Chinese Journal of Animal Nutrition >

2025 , Vol. 37 >Issue 8: 5547 - 5559

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.450

RESEARCH PAPER

Study on Regulating Effects of Macroalgae on Methane Emissions from Rumen Fermentation in Vitro

  • CUI Jiajun , 1, 2 ,
  • LIU Yunlong 2 ,
  • LI Xiaopeng 3 ,
  • CHENG Shuru , 1, * ,
  • TU Yan , 2, *
Expand
  • 1 College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China
  • 2 Key Laboratory of Feed Biotechnology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Feed Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
  • 3 Beijing Key Laboratory of Dairy Cow Nutrition, College of Animal Science and Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China
*CHENG Shuru, professor, E-mail: ; TU Yan, professor, E-mail:

Received date: 2024-12-23

  Online published: 2025-08-14

Fold

Abstract

This experiment was conducted to investigate the effects of adding different macroalgae on rumen methane (CH4) emissions in dairy cows through in vitro fermentation experiments. In experiment 1, five species of macroalgae were collected from the southern coastal waters of China, including Asparagopsis taxiformis, Colpomenia sinuosa, Sargassum 1, Sargassum 2 and Eucheuma. Each macroalga was added at four different doses [0 (control), 2%, 6% and 10%, organic matter basis), with three replicates per dose. In experiment 2, the bromoform was added to the diet at four different doses [0 (control), 0.01%, 0.03% and 0.05%, organic matter basis), with three replicates per dose. After 24 h in vitro fermentation, the gas and fermentation broth were collected for the determination of gas production parameters and rumen fermentation parameters. The results showed as follows: 1) compared with the control treatment, the addition of different doses of Asparagopsis taxiformis significantly reduced the total gas production (TGP), as well as the production of CH4 and carbon dioxide (CO2) (P<0.05), and the reduction was decreased linearly with the increase of the addition dose (P<0.05); among them, the inhibition rate of CH4 by adding 2% Asparagopsis taxiformis was 96%, and the hydrogen (H2) production was significantly increased at the same time (P<0.05). Compared with the control treatment, the addition of 10% Asparagopsis taxiformis significantly reduced the total volatile fatty acid (TVFA) content (P<0.05); the addition of different doses of Asparagopsis taxiformis significantly reduced the acetic acid proportion and the ratio of acetic acid to propionic acid (P<0.05), and significantly increased the proportions of propionic acid, butyric acid and valeric acid (P<0.05); the addition of 6% and 10% Asparagopsis taxiformis significantly reduced the contents of ammonia nitrogen (NH3-N) and microbial protein (MCP) (P<0.05). 2) Compared with the control treatment, the addition of different doses of Colpomenia sinuosa significantly reduced the TGP and CO2 production (P<0.05), and the reduction was decreased linearly with the increase of the addition dose (P<0.05); the addition of 10% Colpomenia sinuosa significantly reduced the CH4 production (P<0.05), while the addition of 6% and 10% Colpomenia sinuosa significantly increased the H2 production (P<0.05); the addition of different doses of Colpomenia sinuosa had no significant effect on the contents of TVFA and MCP (P>0.05), but significantly increased the acetic acid proportion and the ratio of acetic acid to propionic acid (P<0.05). 3) Compared with the control treatment, the addition of two species of Sargassum had no significant effect on the gas production parameters and the contents of TVFA, NH3-N and MCP (P>0.05). 4) Compared with the control treatment, the addition of 6% and 10% Eucheuma significantly reduced the contents of TGP and MCP (P<0.05). 5) Compared with the control treatment, the addition of different doses of bromoform significantly reduced the TGP and production of CH4 and CO2 (P<0.05), significantly increased the H2 production (P<0.05), and significantly reduced the NH3-N content (P<0.05). In conclusion, under in vitro fermentation conditions, the addition of Asparagopsis taxiformis, Colpomenia sinuosa and bromoform can inhibit the ruminal CH4 production and modify the rumen fermentation pattens, whereas Sargassum and Eucheuma do not exhibit anti-methanogenic effects.

