1 虫草素概述
1.1 虫草素的来源与化学结构
1.2 虫草素的提取与纯化方法
1.3 虫草素的合成
虫草素的合成方式可分为生物合成与化学合成2种[2]。尽管已有文献对虫草素的生物合成途径进行了研究,并且其关键基因也逐步被发掘和阐释,但目前仍处于理论研究阶段[17-18]。因此,虫草素的合成主要依赖化学合成,分为全合成和半合成[2]。李启欢等[19]建立了基于单糖底物的虫草素全合成新工艺,分别以D-葡萄糖和D-木糖作为起始原料构建了2条化学合成路径,这一过程关键步骤是通过Barton去氧反应脱去3'-OH,完成关键中间体的定向转化,最终合成得到虫草素,2条合成路径产率分别达到37%和40%,此工艺不仅显著提高生产效率,还确保了最终产物纯度均>98.5%。全合成路径具有原料成本低廉、反应步骤简洁等优点,若能进一步优化工艺,解决中间体纯化以及有机锡残留难题,有望实现虫草素的工业化生产[20]。王利民等[21]则是采用了一条半合成虫草素路线,以腺苷为原料,通过乙酸酐酰基化反应得到5'-乙酰氧基-N6-乙酰基腺苷,随后与乙酰溴反应,最终经甲酸还原得到虫草素。
2 虫草素的生物功能及机制
2.1 抗炎作用
2.1.1 虫草素通过降低炎症因子的表达缓解炎症反应
在炎症反应中,一氧化氮(NO)和前列腺素E2(PGE2)是重要的炎性介质,与急慢性炎症的发生、进展有密切的关系,一氧化氮合酶(iNOS)和环氧酶-2(COX-2)是合成NO和PGE2的关键限速酶,通过抑制iNOS和COX-2蛋白的表达,可有效减少NO和PGE2的产生,从而发挥抗炎作用。李晖等[1]研究表明,在二甲苯诱导的小鼠炎症反应中,腹腔注射虫草素[50、100、200 mg/(kg·d),连续7 d],可显著抑制小鼠的耳肿胀以及NO和PGE2的生成;在脂多糖(LPS,2 μg/mL)诱导的巨噬细胞RAW264.7细胞炎症反应中,虫草素(12.5、25、50 μmol/L)预处理12 h,可有效抑制炎性相关蛋白iNOS和COX-2的表达,同时减少NO和PGE2的产生。Yang等[22]研究显示,虫草素(6.25、12.5、25、50 μmol/L)预处理剂量依赖性抑制LPS诱导的小鼠RAW264.7细胞促炎细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和COX-2的表达。由此可知,在外源性刺激的诱导下,虫草素可以降低细胞内的炎症因子的表达。
2.1.2 虫草素通过调节Toll样受体4/核因子-κB(TLR4/NF-κB)炎症信号通路降低炎症因子的表达
NF-κB作为炎症信号通路的核心调控因子,在静息状态下通过与κB抑制蛋白-α(IκB-α)结合维持失活状态,当受炎症刺激时,复合体解离促使磷酸化激活的NF-κB进入细胞核,通过DNA结合域启动IL-6等炎症因子基因转录[23]。同时,Toll样受体(TLRs)作为先天免疫系统的模式识别受体,在免疫细胞表面介导非特异性和特异性免疫的协同作用,通过快速识别病原体维持机体稳态[24]。吕莉[25]研究表明,虫草素可通过抑制TLR4/NF-κB-细胞焦亡通路改善LPS诱导的小鼠炎症,主要表现为巨噬细胞在受到LPS刺激后,可被质膜上的Toll样受体4(TLR4)识别,从而转录激活下游信号NF-κB,上调炎症小体NOD样受体家族蛋白3(NLRP3)的表达,从而启动下游焦亡相关蛋白半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、消皮素D(GSDMD)表达,而虫草素干预后能显著降低焦亡通路转导NLRP3、Caspase-1及GSDMD基因和蛋白的表达水平。Liu等[26]研究表明,虫草素可通过白细胞介素-10(IL-10)-TLR4/NF-κB通路抑制IR诱导的小鼠肝脏损伤炎症,主要表现为虫草素预处理显著增加IL-10含量,IL-10通过抑制κB抑制蛋白(IκB)磷酸化以抑制NF-κB的活性,从而影响TLR4/NF-κB通路信号转导(TNF-α、MCP-1、TLR4、p-p65和p-IκB的减少)。
综上所述,虫草素发挥抗炎作用主要是通过2个途径:1)虫草素通过降低不同组织或细胞中炎症因子的水平,从而有效缓解炎症反应;2)在炎症因子刺激的条件下,虫草素可通过调节TLR4/NF-κB炎症信号通路抑制焦亡通路(图2)或降低炎症因子的表达,从而抑制炎症的产生。
