51	91.07^Aa	60.49	37.50	35.39
	12.5	60.27	91.57^Aa	59.88	38.55	37.01
	11.5	60.12	88.90^Bb	61.20	37.71	37.44
	10.5	60.18	87.69^Bb	61.21	36.43	36.16
主效应Main effects
氨基酸 AA	-	59.14^b	88.39^B	55.63^B	36.52	35.35
	+	60.28^a	90.00^A	60.72^A	37.55	36.53
粗蛋白质水平 CP level/%	13.5	60.28	90.19^Aa	57.50	37.45	35.21
	12.5	59.68	90.38^Aa	57.15	37.39	35.76
	11.5	59.81	88.61^Bb	58.44	37.25	36.63
	10.5	59.58	86.81^Cc	60.04	36.05	36.14
SEM		0.428	0.518	2.238	1.030	1.159
P值 P-value	氨基酸AA	0.021	<0.001	0.007	0.178	0.201
	粗蛋白质水平CP level	0.528	<0.001	0.552	0.497	0.614
	氨基酸×粗蛋白质水平 AA×CP level	0.762	0.397	0.614	0.749	0.640

-表示未添加氨基酸,+表示添加氨基酸。同列数据肩标无字母或相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P≤0.05),不同大写字母表示差异极显著(P≤0.01)。下表同。

“-” indicates no AA supplementation, and “+” indicates AA supplementation. In the same column, values with no letter or the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P≤0.05), and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P≤0.01). The same as below.

2.2 低CP饲粮补充AA对胃-小肠-盲肠体外营养物质降解率的影响

如表3所示,与未补充AA处理相比,补充AA处理极显著提高胃-小肠-盲肠DM、EE、NDF和ADF的降解率(P<0.01),显著提高CP的降解率(P<0.05)。与11.5%CP和10.5%CP处理相比,13.5%CP处理极显著提高CP降解率(P<0.01),11.5% CP和12.5% CP处理间差异不显著(P>0.05);与13.5%CP处理相比,10.5%CP处理显著提高EE降解率(P<0.05)。

表3 低CP饲粮补充AA对胃-小肠-盲肠体外营养物质降解率的影响

Table 3 Effects of AA supplementation of low CP diets on degradation rate of nutrients in stomach-small intestine-cecum in vitro

项目 Items		干物质 DM/%	粗蛋白质 CP/% DM	粗脂肪 EE/% DM	中性洗涤纤维 NDF/% DM	酸性洗涤纤维 ADF/% DM
氨基酸AA	粗蛋白质水平CP level/%
-	13.5	69.67	93.68^Aa	67.10^b	47.94	46.19
	12.5	70.01	93.33^ABab	70.01^ab	49.18	47.27
	11.5	69.78	92.57^Bb	70.71^ab	51.08	48.72
	10.5	70.79	91.25^Cc	73.89^a	49.52	47.89
+	13.5	72.35	94.02^a	72.66	51.71^ab	50.31
	12.5	72.81	93.59^ab	75.60	53.57^ab	52.01
	11.5	72.62	93.18^ab	75.64	54.71^a	52.51
	10.5	72.62	92.70^b	76.56	50.68^b	49.55
主效应Main effects
氨基酸 AA	-	70.06^B	92.71^b	70.42^B	49.36^B	47.47^B
	+	72.61^A	93.37^a	75.14^A	52.67^A	51.09^A
粗蛋白质水平 CP level/%	13.5	70.89	93.85^Aa	69.88^b	49.82	48.25
	12.5	71.41	93.46^ABab	72.55^ab	51.37	49.64
	11.5	71.07	92.87^Bb	73.17^ab	53.06	50.79
	10.5	71.52	91.97^Cc	75.22^a	50.10	48.72
SEM		0.969	0.358	1.624	1.369	1.498
P值 P-value	氨基酸AA	0.001	0.012	0.001	0.002	0.002
	粗蛋白质水平CP level	0.893	<0.001	0.034	0.128	0.432
	氨基酸×粗蛋白质水平 AA×CP level	0.959	0.339	0.810	0.659	0.755