Key words： macroalgae; methane reduction; in vitro; rumen fermentation parameters

Cite this article

CUI Jiajun , LIU Yunlong , LI Xiaopeng , CHENG Shuru , TU Yan . Study on Regulating Effects of Macroalgae on Methane Emissions from Rumen Fermentation in Vitro[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2025 , 37(8) : 5547 -5559 . DOI: 10.12418/CJAN2025.450

近年来,全球气温持续上升,地表温度相较工业化前高出1.1 ℃,人类活动导致的温室气体排放量增加进一步加剧了当前的气候危机[1]。甲烷(CH4)作为仅次于二氧化碳(CO2)的第二大温室气体,其增温潜势是CO2的28倍[2]。另外,CH4被归类为“短期气候污染物”,在大气中的存续时间相对较短(约为12年)[3],实施针对性CH4减排干预措施可显著减缓短期内温室气体上升趋势。在农业活动中,反刍动物是主要的CH4排放源,其排放不仅加剧了温室效应,还导致2%~12%的饲粮能量损失[4]。因此,实现反刍动物CH4减排具有显著的生态效益和经济效益。研究者已开发出多种减排策略,其中CH4抑制剂的研发备受关注。目前已开发的CH4抑制剂主要集中在植物提取物、电子受体(硝酸盐和硫酸盐)、益生菌和酶制剂等[5-6]。然而,大多数减排调控物质的CH4抑制效果都相对有限,通常在10%左右。而针对甲基辅酶M还原酶的特异性抑制剂3-硝基氧基丙醇(3-nitrooxypropanol,3-NOP),表现出30%左右的CH4抑制效果[7]。
探究大型海藻瘤胃减排效果成为近几年的研究热点,且主要集中在紫衫状海门冬(Asparagopsis taxiformis)上。Kinley等[8]通过体外试验发现,紫衫状海门冬在饲粮添加量为2%有机物(OM)下可以降低98%的CH4产生。Roque等[9]在肉牛饲粮中添加0.5% OM紫衫状海门冬降低了69.8%的CH4,表明紫衫状海门冬具备强效的CH4抑制潜力。有研究证明,紫衫状海门冬对CH4的抑制能力是由于卤代甲烷类似物的存在,溴仿已被证明是紫衫状海门冬中含量最多的卤代甲烷类似物[10],可能是其主要的抗产CH4化合物[11]。在体外条件下,添加紫衫状海门冬显著降低了瘤胃总产气量(total gas production,TGP)和总挥发性脂肪酸(total volatile fatty acid,TVFA)含量[12],可能会影响瘤胃正常发酵功能。Stefenoni等[13]研究发现,添加紫衫状海门冬影响了泌乳奶牛干物质采食量和产奶量。另外,添加海藻对动物机体健康和畜产品残留等方面仍然存在争议,需要更多研究评估。全球海藻的种类多达12 000种,但只有221种被认为具有商业价值,而能够实现集约化种植的种类更少[14]。我国拥有丰富的海藻资源,但是关于海藻用于瘤胃CH4减排的研究非常有限,尚处于起步阶段。因此,本试验采收我国南方海域多种海藻资源,通过体外发酵试验进行瘤胃CH4减排效果评估,并探究溴仿是否为紫衫状海门冬中主要的抗产CH4物质,旨在为我国海藻资源作为新型饲料添加剂的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用的5种海藻材料采收自广东省珠海市香洲区万山群岛(经度:113.38°38'E~114°19'E;纬度:21°47'N~22°10'N),新鲜海藻在采收后经过净水冲刷后,进行分离编号、拍照和冷冻保存,然后低温运输至中国农业科学院饲料研究所实验室(北京)进行真空冷冻干燥,粉碎后保存在-20 ℃冰箱里待测。采集的5种海藻样品经形态学鉴定分别为紫衫状海门冬、囊藻、马尾藻1、马尾藻2和麒麟菜。
本试验经中国农业科学院饲料研究所动物伦理委员会批准(批准编号:IFR-CAAS20240320),瘤胃液取自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平试验基地3头健康状态良好的瘤胃瘘管奶牛。发酵底物来源于瘤胃液供体奶牛的全混合日粮(TMR),其组成及营养水平见表1。试验所用溴仿为市售产品,纯度≥99%。
表1 发酵底物组成及营养水平(干物质基础)

Table 1 Fermentation substrate composition and nutrient levels (DM basis) %

项目Items 含量Content
原料Ingredients
苜蓿干草Alfalfa hay 20.00
全株玉米青贮Whole corn silage 40.00
精料补充料Concentrate supplement 40.00
合计Total 100.00
营养水平Nutrient levels
粗蛋白质CP 16.37
粗脂肪EE 2.91
中性洗涤纤维NDF 31.66
酸性洗涤纤维ADF 17.98
钙Ca 1.15
磷P 0.36

营养水平为实测值。

Nutrient levels were measured values.

