Chinese Journal of Animal Nutrition >

2025 , Vol. 37 >Issue 8: 5667 - 5680

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.460

RESEARCH PAPER

Screening and Identification of Yak Rumen Cellulose-Degrading Bacteria and Optimization of Enzyme Production Conditions

  • WANG Yongben , 1, 2 ,
  • LU Boyu 1, 2 ,
  • ZHANG Peng 1, 2 ,
  • YAO Youli 1, 3, 4 ,
  • WU Guofang 1, 3, 4 ,
  • ZHANG Jianbo 1, 3, 4 ,
  • LUO Xuan 1, 3, 4 ,
  • WANG Lei , 1, 2, *
Expand
  • 1 College of Animal Husbandry and Veterinary Science, Qinghai University, Xining 810016, China
  • 2 Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science for Plateau Grazing Livestock of Qinghai Province, Qinghai University, Xining 810016, China
  • 3 Key Laboratory of Conservation and Innovative Utilisation of Genetic Resources of Plateau Livestock of Qinghai Province, Xining 810016, China
  • 4 Key Laboratory of Livestock and Poultry Genetics and Breeding in Qinghai-Tibetan Plateau of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Xining 810016, China
*associate professor, E-mail:

Received date: 2025-01-27

  Online published: 2025-08-14

Fold

Abstract

This experiment was conducted to screen and identify probiotics with high cellulase activity from the rumen of yaks, providing a reference for their subsequent application as feed additives in animal husbandry. In the experiment, LB-carboxymethyl cellulose solid medium and Congo red staining were used to isolate and preliminarily screen the cellulase-producing bacteria. Then, the dinitrosalicylic acid (DNS) method was used for re-screening to obtain bacteria with high cellulase activity. Finally, the morphological, physiological and biochemical, molecular biological and probiotic identification were conducted on them, and the enzyme production conditions were optimized. The results showed as follows: 1) a total of 10 strains with the ability to degrade cellulose were screened and obtained in the experiment. Among them, 5 strains were Bacillus amyloliquefaciens, 3 strains were Bacillus licheniformis, and 2 strains belonged to Bacillus. 2) The activities of exoglucanase and endoglucanase of strain YR3.2 (as Bacillus amyloliquefaciens) were significantly higher than those of the other strains (P<0.05), which were 78.09 and 54.69 U/mL, respectively. 3) Except for a few strains that were resistant to tetracycline and erythromycin, most strains were susceptible to eight antibiotics and had good inhibitory effects on Escherichia coli and Staphylococcus aureus. None of the 10 strains contained the virulence factor genes of ace, gelE and cylA. The surface hydrophobicity rate and self-agglutination rate of strain YR3.2 were the highest, which were 97.55% and 80.84%, respectively. 4) The optimal combination of enzyme production conditions for strain YR3.2 was initial pH of 7.0, time of 36 h, and temperature of 35 ℃. Under these conditions, the carboxymethyl cellulase activity was 72.78 U/mL. After 7 days of liquid fermentation, the loss rates of rapeseed straw and oat straw were 18.52% and 23.34%, respectively. In conclusion, strain YR3.2 has high cellulase activity and probiotic properties, and can be used as a candidate strain in forage processing and animal husbandry.

Key words： yaks; rumen; cellulose-degrading bacteria; cellulase; probiotic properties; optimization of enzyme production conditions

Cite this article

WANG Yongben , LU Boyu , ZHANG Peng , YAO Youli , WU Guofang , ZHANG Jianbo , LUO Xuan , WANG Lei . Screening and Identification of Yak Rumen Cellulose-Degrading Bacteria and Optimization of Enzyme Production Conditions[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2025 , 37(8) : 5667 -5680 . DOI: 10.12418/CJAN2025.460