2.3 低CP饲粮补充AA对体外盲肠发酵pH,NH₃-N和BCP含量的影响

如表4所示,与未补充AA处理相比,补充AA处理极显著提高NH₃-N、BCP含量(P<0.01)。13.5%CP处理的BCP含量极显著高于其他处理(P<0.01),10.5%CP和11.5%CP处理间差异不显著(P>0.05)。

表4 低CP饲粮补充AA对体外盲肠发酵pH,NH₃-N和BCP含量的影响

Table 4 Effects of AA supplementation of low CP diets on pH, NH₃-N and BCP contents in cecum fermentation in vitro

项目 Items		pH	氨态氮 NH₃-N/(mg/dL)	菌体蛋白 BCP/(mg/dL)
氨基酸AA	粗蛋白质水平CP level/%
-	13.5	6.78	10.19^b	22.42^Aa
	12.5	6.77	10.87^ab	19.85^Aa
	11.5	6.77	11.60^a	15.43^Bb
	10.5	6.76	10.12^b	13.40^Bb
+	13.5	6.80	12.98	23.96^Aa
	12.5	6.78	12.37	20.01^Bb
	11.5	6.78	12.40	16.70^Bb
	10.5	6.81	12.35	17.88^Bb
主效应Main effects
氨基酸 AA	-	6.77	10.66^B	17.65^B
	+	6.79	12.55^A	19.79^A
粗蛋白质水平 CP level/%	13.5	6.79	11.58	23.34^Aa
	12.5	6.77	11.62	19.92^Bb
	11.5	6.77	12.00	16.13^Cc
	10.5	6.79	11.01	15.40^Cc
SEM		0.026	0.464	1.010
P值 P-value	氨基酸AA	0.243	<0.001	0.009
	粗蛋白质水平CP level	0.856	0.489	<0.001
	氨基酸×粗蛋白质水平AA×CP level	0.830	0.213	0.282

2.4 低CP饲粮补充AA对体外盲肠发酵产气量的影响

如表5所示,饲粮中CP水平和是否补充AA对不同时间点的产气量均无显著影响(P>0.05)。

表5 低CP饲粮补充AA对体外盲肠发酵产气量的影响

Table 5 Effects of AA supplementation of low CP diets on gas production in cecum fermentation in vitro mL

项目Items		3 h	6 h	9 h	12 h	24 h	48 h
氨基酸AA	粗蛋白质水平CP level/%
-	13.5	1.94	3.54	5.62	9.65	21.47	24.02
	12.5	1.83	3.56	4.78	8.47	21.41	22.56
	11.5	1.93	2.80	3.69	5.39	17.96	18.44
	10.5	2.19	3.94	4.94	10.13	22.44	24.16
+	13.5	1.97	3.23	3.77	5.82	18.98	19.78
	12.5	1.97	3.65	5.08	9.24	21.01	24.27
	11.5	1.85	3.08	4.10	7.28	18.21	19.69
	10.5	2.14	4.43	6.94	13.31	25.38	25.74
主效应Main effects
氨基酸 AA	-	1.98	3.43	5.12	8.71	21.08	22.65
	+	1.98	3.65	5.15	9.18	21.07	22.44
粗蛋白质水平 CP level/%	13.5	1.95	3.44	5.00	8.12	20.47	22.32
	12.5	1.91	3.60	4.90	8.73	21.23	23.32
	11.5	1.88	2.94	4.14	6.79	18.11	19.19
	10.5	2.16	4.21	6.45	11.72	23.91	24.95
SEM		0.215	0.700	1.220	2.396	2.690	2.608
P值 P-value	氨基酸AA	0.993	0.688	0.883	0.798	0.995	0.916
	粗蛋白质水平CP level	0.611	0.390	0.356	0.244	0.245	0.225
	氨基酸×粗蛋白质水平 AA×CP level	0.964	0.964	0.765	0.587	0.815	0.687

2.5 低CP饲粮补充AA对体外盲肠发酵VFA、TVFA含量与乙酸/丙酸的影响

如表6所示,与未补充AA处理相比,补充AA处理极显著提高乙酸、丙酸、异丁酸、异戊酸和TVFA含量(P<0.01),显著提高戊酸含量(P<0.05)。与12.5%CP处理相比,10.5%CP处理极显著提高丙酸和TVFA含量(P<0.01),显著提高乙酸含量(P<0.05),13.5%CP和11.5%CP处理间差异不显著(P>0.05);CP水平和补充AA对丁酸含量、乙酸/丙酸均无显著影响(P>0.05)。