1.2 试验设计

试验1:分别在2 g的发酵底物中添加0(对照)、2%、6%和10% OM的5种大型海藻,每个处理设置3个重复,添加剂量参考Romero等[10]的研究。
试验2:分别在2 g的发酵底物中添加0(对照)、0.01%、0.03%和0.05% OM的溴仿(以紫衫状海门冬中溴仿含量确定溴仿添加剂量),每个处理设置3个重复。

1.3 体外发酵培养

采用ANKOM RFS产气测量系统(ANKOM Technology,美国)用于体外发酵培养。参照Menke等[15]的方法配制瘤胃缓冲液,将瘤胃液与缓冲液按照1∶2的比例混匀;将混合后的瘤胃液转移至发酵罐中,并放入台式温控摇床(THZ-C,太仓市豪诚实验仪器制造优先公司),振荡频率为80 r/min,39 ℃条件下发酵24 h;收集发酵产生的气体并转移到5 mL气袋中用于气体成分分析,发酵液摇匀后装入10 mL离心管并储存于-20 ℃冰箱,待测瘤胃发酵参数。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 常规营养成分含量的测定

发酵底物中干物质(DM)含量采用GB/T 6435—2014中方法测定;粗蛋白质(CP)含量参照GB/T 6432—2018中方法,采用杜马斯全自动定氮仪[Dumatec 8000,福斯华(北京)科贸有限公司]测定;粗脂肪(EE)含量参照GB/T 6433—2006中方法,采用全自动脂肪仪(XT15i,ANKOM Technology,美国)测定;中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量分别参照GB/T 20806—2022和NY/T 1459—2022中方法,采用全自动纤维测定仪(A2000i,ANKOM Technology,美国)测定;钙(Ca)和磷(P)含量分别参照GB/T 6436—2018和GB/T 6437—2018中方法测定。

1.4.2 TGP的测定

采用ANKOM RFS产气测量系统(ANKOM Technology,美国)测定产气量,每隔5 min使用压力传感器记录每个发酵瓶的累积压力,监测24 h,TGP计算公式如下:

TGP(mL)=n×22.4×1 000;

n=P(V/RT)。

式中:n为以摩尔为单位产生的气体量(mol);P为GMS软件记录的累积压力(psi);V为玻璃瓶顶部空间体积(L);T为开尔文温度(K);R为气体含量=8.314 472 L/(kPa·mol)。

1.4.3 气体成分分析

体外发酵24 h后,收集集气袋中的气体,参照曹庆云等[16]的方法,采用气相色谱仪(GC112A,上海仪电科学仪器股份有限公司)测定气体中各组分含量。

1.4.4 氨态氮(NH3-N)、微生物蛋白(MCP)和挥发性脂肪酸(VFA)含量的测定

采用微孔板分光光度计(Epoch,北京百伯瑞科技有限公司),参照冯宗慈等[17]的碱性次氯酸钠-苯酚分光光度法测定发酵液中NH3-N含量,采用考马斯亮蓝法[18]测定MCP含量;参照团体标准T/NAIA 005—2020,采用气相色谱仪(7890B,Agilent Technology,美国)测定发酵液VFA及各组分含量。

1.4.5 海藻中溴仿含量的测定

取海藻样品0.22 g,加甲醇10 mL,超声水浴30 min,600×g离心30 min。采用气相色谱质谱仪(Trace1310 ISQ,Thermo,美国),柱温初始温度设置为40 ℃,保持1 min,然后以16 ℃/min的速率升至250 ℃,保持2 min;进样口温度设置为250 ℃,载气流速为1.0 mL/min;离子源温度和传输线温度为230 ℃,扫描模式为选择离子扫描(selected ion monitor,SIM)。海藻中溴仿含量见表2。
表2 不同大型海藻中溴仿含量

Table 2 Bromoform content in different macroalgae mg/g

项目
Item		 紫衫状海门冬
Asparagopsis taxiformis		 囊藻
Colpomenia sinuosa		 马尾藻1
Sargassum 1		 马尾藻2
Sargassum 2		 麒麟菜
Eucheuma
溴仿Bromoform 28.245 0.113 0.016 0.020 0.006

1.5 数据统计与分析

试验数据采用Excel 2016进行初步整理,然后采用SAS 9.0软件的一般线性模型(GLM)进行单因素方差分析(one-way ANOVA),差异显著时采用Duncan氏法进行多重比较;采用多项式对比分析来评估线性和二次效应。结果数据以平均值和均值标准误(SEM)表示, P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 不同大型海藻对体外瘤胃发酵气体产量和成分的影响

由表3可知,在体外发酵24 h后,与对照处理相比,添加不同剂量紫衫状海门冬均显著降低TGP以及CH4和CO2产量(P<0.05),且随着添加剂量增加呈线性降低(P<0.05);其中,添加2%紫衫状海门冬CH4抑制率为96%,同时显著提高氢气(H2)产量(P<0.05),且H2产量随着添加剂量增加呈线性降低(P<0.05);添加不同剂量囊藻显著降低TGP和CO2产量(P<0.05),且随着添加剂量增加呈线性降低(P<0.05);添加10%囊藻显著降低CH4产量(P<0.05),添加6%和10%囊藻显著提高H2产量(P<0.05);添加6%和10%麒麟菜显著降低TGP(P<0.05);添加马尾藻对气体产量和成分无显著影响(P>0.05)。
表3 不同大型海藻对体外瘤胃发酵气体产量和成分的影响