2023年中央一号文件提出,要建立健全秸秆等农业副产物的收集利用体系,同时大力发展青贮饲料,加快推进秸秆养畜。我国是世界畜牧生产大国,同时也是世界饲料需求大国,但仍面临饲料短缺的问题[1],特别是蛋白质饲料缺乏,粗饲料质量较差。我国农作物数量众多,其中秸秆产出量位居世界第一,其产量占世界秸秆总产量的1/5[2]。秸秆作为饲料来喂养动物具有一定的营养价值,但大多数秸秆具有蛋白质含量低、纤维含量高以及含有抗营养因子的缺点[3]。秸秆饲料化需要对秸秆进行处理,传统的处理方式是氨化和碱化等处理,这种处理方式效率低且可能对环境造成污染。
纤维素降解菌广泛分布在自然界土壤和农业环境中。目前研究者已从各种环境中分离出嗜热/嗜碱纤维素降解菌[4]。纤维素降解菌包括需氧菌(如假单胞菌和放线菌)、兼性厌氧菌(如芽孢杆菌和纤维素单胞菌)以及严格厌氧菌(如梭菌)[5]。郭琪等[6]从秸秆与土壤混合物中筛选出1株水稻秸秆降解细菌。邹鑫等[7]从双叉犀金龟(Trypoxylus dichotomus)幼虫肠道中筛选出3株纤维素降解菌,其中2株为枯草芽孢杆菌,1株为沙福芽孢杆菌。反刍动物主要以粗饲料为主,因此其瘤胃与粪便中具有高效降解纤维素的菌株。杨金波等[8]以青海天然牧场的牛、羊粪为研究对象,筛选出1株具有降解不同秸秆能力的菌株。陈欢等[9]从肉牛瘤胃液、肉牛粪便以及蝗虫肠道中筛选出15株纤维素降解能力较强的株系。采用微生物法来处理秸秆能降解纤维素、改善饲粮适口性和减少环境污染[10],因此筛选具有降低纤维素的菌株对开发和利用秸秆饲料资源具有重要意义。
牦牛是青藏高原当地居民主要的蛋白质和经济收入来源。高海拔和寒冷季节易导致青藏高原在冬季饲料短缺,牦牛长期处于这种环境下具备了更好的耐粗饲特性。牦牛瘤胃降解纤维素主要是通过瘤胃微生物分泌各种酶来发挥作用[11]。研究表明,与普通牛相比,牦牛瘤胃微生物能够更好地利用高纤维类饲料[12],这表明牦牛瘤胃中纤维素降解菌的丰度更高[13]。因此,从牦牛瘤胃液筛选鉴定高纤维素酶活性益生菌,能为饲料添加剂的开发利用提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 瘤胃液的采集

瘤胃液取自青海尖扎县健康放牧成年牦牛瘤胃。

1.1.2 病原菌

大肠杆菌(Escherichia coli,ATCC 30105)、沙门氏菌(Salmonella,ATCC 43971)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,ATCC 29213)均由西北农林科技大学赵辛教授实验室馈赠。

1.1.3 主要试剂

羧甲基纤维素钠购自上海麦克林生化科技股份有限公司,革兰氏染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。DNA提取试剂盒购自OMEGA公司,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.4 培养基

LB培养基:酵母浸粉5.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,氯化钠10.0 g/L,pH 7.0。
LB培养基+1%羧甲基纤维素钠:酵母浸粉5.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,氯化钠10.0 g/L,羧甲基纤维素钠 10.0 g/L,pH 7.0。
产酶发酵培养基:羧甲基纤维素钠10.0 g/L,蛋白胨20.0 g/L,酵母浸粉0.5 g/L,硫酸镁0.3 g/L,磷酸二氢钾1.5 g/L,氯化钠5.0 g/L,氯化钙0.1 g/L,吐温-80 0.1%。