表6 低CP饲粮补充AA对体外盲肠发酵 VFA、TVFA含量与乙酸/丙酸的影响

Table 6 Effects of AA supplementation of low CP diets on VFA, TVFA contents and acetic/propionic acid in cecum fermentation in vitro

项目 Items		乙酸 Acetic acid/ (mmol/L)	丙酸 Propionic acid/ (mmol/L)	异丁酸 Isobutyric acid/ (mmol/L)	丁酸 Butyric acid/ (mmol/L)	异戊酸 Isovaleric acid/ (mmol/L)	戊酸 Valeric acid/ (mmol/L)		总挥发性脂肪酸 TVFA/ (mmol/L)		乙酸/丙酸 Acetic acid/ propionic acid
氨基酸 AA	粗蛋白质水平 CP level/%
-	13.5	22.16	4.89^b	0.23	1.32	0.25	0.26		29.12		4.60
	12.5	21.60	4.64^b	0.20	1.25	0.23	0.26		28.18		4.76
	11.5	22.43	4.81^b	0.23	1.29	0.26	0.28		29.31		4.69
	10.5	24.48	5.30^a	0.20	1.36	0.22	0.28		31.84		4.74
+	13.5	23.74^b	5.02	0.24^b	1.26	0.26	0.36^a		30.88^b		4.54
	12.5	24.68^b	5.07	0.23^b	1.30	0.27	0.27^b		31.84^b		4.70
	11.5	24.26^b	5.18	0.30^ab	1.31	0.29	0.29^b		31.63^b		4.56
	10.5	28.66^a	5.46	0.48^a	1.44	0.29	0.30^ab		36.64^a		4.62
主效应Main effects
氨基酸 AA	-	22.67^B	4.91^B	0.21^B	1.31	0.24^B	0.27^b	29.61^B		4.70
	+	25.34^A	5.18^A	0.31^A	1.33	0.28^A	0.30^a	32.75^A		4.60
粗蛋白质水平 CP level/%	13.5	22.95^b	4.96^Bb	0.23	1.29	0.26	0.31	30.00^Bb		4.58
	12.5	23.14^b	4.85^Bb	0.22	1.28	0.25	0.27	30.01^Bb		4.74
	11.5	23.35^b	5.00^Bb	0.26	1.30	0.28	0.28	30.47^Bb		4.63
	10.5	26.57^a	5.38^Aa	0.34	1.40	0.26	0.29	34.24^Aa		4.69
SEM		1.200	0.140	0.047	0.073	0.017	0.018	1.283		0.176
P值 P-value	氨基酸AA	0.003	0.009	0.005	0.625	0.003	0.022	0.001		0.495
	粗蛋白质水平 CP level	0.012	0.003	0.060	0.339	0.439	0.181	0.004		0.870
	氨基酸× 粗蛋白质水平 AA×CP level	0.682	0.654	0.020	0.802	0.346	0.065	0.642		0.996

3 讨论

3.1 低CP饲粮补充AA对体外营养物质降解率的影响

目前,通过补加AA降低饲粮CP水平以提高CP利用效率,减少氮排放,已成为畜禽生产营养与应用研究的热点,但此方法在猪和牛的领域研究应用较多,在驴上的研究甚少。营养物质降解率是反映动物对饲粮在胃肠道消化吸收情况的重要指标。涂瑞^[15]在牦牛上的研究结果表明,饲粮CP水平从14.99%降低至12.98%并添加过瘤胃赖氨酸,显著提高了CP和NDF的消化吸收率。李国栋^[16]在荷斯坦后备母牛的研究上表明,将饲粮CP水平从14.6%降低至11.6%,并以过瘤胃保护形式添加蛋氨酸、亮氨酸和异亮氨酸时,没有降低后备牛的生长性能,反而在一定程度上提高了饲粮的消化和吸收效率。Lee等^[17]研究发现,将奶牛饲粮中的CP水平从15.7%降至13.5%,并添加过瘤胃赖氨酸、蛋氨酸和组氨酸后,不仅没有降低奶牛的生产性能,还明显提高了氮利用率。综上所述,这些研究结果说明在补充AA的基础上适当降低饲粮CP水平,可提高营养物质消化率,不仅能提高动物生产性能,有效节约蛋白质资源,还能减少环境污染,进而提高经济效益,但目前关于驴的研究报道甚少,有待于进一步研究。