Table 3 Effects of different macroalgae on gas production and composition during in vitro rumen fermentation

项目
Items		 添加剂量Addition dose/% OM 均值
标准误
SEM		 P值P-value
0(对照
Control)		 2 6 10 处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic

紫衫状海门冬
Asparagopsis
taxiformis		 总产气量
TGP/(mL/g)		 157.30a 140.10b 128.70c 125.60c 2.264 <0.001 <0.001 <0.001
氢气
H2/(mL/g)		 0.35d 16.90a 15.74b 14.94c 0.615 <0.001 <0.001 <0.001
二氧化碳
CO2/(mL/g)		 99.17a 92.32b 80.40c 75.65d 0.962 <0.001 <0.001 0.162
甲烷
CH4/(mL/g)		 22.57a 0.93b 0.64b 0.46b 0.418 <0.001 <0.001 <0.001
甲烷/总产气量
CH4/TGP/%		 14.35a 0.66b 0.50b 0.37b 0.287 <0.001 <0.001 0.162
氢气/总产气量
H2/TGP/%		 0.22b 12.07a 12.23a 11.88a 0.362 <0.001 <0.001 <0.001

囊藻
Colpmenia sinuosa		 总产气量
TGP/(mL/g)		 192.70a 166.60b 167.90b 158.40c 1.841 <0.001 <0.001 <0.001
氢气
H2/(mL/g)		 0.43b 0.37b 0.66a 0.71a 0.049 <0.001 <0.001 0.144
二氧化碳
CO2/(mL/g)		 119.10a 98.66b 94.81bc 85.93c 5.206 0.001 <0.001 0.155
甲烷
CH4/(mL/g)		 24.66a 21.81ab 21.13ab 19.51b 1.372 0.032 0.006 0.545
甲烷/总产气量
CH4/TGP/%		 12.80 13.09 12.58 12.32 0.841 0.843 0.494 0.676
氢气/总产气量
H2/TGP/%		 0.22b 0.22b 0.39a 0.45a 0.028 <0.001 <0.001 0.173

马尾藻1
Sargassum 1		 总产气量
TGP/(mL/g)		 151.20 154.14 153.68 149.23 3.625 0.529 0.594 0.187
氢气
H2/(mL/g)		 0.15 0.18 0.18 0.23 0.037 0.246 0.068 0.821
二氧化碳
CO2/(mL/g)		 85.26 93.83 89.13 85.68 3.320 0.104 0.751 0.034
甲烷
CH4/(mL/g)		 17.96 20.09 19.40 18.38 0.824 0.111 0.841 0.027
甲烷/总产气量
CH4/TGP/%		 11.88 13.03 12.62 12.32 0.374 0.076 0.467 0.026
氢气/总产气量
H2/TGP/%		 0.10 0.12 0.12 0.15 0.026 0.242 0.070 0.699

马尾藻2
Sargassum 2		 总产气量
TGP/(mL/g)		 160.90 161.70 158.70 156.90 4.305 0.684 0.299 0.687
氢气
H2/(mL/g)		 0.04 0.08 0.09 0.12 0.041 0.290 0.070 0.883
二氧化碳
CO2/(mL/g)		 92.62 90.40 86.77 86.57 4.408 0.488 0.157 0.755
甲烷
CH4/(mL/g)		 20.96 21.57 20.91 20.36 0.968 0.675 0.440 0.421
甲烷/总产气量
CH4/TGP/%		 13.03 13.34 13.18 12.98 0.432 0.675 0.440 0.421
氢气/总产气量
H2/TGP/%		 0.03 0.05 0.06 0.08 0.027 0.299 0.074 0.889

麒麟菜
Eucheuma		 总产气量
TGP/(mL/g)		 160.91a 164.02a 154.55b 150.79b 2.334 0.002 0.001 0.071
氢气
H2/(mL/g)		 0.18 0.47 0.33 0.91 0.467 0.479 0.205 0.667
二氧化碳
CO2/(mL/g)		 84.96 87.36 84.64 82.52 3.245 0.554 0.356 0.354
甲烷
CH4/(mL/g)		 20.68 20.82 19.38 18.92 1.098 0.290 0.089 0.706
甲烷/总产气量
CH4/TGP/%		 12.85 12.69 12.54 12.55 0.835 0.978 0.704 0.872
氢气/总产气量
H2/TGP/%		 0.11 0.16 0.21 0.19 0.297 0.456 0.187 0.640