1.2 试验方法

1.2.1 瘤胃液中产纤维素酶菌株的筛选

1)初筛。将瘤胃液放入灭菌后的1.5 mL离心管中,利用梯度稀释法,分别取100 μL稀释后的瘤胃液涂布于LB平板上,于37 ℃培养24 h。根据菌落形态不同,挑取不同的菌落置于液体LB培养基中。将挑取的菌落在含有1%羧甲基纤维素钠的LB平板上划线,37 ℃培养24 h,用适量0.3%的刚果红溶液进行染色20 min,之后用1 mol/L的氯化钠溶液进行脱色,将水解圈较大的菌株纯化培养后进行编号,菌株培养液与30%的甘油1∶1混合后,-80 ℃保存。
2)复筛。粗酶液的制备:将各菌株分别在液体产酶发酵培养基中培养24 h后,培养液在4 ℃条件下3 000×g离心10 min,所得上清液即为粗酶液。
采用二硝基水杨酸(DNS)法对所筛选菌株进行酶活性测定。取3支干燥洁净的20 mL具塞刻度试管,分别在试管中加入0.5 mL粗酶液和1.5 mL反应底物(外切葡聚糖酶活性测定采用微晶纤维素,内切葡聚糖酶活性测定采用羧甲基纤维素钠溶液;β-葡萄糖苷酶活性测定采用水杨苷溶液),同时另取一组已灭活的粗酶液作为空白对照。50 ℃水浴30 min后,立即向试管中各加入2 mL DNS溶液,充分摇匀后沸水浴5 min,冷却后用蒸馏水定容至20 mL,充分混匀。在540 nm波长下测定各试管溶液的吸光度(OD)值,根据葡萄糖标准曲线查相应的葡萄糖含量,并计算相应的酶活性。酶活性单位(U/mL)定义:1 mL酶液1 min内产生1 μmol还原糖的酶量作为1个酶活性单位。

1.2.2 纤维素降解菌的鉴定

1.2.2.1 菌株形态学特征

将筛选后的菌株分别接种于LB固体和液体培养基中,37 ℃培养24 h后观察菌落形状、色泽、透明度和湿润度等。挑取单菌落于载玻片上,根据革兰氏染色试剂盒进行操作,在光学显微镜下观察菌株的颜色和形态。

1.2.2.2 菌株生理生化特征

将筛选的菌株采用微量法进行生理生化特征分析,主要包括接触酶试验、明胶试验、硫化氢试验、吲哚试验及V-P试验。结果参照《常见细菌系统鉴定手册》[14]进行分析。

1.2.2.3 菌株分子生物学鉴定

将筛选的纤维素降解菌按照OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA,之后进行16S rRNA基因片段扩增并测序。细菌扩增通用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司,序列为:F,5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';R,5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'[15]。根据上述序列对基因组DNA 16S rDNA片段进行扩增,反应参数如下:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,30个循环;72 ℃终延伸。将PCR产物送至北京擎科生物科技股份有限公司西安分公司进行测序,将测序结果在NCBI中进行比对。

1.2.3 益生性试验

1.2.3.1 抗生素敏感性试验

采用药敏片对菌株的抗生素敏感性进行测定,抗生素敏感性判断标准见表1。
表1 抗生素敏感性判断标准

Table 1 Criteria for judging antibiotic sensitivity

抗生素名称
Antibiotic names		 纸片含药量
Drug content in
paper/(μg/片)		 抑菌圈直径Diameter of antibacterial zone/mm
敏感
Susceptible		 中度敏感
Intermediate		 耐受
Resistant
万古霉素Vancomycin 30 ≥15 10~14 ≤9
环丙沙星Ciprofloxacin 5 ≥21 16~20 ≤15
庆大霉素Gentamicin 10 ≥15 13~14 ≤12
氨苄西林Ampicillin 10 ≥17 13~16 ≤13
四环素Tetracycline 30 ≥19 15~18 ≤14
利福平Rifampicin 5 ≥20 17~19 ≤16
红霉素Erythromycin 15 ≥23 14~22 ≤13
氯霉素Chloramphenicol 30 ≥18 13~17 ≤12

1.2.3.2 抑菌性试验

通过琼脂扩散试验检测分离菌株对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性。

1.2.3.3 毒力因子基因表达测定

毒力因子基因包括:cylA、gelE和ace。引物序列及检测方法参考邓亚飞等[16],引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3.4 疏水性和自凝集性试验

疏水性和自凝集试验参考李奥运[17]的方法进行,其中对疏水性的测定改为将等体积的氯仿、二甲苯和菌悬液混合后涡旋2 min,室温(24 ℃)孵育15 min,吸取上层液体测定600 nm处OD值。