图2 虫草素对巨噬细胞焦亡的作用及机制NF-κB:核因子-κB nuclear factor-kappa B;IκB-α:核因子-κB抑制因子-α nuclear factor-kappa B inhibitor-α;TLR4:Toll样受体 Toll-like receptor;XO:黄嘌呤氧化酶 xanthine oxidase;ROS:活性氧自由基 reactive oxygen species;NLRP3:NOD样受体家族蛋白3 nod-like receptor protein 3;Caspase-1:半胱氨酸蛋白酶-1 cysteine-dependent aspartate-specific protease-1;GSDMD:消皮素D gasdermin D;GSDMD-N:消皮素D N端片段 gasdermin D N-terminal fragment;IL-18:白细胞介素-18 interleukin-18;IL-1β:白细胞介素-1β interleukin-1β;Pro-IL-18:白细胞介素-18的前体蛋白 precursor protein of interleukin-18;Pro-IL-1β:白细胞介素-1β的前体蛋白 precursor protein of interleukin-1β。 Fig.2 Effect and mechanism of cordycepin on pyroptosis of macrophages[25] |
2.2 抗菌、抗病毒
2.2.1 虫草素选择性破坏细胞膜完整性、改变细菌形态结构
Eiamthaworn等[27]研究发现,虫草素水提取物在500 mg/mL浓度下对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的抑菌直径(15.50±0.5) mm、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)抑菌直径(18.83±1.26) mm表现出显著抑制效应,相较于乙醇提取物的铜绿假单胞菌抑菌直径(12.17±0.76) mm、金黄色葡萄球菌抑菌直径(15.17±1.26) mm具有显著差异,该结果表明水溶性介质更有利于虫草素抗菌活性的表达。作为细菌天然防御屏障的细胞壁膜系统在抗菌物质作用下发生结构损伤致屏障失活,引发胞内生物大分子(如核酸/酶类)外泄并导致代谢紊乱及生理功能异常,甚至菌体死亡[28-29]。研究表明,外渗物质中核酸成分因260 nm特征性光吸收(定义为OD260)占主导,据此建立的OD260定量检测已成为评估细胞膜完整性的关键指标[29-32]。经虫草素干预后,通过扫描电镜可观察到细菌胞体表面呈现显著结构损伤,同时胞内物质核酸类等呈现明显外渗现象,这种形态学改变证实虫草素可通过作用于细菌质膜与细胞壁的特定靶点,引发其结构的不可逆损伤,致使胞内渗透压失衡及代谢稳态破坏,最终导致菌体裂解死亡[33]。也有研究指出,核苷类抗生素(包括虫草素)可特异性结合细菌磷酸-N-乙酰壁氨酰-五肽转位酶活性位点,通过竞争性抑制效应干扰肽聚糖合成途径中的脂质循环系统,从而有效终止细胞壁的正常生物合成过程[34]。高苏等[35]研究表明,虫草素对革兰氏阳性菌等菌株表现出显著的抑制效果,然而对于革兰氏阴性菌等菌株,虫草素却未表现出明显的抑制作用,这表明虫草素在抗菌方面具有一定的选择性。这种抗菌谱差异可能与菌体表层结构的组成特征密切相关,例如,SA等菌虽具有致密的肽聚糖层,但其特有的结构对小分子物质的跨膜运输反而具有较高的通透性;而像PA等菌被额外的LPS外膜环绕,其作为1层保护性结构,能够阻止脂溶性维生素的渗透,从而保护细菌免受药物的伤害[35]。
2.2.2 虫草素通过抑制病毒RNA复制过程以抗病毒