同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05),不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 不同大型海藻对体外瘤胃发酵VFA的影响

由表4可知,在体外发酵24 h后,与对照处理相比,添加10%紫衫状海门冬显著降低TVFA含量(P<0.05);添加不同剂量紫衫状海门冬均显著降低乙酸比例和乙丙比(P<0.05),并显著提高丙酸、丁酸和戊酸比例(P<0.05),且随着添加剂量增加呈线性变化(P<0.05);添加囊藻和马尾藻对TVFA含量均无显著影响(P>0.05),其中添加不同剂量囊藻显著提高乙酸比例和乙丙比(P<0.05);添加不同剂量麒麟菜有降低TVFA含量的趋势,但差异不显著(P>0.05)。
表4 不同大型海藻对体外瘤胃发酵VFA的影响

Table 4 Effects of different macroalgae on VFA during in vitro rumen fermentation

项目
Items		 添加剂量Addition dose/% OM 均值
标准误
SEM		 P值P-value
0(对照
Control)		 2 6 10 处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic

紫衫状海门冬
Asparagopsis
taxiformis		 总挥发性脂肪酸
TVFA/(mmol/L)		 94.75a 84.87ab 83.80ab 79.71b 3.776 0.022 0.005 0.310
乙酸
Acetic acid/%		 62.27a 53.68b 53.40bc 53.18c 0.127 <0.001 <0.001 <0.001
丙酸
Propionic acid/%		 21.47d 26.45a 25.42b 24.39c 0.149 <0.001 <0.001 <0.001
乙丙比
A/P		 2.90a 2.03d 2.10c 2.18b 0.020 <0.001 <0.001 <0.001
丁酸
Butyric acid/%		 14.51d 17.83c 19.08b 20.23a 0.178 <0.001 <0.001 <0.001
戊酸
Valeric acid/%		 1.74b 2.05a 2.10a 2.20a 0.095 0.007 0.002 0.162

囊藻
Colpmenia
sinuosa		 总挥发性脂肪酸
TVFA/(mmol/L)		 129.50 123.40 130.30 126.20 7.287 0.769 0.899 0.856
乙酸
Acetic acid/%		 57.81b 60.05a 60.35a 59.94a 0.505 0.004 0.003 0.006
丙酸
Propionic acid/%		 25.24a 23.47b 23.15b 23.85b 0.487 0.010 0.017 0.006
乙丙比
A/P		 2.29b 2.56a 2.63a 2.51a 0.078 0.013 0.018 0.009
丁酸
Butyric acid/%		 14.82a 14.40b 14.48b 14.07c 0.122 0.007 0.002 0.434
戊酸
Valeric acid/%		 2.13 2.08 2.14 2.00 0.053 0.111 0.084 0.295

马尾藻1
Sargassum 1		 总挥发性脂肪酸
TVFA/(mmol/L)		 103.70 103.30 101.20 98.70 3.008 0.385 0.112 0.633
乙酸
Acetic acid/%		 59.58 59.81 60.08 59.29 0.779 0.774 0.811 0.379
丙酸
Propionic acid/%		 23.97a 23.70a 23.42a 22.72b 0.248 0.005 0.001 0.263
乙丙比
A/P		 2.49bc 2.52bc 2.57b 2.61a 0.018 <0.001 <0.001 0.857
丁酸
Butyric acid/%		 14.53 14.58 14.61 14.44 0.209 0.859 0.721 0.486
戊酸
Valeric acid/%		 1.92 1.91 1.89 3.56 1.172 0.445 0.223 0.345

马尾藻2
Sargassum 2		 总挥发性脂肪酸
TVFA/(mmol/L)		 110.58 102.08 119.64 100.92 6.838 0.082 0.612 0.322
乙酸
Acetic acid/%		 62.15 62.50 62.76 60.98 1.510 0.670 0.518 0.349
丙酸
Propionic acid/%		 22.49 21.55 21.50 22.41 0.855 0.537 0.916 0.165
乙丙比
A/P		 2.76 2.90 2.92 2.72 0.163 0.629 0.946 0.217
丁酸
Butyric acid/%		 13.67 14.30 14.13 14.93 0.637 0.320 0.109 0.842
戊酸
Valeric acid/%		 1.70 1.65 1.62 1.67 0.049 0.509 0.470 0.232