1.2.4 菌株产酶条件优化

选择不同时间(12、24、36、48 h)、不同温度(25、30、35、40、45 ℃)、不同初始pH(5、6、7、8、9)和不同接种量(1%、2%、3%、4%、5%)对菌株产酶条件进行优化,确定单因素条件下最佳的发酵条件。根据单因素试验的结果,设计正交试验确定最佳产酶条件。

1.2.5 液态发酵秸秆损失率

参照唐云梦[18]的方法进行试验,称取20 g秸秆粉末于离心管中,121 ℃灭菌30 min,冷却后加入40 mL灭菌后的无机盐培养基,形成液态发酵培养基。于180 r/min、35 ℃下振荡培养7 d,每个菌设定3个重复,以加无菌水处理为对照。培养结束后,离心去除上清液,将剩余样品经105 ℃烘30 min,之后通过65 ℃烘至恒重,称取发酵后的重量。秸秆损失率计算公式如下:

秸秆损失率(%)=[(m1-m2)/m1]×100。

式中:m1为接种前秸秆粉末重(g);m2为发酵7 d后秸秆粉末重(g)。

1.3 数据统计分析

试验数据经Excel 2019预处理后,采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析(one-way ANONA),并采用Duncan氏法进行多重比较;液态发酵秸秆损失率采用独立样本t检验,以P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 纤维素降解菌的筛选

2.1.1 菌株初筛

以牦牛瘤胃液作为菌源,采用LB琼脂培养基分离共获得10株菌,依次编号为YR3.2、YR2.3、YR4.1.2、YR2.3B、YR4.1、YR3.1、YR7.1、YR3.3、YR3.1.2和YR4.3。通过刚果红培养基能否产水解圈为依据进行纤维素降解菌的筛选,筛选的菌株均具有水解圈(部分菌株水解圈如图1所示),水解圈直径与菌落直径比见表2。
图1 部分菌株水解圈

Fig.1 Hydrolysis circle of some strains

表2 各菌株水解圈直径与菌落直径比

Table 2 Ratio of hydrolytic circle diameter to colony diameter of each strain

菌株编号
Strain numbers		 水解圈直径
Hydrolytic circle
diameter/mm		 菌落直径
Colony diameter/mm		 水解圈直径与菌落直径比
Ratio of hydrolytic circle diameter
to colony diameter
YR3.2 28.33 5.88 4.82
YR2.3 19.85 4.85 4.06
YR4.1.2 21.73 5.77 3.77
YR2.3B 30.04 9.81 3.06
YR4.1 29.36 8.37 3.51
YR3.1 9.74 3.72 2.62
YR7.1 18.63 4.24 4.39
YR3.3 14.81 4.89 3.03
YR3.1.2 10.62 3.46 3.07
YR4.3 9.90 3.69 2.68

2.1.2 菌株复筛

如图2所示,通过DNS法测定所筛选菌株的纤维素酶活性发现,菌株YR3.2的外切葡聚糖酶活性[(78.09±3.84) U/mL]显著高于其他各菌株(P<0.05),同时菌株YR3.2的内切葡聚糖酶活性[(54.69±1.92) U/mL]也显著高于其他各菌株(P<0.05);菌株YR4.1.2的β-葡萄糖苷酶活性[(41.15±0.62) U/mL]显著高于其他各菌株(P<0.05)。
图2 各菌株纤维素酶活性

数据柱标注不同字母表示差异显著(P<0.05),相同字母表示差异不显著(P>0.05)。图5和图6同。

Fig.2 Cellulase activity of each strain

Data columns marked with different letters indicate significant differences (P<0.05), while with the same letters indicate no significant differences (P>0.05). The same as Fig.5 and Fig.6.