体外三步法(胃蛋白酶-胰酶-盲肠液法)是体外评价驴饲料资源营养价值的有效方法^[18-19],本试验利用体外三步法探讨了低CP饲粮补充AA是否可替代正常CP水平的饲粮,明确其对驴体外营养物质降解和盲肠发酵的影响规律,结果得出:在胃-小肠-盲肠中,补充AA极显著提高DM、EE、NDF和ADF的降解率,显著提高CP的降解率。与11.5%CP和10.5%CP处理相比,13.5%CP处理极显著提高CP降解率,11.5%CP和12.5%CP处理间差异不显著,表明添加蛋氨酸和赖氨酸能改善其消化功能,提高对饲粮中各营养物质的降解和消化吸收利用效率。降低饲粮CP水平后,CP降解率也随之降低,但补充AA后有所提高,可能是因为胃肠道环境得到改善,提高了饲粮CP的利用率。与正常CP水平(12.5%CP)相比,11.5%CP和10.5%CP处理的DM、EE、NDF和ADF降解率均无显著变化,提示降低饲粮CP水平不会影响DM、EE、NDF和ADF的降解率。

3.2 低CP饲粮补充AA对体外盲肠发酵参数的影响

驴盲肠非常发达,是一种后肠道发酵动物,微生物在其中发酵、分解和消化纤维素,发挥着与反刍动物瘤胃类似的作用。目前关于驴盲肠发酵的研究很少。赵红艳^[18]和梁婷玉等^[19]利用体外法以盲肠体外发酵能力作为评价驴粗饲料组合效应指标时,均直接采用饲料原料作为发酵底物进行体外盲肠发酵,而本试验则是通过比较研究不同饲粮经胃-小肠降解后的残渣在驴盲肠的体外发酵参数,更贴近驴的消化生理特点,从盲肠发酵参数角度评定低CP饲粮补充AA的营养价值,为低CP饲粮在驴养殖中的应用提供理论依据。

pH是维持盲肠内环境稳态的重要指标之一,微生物活动的pH在5.5~7.5^[20],只有当pH维持在有利于肠道微生物生存的正常范围内,盲肠内的发酵才能正常进行。在本试验中,发酵液的pH在6.66~6.93,说明盲肠体外发酵环境均处于稳定状态。NH₃-N含量范围为6.3~27.5 mg/dL^[21],是微生物生长的最佳浓度,NH₃-N含量过高会导致氮的损失,含量过低则会阻碍微生物的正常生长和繁殖^[21]。李红丽^[22]研究结果表明,低CP水平(12%)饲粮能够显著降低牦牛BCP含量,但对NH₃-N含量无显著影响。本试验中盲肠发酵液的NH₃-N含量均在正常范围内,说明低CP饲粮不会对盲肠NH₃-N含量造成负面影响,进而不会影响盲肠微生物。NH₃-N作为合成BCP的主要氮源,BCP浓度会随着NH₃-N浓度提高而增加,但NH₃-N会随着被微生物利用、机体吸收和代谢等方式逐渐减少^[21]。本试验得出,13.5%CP处理的BCP含量极显著高于其他处理,10.5%CP和11.5%CP处理间差异不显著。这说明高CP水平饲粮的可利用氮源高于正常和低CP水平饲粮,而10.5%CP和11.5%CP处理的可利用氮源无显著差异。驴的低CP饲粮若仅降低CP水平而未优化原料选择和AA平衡,会出现因氮源供应不足导致CP降解率和BCP含量下降的问题,然而,本试验通过补充必需AA,可在低CP水平下维持CP消化效率及后肠微生物活性,实现环保与营养的双重目标。