麒麟菜
Eucheuma		 总挥发性脂肪酸
TVFA/(mmol/L)		 99.92ab 98.74ab 105.20a 93.42b 3.086 0.033 0.217 0.042
乙酸
Acetic acid/%		 60.88 61.16 61.44 61.60 0.396 0.357 0.093 0.805
丙酸
VPropionic acid/%		 21.59 21.57 20.73 21.35 0.657 0.553 0.469 0.513
乙丙比
A/P		 2.82 2.83 2.96 2.88 0.118 0.557 0.529 0.357
丁酸
Butyric acid/%		 15.59 15.31 15.88 15.12 0.416 0.353 0.544 0.450
戊酸
Valeric acid/%		 1.94 1.96 1.95 1.95 0.126 0.998 0.966 0.891

2.3 不同大型海藻对体外瘤胃发酵NH3-N和MCP含量的影响

由表5可知,在体外发酵24 h后,与对照处理相比,添加6%和10%紫衫状海门冬显著降低NH3-N和MCP含量(P<0.05),并随着添加剂量增加呈线性降低(P<0.05);添加囊藻对MCP含量无显著影响(P>0.05);添加马尾藻对NH3-N和MCP含量均无显著影响(P>0.05);添加麒麟菜对NH3-N含量无显著影响(P>0.05),添加6%和10%麒麟菜显著降低MCP含量(P<0.05)。
表5 不同大型海藻对体外瘤胃发酵NH3-N和MCP含量的影响

Table 5 Effects of different macroalgae on NH3-N and MCP contents during in vitro rumen fermentation mg/dL

项目
Items		 添加剂量Addition dose/% OM 均值
标准误
SEM		 P值P-value
0(对照
Control)		 2 6 10 处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic

紫衫状海门冬
Asparagopsis
taxiformis		 氨态氮NH3-N 16.34a 16.86a 11.24b 6.51c 1.199 0.005 0.002 0.024
微生物蛋白MCP 25.54a 23.68a 15.78b 14.98b 2.931 0.010 0.002 0.631

囊藻
Colpmenia
sinuosa		 氨态氮NH3-N 14.13 9.85 11.14 9.74 1.549 0.071 0.042 0.228
微生物蛋白MCP 22.31 17.53 22.10 19.97 3.256 0.465 0.818 0.581

马尾藻1
Sargassum 1		 氨态氮NH3-N 17.33 16.27 17.41 18.39 0.990 0.281 0.206 0.184
微生物蛋白MCP 35.17 29.61 35.28 33.12 3.839 0.460 0.970 0.549

马尾藻2
Sargassum 2		 氨态氮NH3-N 16.10 15.68 16.37 16.01 1.319 0.092 0.925 0.975
微生物蛋白MCP 25.90 25.48 30.35 26.60 4.573 0.696 0.638 0.611

麒麟菜Eucheuma		 氨态氮NH3-N 17.45 18.76 18.73 18.56 1.083 0.606 0.388 0.347
微生物蛋白MCP 21.41a 20.71ab 12.40c 14.84bc 2.561 0.020 0.009 0.411

2.4 溴仿对体外瘤胃发酵气体产量和成分的影响

由表6可知,在体外发酵24 h后,与对照处理相比,添加不同剂量溴仿均显著降低TGP以及CH4和CO2产量(P<0.05),且随着添加剂量增加呈线性降低(P<0.05);其中,添加0.01%溴仿CH4抑制率达到99%,并显著提高H2产量(P<0.05),同时H2产量随着添加剂量增加呈线性降低(P<0.05)。
表6 溴仿对体外瘤胃发酵气体产量和成分的影响

Table 6 Effects of bromoform on gas production and composition during in vitro rumen fermentation

项目
Items		 添加剂量Addition dose/% OM 均值
标准误
SEM		 P值P-value
0(对照
Control)		 0.01 0.03 0.05 处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic
总产气量TGP/(mL/g) 164.95a 140.74b 130.92c 127.10c 3.550 <0.001 <0.001 0.004
氢气H2/(mL/g) 0.48d 14.55a 10.79b 9.76c 0.423 <0.001 <0.001 <0.001
二氧化碳CO2/(mL/g) 98.12a 85.24b 73.46c 75.39c 3.377 <0.001 <0.001 0.015
甲烷CH4/(mL/g) 19.74a 0.15b 0.08b 0.11b 0.329 <0.001 <0.001 <0.001
甲烷/总产气量CH4/TGP/% 11.97a 0.11b 0.06b 0.08b 0.117 <0.001 <0.001 <0.001
氢气/总产气量H2/TGP/% 0.29d 10.33a 8.24b 7.67c 0.208 <0.001 <0.001 <0.001

2.5 溴仿对体外瘤胃发酵参数的影响

由表7可知,在发酵24 h后,与对照处理相比,添加0.01%溴仿显著降低乙酸比例和乙丙比(P<0.05),显著提高丙酸和丁酸比例(P<0.05);添加0.03%和0.05%溴仿显著降低乙酸和丙酸比例(P<0.05),显著提高丁酸比例(P<0.05);添加不同剂量溴仿显著降低NH3-N含量(P<0.05),并随着添加剂量增加呈线性降低(P<0.05);添加不同剂量溴仿对MCP含量无显著影响(P>0.05)。
表7 溴仿对体外瘤胃发酵参数的影响