2.2 产纤维素酶菌株的鉴定

2.2.1 形态学特征

本试验中,菌株YR3.2、YR2.3、YR4.1.2、YR2.3B和YR4.1在LB琼脂培养基上形态相似,边缘不规则,中间有隆起,菌落颜色为白色;菌株YR3.1、YR7.1、YR3.3、YR3.1.2和YR4.3在LB琼脂培养基上形态相似,菌落为白色且边缘整齐,表面湿润。10株菌均为革兰氏阳性杆菌。部分菌株形态如图3所示,部分菌株显微形态如图4所示。
图3 部分菌株形态

Fig.3 Morphology of some strains

图4 部分菌株显微形态

Fig.4 Micromorphology of some strains

2.2.2 生理生化特征

由表3可知,10株菌的生理生化特征相似,其中接触酶试验、明胶试验和V-P试验结果均为阳性,硫化氢试验和吲哚试验结果均为阴性。
表3 各菌株生理生化特征

Table 3 Physiological and biochemical characteristics of each strain

菌株编号
Strain numbers		 接触酶试验
Catalase test		 明胶试验
Gelatin test		 硫化氢试验
Hydrogen sulfide test		 吲哚试验
Indole test		 V-P试验
V-P test
YR3.2 + + - - +
YR2.3 + + - - +
YR4.1.2 + + - - +
YR2.3B + + - - +
YR4.1 + + - - +
YR3.1 + + - - +
YR7.1 + + - - +
YR3.3 + + - - +
YR3.1.2 + + - - +
YR4.3 + + - - +

“+”表示阳性,“-”表示阴性。

“+” means positive, and “-” means negative.

2.2.3 分子生物学鉴定

由表4可知,将筛选出的菌株测序后经NCBI数据库进行比对发现,5株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),3株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),2株属于芽孢杆菌属(Bacillus)。
表4 各菌株同源性比对结果

Table 4 Results of homology comparison of each strain

菌株编号
Strain numbers		 菌株中文名称
Chinese name
of strain		 菌株拉丁名称
Latin name of strain		 覆盖率
Fraction of
coverage/%		 同源性
Homology/%		 登录号
Accession
number
YR3.1.2 地衣芽孢杆菌 Bacillus licheniformis 99 99.70 MW672343.1
YR3.2 解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens 100 100.00 MT585518.1
YR2.3 解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens 100 100.00 OQ607799.1
YR4.1.2 解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens 100 100.00 MT579613.1
YR3.1 地衣芽孢杆菌 Bacillus licheniformis 99 99.48 OK135823.1
YR7.1 地衣芽孢杆菌 Bacillus licheniformis 100 100.00 MT642945.1
YR2.3B 解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens 100 100.00 MT233098.1
YR4.1 解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens 100 100.00 OR708670.1
YR3.3 芽孢杆菌属 Bacillus 99 98.75 MZ959557.1
YR4.3 芽孢杆菌属 Bacillus 99 98.90 OR016199.1

2.3 菌株益生性

2.3.1 抗生素敏感性

由表5可知,10株菌对万古霉素、环丙沙星、庆大霉素和氨苄西林均敏感;除菌株YR3.2对利福平中度敏感外,其他菌株对利福平均敏感;菌株YR3.2、YR2.3和YR4.1对四环素耐药,菌株YR4.1.2和YR2.3B对四环素中度敏感,其余菌株对四环素敏感;菌株YR3.1、YR3.3、YR3.1.2和YR4.3对红霉素耐药,其余菌株对红霉素敏感;菌株YR3.1、YR7.1、YR3.3、YR3.1.2和YR4.3对氯霉素中度敏感,而菌株YR3.2、YR2.3、YR4.1.2、YR2.3B和YR4.1对氯霉素敏感。
表5 各菌株抗生素敏感性

Table 5 Antibiotic sensitivity of each strain

菌株编号
Strain
numbers		 万古霉素
Vancomycin		 环丙沙星
Ciprofloxacin		 庆大霉素
Gentamicin		 氨苄西林
Ampicillin		 四环素
Tetracycline		 利福平
Rifampicin		 红霉素
Erythrocin		 氯霉素
Chloramphenicol
YR3.2 S S S S R I S S
YR2.3 S S S S R S S S
YR4.1.2 S S S S I S S S
YR2.3B S S S S I S S S
YR4.1 S S S S R S S S
YR3.1 S S S S S S R I
YR7.1 S S S S S S S I
YR3.3 S S S S S S R I
YR3.1.2 S S S S S S R I
YR4.3 S S S S S S R I

“S”表示敏感,“I”表示中度敏感,“R”表示耐受。

“S” indicates susceptible, “I” indicates intermediate, and “R” indicates resistant.