赖氨酸作为底物参与蛋白质的生物合成,动物对氨基酸的采食量决定了体内蛋白质的合成与沉积速度^[23]。研究发现,赖氨酸缺乏时会极显著增加肠道中的有害菌大肠杆菌数量,极显著降低有益菌乳酸杆菌数量,提示赖氨酸缺乏引起了肠道菌群的失衡,使肠道中有害菌数量增加而使有益菌数量减少,不利于动物的生长^[24]。本试验中,在相同CP水平下,补充AA后,CP降解率和NH₃-N含量均提高,原因是补充AA后提供了额外的氮源,使氮水平一定程度增加,为合成CP和NH₃-N提供了更多的氮源。另外,通过补充AA可能改善了盲肠微生物的群落组成,提高了微生物合成BCP的效率。Dicks等^[25]研究指出,乳酸菌是胃肠道尤其是盲肠微生物的主要组成部分,产生大部分VFA和抗菌肽等抗菌化合物,防止病原体的生长,保持胃肠道中健康的微生物平衡。在泌乳驴的研究上表明,饲粮CP水平由12.5%降低到11%并补充AA,对产奶效率、能量代谢率、氮代谢率、蛋白质生物学价值和大多数的血清生化指标、血浆中必需AA含量均没有显著影响,并提高了能量校正乳、无脂固形物校正乳和乳蛋白合成效率^[26]。至于补充AA是否存在AA浪费的情况还有待进一步研究,后续可以设置更多的AA添加水平,以探究最优的AA添加量。

产气量在体外发酵过程中是衡量饲粮可消化性的一个重要指标。研究表明,产气量增加表明微生物活性增加,从而导致饲粮降解率增加^[27]。VFA在草食动物体内扮演着主要能量来源的角色,其中包括乙酸、丙酸和丁酸,它们是微生物在消化和代谢过程中产生的主要VFA物质,综合占据了TVFA的95%^[28]。乙酸可用来合成乳脂和体脂,丙酸有助于葡萄糖的运输和储存,丁酸则在被吸收后为细胞提供能量^[29]。全英凯^[30]研究发现,饲粮CP水平周期性波动对奶牛泌乳性能没有显著影响,饲喂14.04%低CP饲粮提高奶牛的EE、NDF、ADF表观消化率,同时也提高了瘤胃乙酸和丁酸的含量。占金舜等^[31]在饲粮CP水平对山羊瘤胃参数的研究中发现,15.23% CP水平组的VFA含量显著高于22.87% CP水平组,可能是因为高CP水平组饲粮中易发酵的碳水化合物含量相对减少,导致VFA含量降低。易琼等^[32]研究发现,在CP水平为10%的低CP饲粮中添加过瘤胃赖氨酸,对NH₃-N、TVFA含量无显著影响。以上结果表明,低CP饲粮能够改善瘤胃发酵,减少饲粮能量损失。本试验结果得出:补充AA极显著提高乙酸、丙酸、异丁酸、异戊酸和TVFA含量,显著提高戊酸含量。与正常CP水平(12.5%CP)相比,10.5%CP处理极显著提高丙酸和TVFA含量,显著提高乙酸含量。以上结果表明:降低饲粮CP水平的同时补充AA,促进了盲肠微生物对饲粮的发酵利用。

体外盲肠液发酵产生的气体主要来源于饲粮中的碳水化合物和蛋白质,在正常pH下,饲粮中可发酵成分越多,微生物的活性越高,产气量也越多^[33]。试验盲肠液发酵过程中,降低饲粮CP水平对产气量无显著影响,进一步说明低CP水平(10.5%、11.5%)饲粮并不会降低盲肠发酵效果。

4 结论

① 与未补充AA相比,补充AA处理极显著提高DM、EE、NDF和ADF的胃-小肠-盲肠降解率,显著提高CP降解率;极显著提高NH₃-N含量,仍在微生物生长的最佳范围内;极显著提高BCP和TVFA含量。

② 饲粮CP水平从12.5%降低至10.5%,对DM、EE、NDF和ADF的胃-小肠-盲肠降解率均无显著影响,但一定程度上降低了CP的降解率;对NH₃-N含量无显著影响;10.5%CP和11.5%CP处理的BCP含量极显著降低,但处理间差异不显著;极显著提高TVFA含量。

综合各项指标,以10.5%CP饲粮补充AA对驴体外营养物质降解率及盲肠发酵作用效果更好。

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DOI

ZHAN

J S

, LIU

, ZHAN

Y P

, et al. Effects of dietary protein level on meat quality,serum enzyme activity and intestinal develpment of Guangfeng goats[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2021, 33(3):1493-1502. (in Chinese)

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