虫草素的强抗病毒作用是通过其独特的分子机制实现,这种机制源于虫草素与腺苷的高度结构相似性,此特性导致细胞中许多酶难以区分,因此,虫草素能够轻易阻断病毒颗粒中的某些关键生化途径,从而阻止了病毒的传染过程,保护机体免受病毒侵害[36-37]。由于虫草素在结构上与腺苷相似,虫草素可通过抑制RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp),从而有效阻断RNA多聚核苷酸链的合成过程,最终抑制RNA病毒的复制和繁殖[38]。Panya等[39]研究表明,虫草素可与登革热病毒RNA合成关键酶DENV NS5中的甲基转移酶(methyltransferases,MTase)和RdRp结构域结合,阻断病毒RNA合成。刺突蛋白(spike protein,S蛋白)在病毒的靶向识别和入侵宿主细胞过程中发挥关键作用,因此,常被选作抗体研发的核心靶点,虫草素能够与SARS-CoV-2刺突蛋白、主蛋白酶(Mpro)相结合,抑制病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)活性,阻断SARS-CoV-2在机体内复制[40]。研究表明,COVID-19通过S蛋白进入宿主体内,虫草素能够与S蛋白的RBD结构域中的Asn33、His34等氨基酸结合,这种结合会改变S蛋白的构象从而阻断受体介导的内吞作用,最终抵御病毒进入宿主细胞,维护机体健康状况[41]。主蛋白酶(main protease,Mpro)在冠状病毒的复制与转录过程中发挥着至关重要的作用,因而成为抗病毒药物研发的理想靶点[42]。Mpro由3个结构域构成,并在结构域Ⅰ和Ⅱ裂缝处形成了关键的催化位点和活性位点,虫草素与这些位点结合能力较强,且两者之间的化学相互作用强于莫能菌素、雷帕霉素等药物,这进一步证实了虫草素对COVID-19的治疗潜力[42-43]。
综上所述,虫草素发挥抗菌、抗病毒作用主要是通过2个途径:1)虫草素具有选择性地破坏细菌的壁膜系统,造成胞内核酸类物质大量流失,影响细菌形态结构和正常生命进程;2)虫草素通过抑制病毒RNA依赖的RdRp、S蛋白、Mpro以破坏病毒RNA复制过程,阻止病毒伤害机体。
2.3 抗氧化性能
2.3.1 虫草素通过调节Kelch样ECH关联蛋白1/核因子E2相关因子2(Keap1/Nrf2)通路缓解氧化应激
张迪[47]研究指出,虫草素可促使Nrf2入核,上调抗氧化基因HO-1、NQO1等表达,从而降低棕榈酸诱导下肝细胞(LO-2)中MDA含量,增强SOD活性。Qing等[48]研究发现,HO-1基因缺陷型小鼠表现出更严重的氧化应激损伤,经虫草素处理,能有效诱导Nrf2入核并激活其功能,进而显著上调HO-1蛋白表达水平,有效缓解氧化应激。Lee等[49]评估胆管癌SNU478氧化应激机制时发现,相较于对照组,虫草素处理组Keap1/Nrf2表达比显著增加,进而上调CAT、SOD等活性以缓解氧化应激。Han等[44]研究显示,在肾缺血(I/R)小鼠模型中,氧化应激时,虫草素处理可激活Nrf2从而诱导下游抗氧化酶HO-1的表达,有效缓解氧化应激。吴双等[46]研究表明,在脑缺血(CI/R)小鼠模型中,经虫草素处理,CI/R大鼠脑组织中p-Nrf2/Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达水平明显升高,从而发挥抗氧化应激作用。
2.3.2 虫草素通过增加抗氧化酶活性和抗氧化因子水平缓解氧化应激
细胞内氧化还原稳态失衡,由于羟基自由基、NO和过氧化氢(H2O2)等活性氧(ROS)的异常蓄积诱发氧化应激,该过程被证实是肌肉、睾丸等组织细胞损伤的核心机制[50-52]。有研究报道,动物机体高水平的ROS可触发生殖细胞凋亡和质膜/DNA氧化,破坏精子发生周期(成熟-受精动态过程),导致生精功能进行性衰退[53-54]。Kopalli等[55]用12月龄雄性SD大鼠试验表明,给予衰老模型大鼠每日20 mg/kg剂量虫草素干预后,虫草素可通过上调睾丸组织内相关受体合成量抵御衰老诱导的睾丸功能障碍,有效提升衰老大鼠的精子质量,维持其正常的生殖功能,大鼠的精子动力学参数(如活率和进行性等)均有显著性改善。相关研究指出,虫草素具有显著的自由基清除能力,其可通过增强抗氧化酶的活性,使得细胞内原本处于失衡的氧化还原状态得以重新调整,细胞自身抗氧化防御体系的潜能被充分激发,进而能够更有效地抵御氧化应激带来的威胁,显著减轻氧化应激过程中产生的各类细胞损伤,为细胞的正常功能提供了重要的保护屏障[44,56-57]。