2.3.2 抑菌性

由表6可知,不同菌株对不同致病菌的抑制效果不同,除菌株YR3.3和YR4.3外,所有菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有一定的抑菌性。
表6 各菌株抑菌性

Table 6 Antibacterial properties of each strain

菌株编号
Strain numbers		 大肠杆菌
Escherichia coli
(ATCC 30105)		 金黄色葡萄球菌
Staphylococcus aureus
(ATCC 29213)		 沙门氏菌
Salmonella
(ATCC 43971)
YR3.2 ++ ++ +
YR2.3 ++ ++ +
YR4.1.2 ++ ++ +
YR2.3B ++ ++ +
YR4.1 ++ ++ +
YR3.1 ++ ++ +
YR7.1 ++ ++ +
YR3.3 + ++ +
YR3.1.2 ++ ++ +
YR4.3 ++ + +

抑菌圈直径≥7 mm表示有抑菌作用;“+”表示抑菌圈直径为7.00~9.99 mm,“++”表示抑菌圈直径为10.00~19.99 mm。

Antibacterial zone diameter ≥7 mm indicates antibacterial effect; “+” represents antibacterial zone diameter is 7.00 to 9.99 mm, and “++” represents antibacterial zone diameter is 10.00 to 19.99 mm.

2.3.3 毒力因子基因表达

以各菌株DNA作为模板,在毒力因子基因引物的作用下进行PCR扩增,10株菌均未检测到ace、gelE和cylA毒力因子基因。

2.3.4 疏水性和自凝集性

疏水性和自凝集性可以体现细菌在胃肠道中的定殖情况,数值越高表明菌株对胃肠道的吸附性越高。如图5-A所示,10株菌的表面疏水率为94.49%~97.55%,其中表面疏水率最高的菌株是YR3.2(97.55%);如图5-B所示,10株菌的自凝集率为53.32%~80.84%,其中自凝集率最高的菌株是YR3.2(80.84%)。
图5 各菌株疏水性(A)和自凝集性(B)

Fig.5 Hydrophobicity (A) and self-agglutination (B) of each strain

综合产纤维素酶能力和益生性结果,选择菌株YR3.2进行后续产酶条件的优化和液态发酵秸秆损失率测定。

2.4 菌株产酶条件优化

2.4.1 培养时间对纤维素酶活性的影响

随着培养时间的增加,菌株在培养过程中对培养基中的营养物质进行消耗,当达到一定程度时菌株不再生长,其产酶能力就会受到抑制。如图6-A所示,随着培养时间的增加,羧甲基纤维素酶活性逐渐提高,在36 h时达到最高值。
图6 菌株产酶条件单因素试验结果

Fig 6 Results of single-factor test of enzyme production conditions of strains

2.4.2 发酵温度对纤维素酶活性的影响

不同发酵温度对纤维素酶活性具有一定的影响,如图6-B所示,25~35 ℃,羧甲基纤维素酶活性随着温度的上升而逐渐上升,在35 ℃时其活性显著高于其他温度(P<0.05),达到峰值。

2.4.3 接种量对纤维素酶活性的影响

接种量与菌株的生长周期以及在实际应用中的成本有着很大的关系,如图6-C所示,在接种量为2%时,羧甲基纤维素酶活性显著高于其他接种量(P<0.05)。

2.4.4 初始pH对纤维素酶活性的影响

pH不仅会改变菌株的正常代谢活动,而且还会影响菌株发酵产物的活性。如图6-D所示,随着初始pH的升高,羧甲基纤维素酶活性呈现先升高后降低的变化趋势;当初始pH为7时,羧甲基纤维素酶性最高(69 U/mL),显著高于其他初始pH(P<0.05)。