Table 7 Effects of bromoform on fermentation parameters in vitro rumen fermentation

项目
Items		 添加剂量Addition dose/% OM 均值
标准误
SEM		 P值P-value
0(对照
Control)		 0.01 0.03 0.05 处理
Treatment		 线性
Linear		 二次
Quadratic
总挥发性脂肪酸TVFA/(mmol/L) 100.97 81.08 79.61 81.70 8.585 0.110 0.061 0.108
乙酸Acetic acid/% 60.70a 53.53c 54.18bc 54.93b 0.333 <0.001 <0.001 <0.001
丙酸Propionic acid/% 23.80b 26.54a 22.01c 19.71d 0.250 <0.001 <0.001 <0.001
乙丙比A/P 2.55b 2.02c 2.46b 2.79a 0.044 <0.001 <0.001 <0.001
丁酸Butyric acid/% 13.34d 17.73c 21.35b 23.43a 0.182 <0.001 <0.001 <0.001
戊酸Valeric acid/% 2.17b 2.20b 2.46a 1.94c 0.037 <0.001 0.007 <0.001
氨态氮NH3-N/(mg/dL) 18.51a 10.90b 10.05bc 9.12c 0.448 <0.001 <0.001 <0.001
微生物蛋白MCP/(mg/dL) 27.39 26.13 31.18 33.40 2.797 0.103 0.031 0.404

3 讨论

3.1 不同大型海藻对体外瘤胃发酵气体产量和成分的影响

TGP作为体外发酵体系中评价反刍动物瘤胃微生物发酵的重要指标,综合反映了营养物质的发酵程度和降解特性[19]。在反刍动物的瘤胃中,微生物利用纤维素、半纤维素等结构性碳水化合物的过程中会产生大量的H2和 CO 2 [20],瘤胃产甲烷菌通过沃尔夫(Wolfe)循环使用H2作为电子供体将CO2还原为C H 4 [21]。本试验中,添加紫衫状海门冬显著降低了TGP和CH4产量,表明紫衫状海门冬对瘤胃CH4的产生具有特异性抑制作用,但同时也对瘤胃发酵过程产生了一定的影响。Machado等[22]研究发现,添加紫衫状海门冬能够使瘤胃产甲烷菌的相对丰度显著降低,说明紫衫状海门冬可能会通过影响产甲烷菌的生长活性,从而抑制瘤胃CH4的生成。瘤胃内的氢主要被产甲烷菌用于合成CH4,当CH4生成受到抑制后,H2产量通常会显著升高[23]。本试验中同样观察到,在添加紫衫状海门冬后,在CH4产量降低的同时伴随着H2产量的升高。另外,添加囊藻显著降低了TGP,表明囊藻可能会对瘤胃发酵有负面影响。虽然添加囊藻也显著降低了CH4产量,但是CH4与TGP的比例随着添加剂量增加没有显著变化,说明CH4产量下降主要归因于TGP的降低,囊藻可能并不具备特异性抑制CH4产生的效果。Machado等[24]研究发现,添加囊藻同样降低了TGP和CH4产量,与本试验结果一致。而添加马尾藻对TGP以及CH4产量的影响不大,与Machado等[24]研究结果一致。在Widiawati等[25]的研究中,添加麒麟菜降低了TGP和CH4产量,说明添加麒麟菜可能会影响瘤胃发酵。在本试验中同样观察到,添加麒麟菜对TGP造成了负面影响。