Ramesh等[58]通过构建12月龄大鼠衰老模型发现,经虫草素干预,大鼠机体内CAT、SOD等抗氧化酶活性显著增强,维生素C和维生素E等非酶抗氧化物质的含量显著提高,氧化损伤标志物MDA含量显著下降,同时,在血清指标方面,虫草素显著降低肌酐和尿素含量及丙氨酸转氨酶(ALT)活性。上述结果表明,虫草素通过多靶点调控可显著改善老龄大鼠的抗氧化防御系统功能,并能有效抑制脂质过氧化。
综上所述,虫草素提高动物抗氧化性能主要通过2种途径:1)虫草素通过激活Keap1/Nrf2通路,诱导抗氧化基因HO-1等表达,缓解氧化应激;2)虫草素通过增加抗氧化酶如超氧化物歧化酶等活性和抗氧化因子如维生素C等含量,改善动物机体氧化应激状态。
3 虫草素在畜牧业养殖中的应用
3.1 虫草素在猪生产中的应用
在生猪养殖中,虫草素具有缓解腹泻与提高生产性能和免疫性能的作用。Gao等[64]在仔猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)模型中表明,仔猪每天接受2次虫草提取物注射(每次剂量为7.5 mg/kg BW)时,可显著抑制PRRSV相关蛋白活性(NSP9和RdRp),这一结果显示,虫草素可能对抵抗PRRSV具有一定的积极作用。Hsiao等[65]采用LPS诱导猪的炎症模型中表明,经虫草素干预后(0~80 μg/mL),能够显著抑制LPS刺激产生的炎症因子NO、PGE2,并能有效抑制其诱导发生的p38蛋白磷酸化,进而降低促炎细胞因子(如IL-6、IL-1β和TNF-α)的分泌。Lin等[66]研究表明,在低生育力公猪的饲粮中添加10 g/d的蛹虫草后,精子发生量显著增加,并在2个月后达到高峰,且活跃期的精子比例及精子形态均有显著提高。综上所述,虫草素在缓解腹泻、提升生产性能和增强免疫功能等方面发挥积极作用。
3.2 虫草素在家禽生产中的作用
Koh等[67]研究表明,虫草提取物能够提高家禽肠道微生物菌群的丰度并保持肠道菌群平衡,提高生产性能和健康指数。魏建忠等[68]试验结果表明,在土杂肉鸡饲粮中添加0.2%P2和P5菌株虫草菌丝体,肉鸡增重和饲料转化率分别显著提高11.04%和11.56%。程万莲[69]饲养海兰褐蛋鸡试验表明,给予饲粮含0.5%剂量蛹虫草培养基干预后,能显著提高鸡的蛋重、料蛋比和产蛋率并显著改善蛋品质。孙汉巨等[70]蛋鸭的饲养试验表明,在饲粮中添加不同浓度(0.1%和0.4%)的虫草饲料添加剂,能有效地提高产蛋率和日产蛋数量,同时蛋重也得到了相应的增长。综上所述,虫草素或其菌株及发酵产物可以显著提高家禽肠道微生物菌群的丰度,优化肠道微生态环境,促进饲粮消化吸收,同时可以提升家禽生产性能。
3.3 虫草素在反刍动物生产中的应用
Yeo等[71]报道,蛹虫草菌丝体(其成分与地顶孢霉培养物相似)能够增强奶牛瘤胃微生物的发酵功能,促进瘤胃微生物中纤维分解菌的增殖。张永根等[72]试验指出,在古尼虫草中提取地顶孢霉菌,经人工发酵得到灭活的真菌类添加剂[ATC, 30 g/(头·d)],在其干预后瘤胃微生物菌群中纤维素降解菌的相对丰度得到调节,这种微生物群落结构的优化可有效改善瘤胃内的发酵环境,增强瘤胃代谢的稳定性。赵海明等[73]在奶牛饲粮中添加30 g/(头·d)ATC后,结果显示,可提高肠道有益菌群丰度,改善肠道健康情况,促进饲粮的消化吸收效率,并显著增加奶牛产奶量。综上所述,虫草素或其菌株及发酵产物可以调节瘤胃微生物菌群丰度,改善奶牛瘤胃微生物发酵功能,有效提高奶牛产奶量。
4 小结与展望
综上所述,虫草素具备诸多生理功效,其作为一种中草药提取物添加剂可以提高畜禽机体的抗炎、抗菌、抗病毒以及抗氧化性能。虫草素具有无毒害、无残留等优点,在畜牧养殖业中展现出广阔的应用潜力。目前,虫草素在畜禽生产中的应用较少,还存在如下一些问题:1)虫草素的应用受到产量和价格等因素的限制,由于其稀缺性,许多研究与应用多以蛹虫草菌株或其他菌株的发酵产物加以利用,然而,这些产品能否达到预期效果,以及如何在开发和利用虫草素的过程中“降本增产”,是当前急需解决的问题;2)虫草素在畜牧生产中缺乏应用经验,其在不同畜禽品种中的应用效果及合理用量仍需进一步探究;3)对虫草素的作用机制尚未完全明确,仍有大量未知领域等待着进一步的探究。随着科学研究方法的不断进步和对虫草素的不断深入研究,其在畜禽生产中的应用前景将会越来越广阔。