2.4.5 正交试验结果

根据单因素试验结果可知,当接种量在2%时,羧甲基纤维素酶活性最高,但时间、温度和初始pH对羧甲基纤维素酶活性的影响更大,因此选择时间、温度和初始pH设计3因素×3水平的正交试验方案。由表7中的极差分析可知,影响羧甲基纤维素酶活性的因素由大到小依次为初始pH、时间和温度。产酶条件最佳组合为初始pH 7.0、时间36 h、温度35 ℃,此条件下羧甲基纤维素酶活性为72.78 U/mL。
表7 正交试验方案及结果

Table 7 Orthogonal test scheme and results

项目
Items		 初始pH
Initial pH		 温度
Temperature/℃		 时间
Time/h		 羧甲基纤维素酶活性
Carboxymethyl cellulase
activity/(U/mL)
处理Treatments
1 6.0 30 24 12.07
2 6.0 35 36 22.95
3 6.0 40 48 20.34
4 7.0 35 36 72.78
5 7.0 30 48 70.58
6 7.0 40 24 48.10
7 8.0 30 48 58.51
8 8.0 35 24 50.64
9 8.0 40 36 55.03
羧甲基纤维素酶活性Carboxymethyl cellulase activity/(U/mL)
平均值1 Average value 1 18.45 47.79 36.94
平均值2 Average value 2 63.82 48.06 50.25
平均值3 Average value 3 54.73 41.16 49.81
极差Range 45.37 6.90 13.32

2.5 液态发酵秸秆损失率

由表8可知,与对照相比,菌株YR3.2液态发酵均显著提高油菜秸秆和燕麦秸秆损失率(P<0.05)。
表8 液态发酵秸秆损失率

Table 8 Loss rate of straw in liquid fermentation %

项目
Items		 油菜秸秆损失率
Rape straw loss rate		 燕麦秸秆损失率
Oat straw loss rate
对照Control 2.54±0.23b 4.63±0.17b
YR3.2 18.52±0.21a 23.34±1.94a