3.2 不同大型海藻对体外瘤胃发酵VFA的影响

VFA是瘤胃发酵过程中产生的主要短链脂肪酸,其中对动物代谢最重要的乙酸、丙酸和丁酸,占瘤胃VFA产量的95%[26]。VFA是饲粮中碳水化合物在瘤胃中厌氧发酵的产物,是反刍动物生产活动主要的能量来源[27]。因此,VFA的含量和组成直接反映了瘤胃的发酵效率和能量利用水平。本试验中,添加不同剂量紫衫状海门冬显著降低乙酸比例,显著提高丙酸、丁酸和戊酸比例。研究表明,乙酸的生成会提高瘤胃内的H2含量,为产甲烷菌提供充足的底物,进而促进CH4的生成[28]。丙酸生成则是耗氢的过程,通过与产甲烷菌竞争性利用H2而降低CH4产生[29]。添加紫衫状海门冬后,能够发现瘤胃发酵模式趋向于丙酸型发酵,与瘤胃CH4的减少表现一致。O’Hara等[30]研究发现,紫衫状海门冬降低了纤维降解菌和产挥发酸菌的相对丰度。笔者推测,在本试验中添加紫衫状海门冬可能影响瘤胃微生物群落结构,进而影响VFA发酵模式。在Indugu等[23]的研究中,添加海门冬能够直接影响产丁酸菌(如丁酸弧菌属、Moryella和真杆菌属),提高丁酸比例,与本试验结果一致。添加囊藻对TVFA含量没有影响,但显著提高了乙丙比,说明添加囊藻使瘤胃发酵模式趋向于乙酸型发酵。而Machado等[24]在试验中添加囊藻降低了TVFA含量和乙丙比,这可能与囊藻的菌种差异有关。添加麒麟菜降低了TVFA含量,说明麒麟菜会对瘤胃发酵产生影响,与TGP降低的结果一致。

3.3 不同大型海藻对体外瘤胃发酵NH3-N和MCP含量的影响

瘤胃中的NH3-N是微生物生长的主要氮源,其含量反映了瘤胃微生物分解饲粮CP产生NH3-N和利用NH3-N合成MCP的动态平衡[31]。作为反刍动物代谢蛋白质的主要来源之一,MCP的生成直接影响动物的氮供给[32]。研究表明,NH3-N含量的升高通常意味着瘤胃蛋白质降解率的提高或者微生物对NH3-N利用率的降低,NH3-N含量过高或过低都不利于瘤胃微生物的生长和代谢[33]。本试验中,添加6%和10%紫衫状海门冬显著降低NH3-N和MCP含量,说明添加一定剂量紫衫状海门冬可能对瘤胃微生物氮代谢产生负面影响。NH3-N作为合成MCP的前体物质,其含量降低可能进一步限制了MCP的生成。笔者推测,添加紫衫状海门冬可能改变了瘤胃中与氮代谢相关的微生物活性,但需要进一步研究验证。相比之下,添加囊藻虽降低了NH3-N含量,但对MCP含量没有显著影响,这与Machado等[24]研究结果一致。这表明添加囊藻可能仅影响了氮的释放,但对氮的利用效率并未产生较大影响。此外,添加麒麟菜降低了MCP含量,结合麒麟菜降低了TGP以及TVFA含量,表明麒麟菜可能会通过影响瘤胃发酵过程,降低微生物对氨的利用效率,从而抑制MCP的合成。

3.4 溴仿对体外瘤胃发酵产气和发酵参数的影响

卤代甲烷类似物溴仿已被证明具有抗产CH4活性,这归因于它们能与还原型维生素B12结合的能力,通过抑制CH4释放过程中的钴胺依赖性甲基转移酶步骤,进而影响产CH4路径[34]。Paul等[35]研究发现,溴仿是紫衫状海门冬的主要抗产CH4活性化合物,溴仿含量直接影响紫衫状海门冬的CH4抑制效果。本试验结果显示,添加低剂量(0.01%)的溴仿显著降低TGP和CH4产量,显著提高H2产量,并降低乙丙比和NH3-N含量,与添加低剂量(2%)的紫衫状海门冬对瘤胃发酵的表现基本一致。由此推测,溴仿可能是紫衫状海门冬降低CH4产量的主要活性物质。值得注意的是,添加高剂量(0.03%和0.05%)的溴仿显著降低了丙酸比例,鉴于溴仿具有抗菌作用[35],其可能会抑制产丙酸菌的代谢活性,导致氢代谢受阻,进而引起H2产量的下降。而添加高剂量的紫衫状海门冬表现出类似的丙酸抑制效应与H2产量下降,O’Hara等[30]研究发现,添加紫衫状海门冬降低了产丙酸菌的相对丰度,说明紫衫状海门冬可能会影响瘤胃发酵。Muizelaar等[36]研究表明,溴仿不会在动物组织中残留,但会通过乳汁和尿液排出体外。Li等[37]研究发现,饲喂紫衫状海门冬的绵羊瘤胃乳头变钝,黏膜层具有不同大小的结节增生区域,因而仍需要开展大量动物试验证明其在动物生产中的安全性。

4 结论

在体外发酵条件下,添加紫衫状海门冬和溴仿均表现出强效的瘤胃CH4抑制效果,其中添加2%紫衫状海门冬,CH4抑制率能够达到96%;囊藻虽有降低CH4产量的趋势,但主要归因于TGP的降低;而马尾藻和麒麟菜并没有表现出抑制CH4产生的效果。综上所述,紫衫状海门冬和囊藻具有CH4抑制效果,但是仍需要进一步开展体内试验来验证在动物生产中的安全性。

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