同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)。

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3 讨论

本研究以牦牛瘤胃液为菌源共获得10株菌,其中5株为解淀粉芽孢杆菌,3株为地衣芽孢杆菌,2株为芽孢杆菌属。在10株菌中,菌株YR3.2(为解淀粉芽孢杆菌)的外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶活性显著高于其他菌株,分别为78.09和54.69 U/mL,β-葡萄糖苷酶活性为30.17 U/mL。姜立春等[19]从麦洼牦牛粪便中筛选出1株纤维素降解菌,其羧甲基纤维素酶活性为36.12 U/mL;Zhang等[20]从腐殖质土壤筛选出1株外切葡聚糖酶活性为78.59 U/mL的菌株;Khosravi等[21]从绵羊瘤胃液中筛选出1株特基拉芽孢杆菌,其羧甲基纤维素酶活性为0.827 U/mL。本研究所筛选的菌株YR3.2其纤维素酶活性要高于以上除从腐殖质土壤中筛选出的以外的菌株。
肠道菌群同宿主之间存在着相互选择的关系,从动物肠道中选择的菌株应用到动物肠道中更容易定殖[22]。而良好的益生菌应具备抗生素敏感性、抑制有害菌性以及高疏水性和自凝集性。本研究所筛选的10株菌对8种不同抗生素具有不同的敏感性,其中大多数为敏感。尹珺伊等[23]筛选的驴源芽孢杆菌中大多数菌株对多种抗生素敏感。陈童锦悦等[24]从竹鼠中筛选出的3株产纤维素酶枯草芽孢杆菌具有较低的耐药性。夏超笃等[25]对筛选的1株解淀粉芽孢杆菌进行抗生素敏感性测定,结果表明该菌株对阿莫西林不敏感。本试验所筛选的菌株来自放牧牦牛,因其饲养方式的原因,对抗生素的使用少,因此所筛选的菌株具有较高的抗生素敏感性。
益生菌可以通过产生抗菌化合物来产生抑菌性,这种方式可以抑制细菌和真菌的生长[26]。马浩天等[27]和张在等[28]所筛选的芽孢杆菌对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均具有抑制作用。本研究通过对所筛选的菌株进行体外抑菌试验,结果表明10株菌对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均具有不同的抑制效果,其中对沙门氏菌的抑制效果较差,对金黄色葡萄球菌的抑制效果较好,这与马浩天等[27]的研究结果一致。对所筛选菌株进行毒力因子基因检测发现,10株菌均不含cylA、gelE及ace毒力因子基因。研究表明,对于益生菌定殖和发挥有益作用至关重要的一个因素就是需具备高的疏水性和自凝集性,这可以使得益生菌对胃肠道具有很强的黏附性[29]。本研究所筛选的10株菌的表面疏水率和自凝集率分别在94%和50%以上,具有很强的疏水性和自聚集性,其中YR3.2的表面疏水率和自凝集率最高,分别为97.55%和80.84%,有成为益生菌的潜力。
纤维素的高效酶解依赖于内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的三维协同作用。其中,内切葡聚糖酶通过优先作用于纤维素无定形区的β-1,4糖苷键,产生可供外切酶作用的还原末端,其活性直接影响整个酶系的协同效率[30]。选择羧甲基纤维素酶作为模式内切酶进行产酶条件优化,可通过源头调控提升纤维素降解效率。不同时间、温度、接种量和初始pH都会对菌株的纤维素酶活性产生影响[8,31]。微生物生长代谢与纤维素酶合成呈现典型的分阶段特征,指数生长期以生物量快速积累为主,酶蛋白合成处于基线水平;稳定期启动纤维素酶高效分泌,酶活性随菌群密度增加呈正相关,直至底物限制性条件引发酶-底物结合效率衰减。温度通过双重机制调控酶活性,适温区维持酶活性中心构象稳定性与结合特异性,实现催化效能最大化;高温诱导蛋白质变性造成不可逆失活,而低温则通过降低分子碰撞频率抑制酶促反应动力学[32-33]。接种量对微生物生长代谢及纤维素酶合成具有调控作用。当接种量过低时,菌体滞后期显著延长,导致生物量积累与酶蛋白合成周期增加;相反,过高的接种量会引发营养底物与生存空间的激烈竞争,促使微生物代谢通量向维持基础生命活动与增殖途径重新分配[34]。pH对酶活性的影响主要体现在pH会改变产酶细胞的结构和通透性,进而影响益生菌对营养物质的吸收和一些产物的合成[35]。为进一步提高菌株YR3.2的产酶活性,通过单因素试验对菌株产酶的最佳发酵时间、温度、接种量和初始pH进行研究,结果表明YR3.2的酶活性达到最高的条件是温度35 ℃、初始pH 7.0、接种量2%、发酵36 h。选择温度、时间和pH进行3因素×3水平的正交试验,结果表明,当温度为35 ℃、pH为7.0时,菌株YR3.2发酵36 h时的羧甲基纤维素酶活性为72.78 U/mL。
秸秆的微生物降解被认为是有效促进秸秆分解和最大化利用秸秆生物资源的最有效途径之一[36]。秸秆的微生物降解过程主要由木质纤维素降解菌驱动,其通过分泌复合酶系,催化秸秆中木质素-纤维素复合结构解聚为可溶性单糖等小分子物质,最终经氧化代谢转化为二氧化碳和水等终产物,从而实现秸秆的高效分解与资源转化[37]。陈欢等[38]采用筛选的菌株进行玉米秸秆干物质降解率测定发现,其中菌株C8的秸秆干物质降解率最高,30 d降解率为35.79%。本研究中,菌株YR3.2对油菜秸秆和燕麦秸秆具有良好的降解率,秸秆损失率分别为18.52%和23.34%。

4 结论

本研究从放牧牦牛瘤胃中进行菌株筛选发现,菌株YR3.2具有良好的产纤维素酶特性、抗生素敏感性、抑菌特性、疏水性以及自凝集性,其在35 ℃、pH 7.0、发酵36 h时纤维素酶活性最高,达72.78 U/mL;液态发酵7 d,油菜秸秆和燕麦秸秆损失率分别为18.52%和23.34%,可作为候选菌株在饲草料加工和动物养殖中应用。

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