苜蓿是一种高产、优质的蛋白质饲料原料[1]。青贮后的苜蓿很好地保留了其原有的营养成分,且芳香适口,家畜消化率高,辅以裹包等技术还可实现长期保存和远程运输,这克服了牧草生长季节性和地域性的问题,能为家畜常年提供优质青绿饲料,是调控饲草余缺的关键技术之一[2]。不过,受水分、缓冲能、可溶性碳水化合物(WSC)以及有氧稳定性的影响,苜蓿青贮品质和营养价值调控难度大。具体而言,一是收获期苜蓿水分含量高(70%以上),易导致苜蓿在青贮过程中梭菌和霉菌过度繁殖,进而引发蛋白质降解、丁酸发酵和毒素积累,导致发酵失败;而通过晾晒降低水分含量又会损失较多的苜蓿叶片,降低其营养价值,且晾晒期间雨热同期的气候环境容易使苜蓿发生腐败,影响苜蓿的发酵品质[3]。二是苜蓿的缓冲能值高、WSC含量低使其在青贮过程中乳酸产量低,pH下降缓慢,导致不良微生物(如梭菌、肠杆菌)增殖,蛋白质降解加剧,并可能产生氨态氮和生物胺等有害物质[4],导致发酵品质差。三是苜蓿青贮的有氧稳定性低,开窖后维持低酸环境的能力差,易发生二次发酵,消耗大量营养物质的同时还会产生毒素,降低了青贮苜蓿的饲喂价值[5]。
苜蓿青贮的有氧稳定性是指青贮苜蓿开封后与空气接触时,其中心温度超过环境温度2 ℃所需要的时间,所需时间越长,表明有氧稳定性越好[6]。研究人员在利用数学模型来预测有氧稳定性降低过程中的物质变化中发现,青贮的有氧稳定性很大程度上取决于酵母菌的初始数量和有机酸的水平[7-9]。而苜蓿的高缓冲能值和低WSC含量使发酵过程中pH降低速率慢,积累大量腐败微生物,开窖后维持低酸环境的能力差,导致有氧稳定性低。通过提高WSC含量和优化加工工艺可以改变微生物环境,提高有氧稳定性[10]。食品防腐剂、冷灭菌剂、酸制剂、酶制剂以及混合菌剂等添加剂也被广泛应用于提升苜蓿青贮有氧稳定性[11-12]。当前,规模化养殖场通过先进的收获、裹包等机械设施提高苜蓿青贮利用率,但苜蓿青贮有氧稳定性低、加工工艺要求高以及加工成本等问题,限制了苜蓿青贮在普通养殖户和畜禽生产中的广泛应用,加上对影响苜蓿青贮有氧稳定性的研究和总结还不够全面和系统,尚无法完成指导畜禽高效生产利用,因此本文总结论述近年来影响苜蓿青贮有氧稳定性的研究进展,重点探讨影响苜蓿青贮有氧稳定性的因素,以期为苜蓿青贮饲料收获、加工和贮存过程中的技术工艺改良和生产管理决策提供依据。
1 苜蓿青贮有氧稳定性低对青贮品质的影响
有氧稳定性差的苜蓿青贮干物质损失可达30%,低有氧稳定性还会促使pH持续升高,使得乳酸被分解,产生大量的丁酸和霉菌毒素,严重降低苜蓿青贮的品质;饲喂价值下降的同时会导致动物拒食,且动物误食后进入体内的毒素还可能会传递给人类[13]。
1.1 酵母菌诱发有氧稳定性降低对青贮品质的影响
酵母菌的活动是青贮饲料有氧腐败的主要原因之一,其数量与有氧稳定性具有相关性,而且随着有氧暴露时间的延长,酵母菌的数量会增多,其呼吸作用会显著降低有氧稳定性[13]。早期研究表明,乳酸菌与酵母菌之间存在共生机制,通过代谢产物之间的互补性,乳酸菌可以为酵母菌提供能量来源,因此酵母菌在青贮饲料暴露于空气中时会迅速增殖,消耗乳酸,导致pH升高,使青贮环境有利于好氧微生物活动[14]。除此之外,酵母菌的次生代谢物对酸也具有一定的抗性。研究发现,当受到甲酸胁迫时,酿酒酵母通过上调L-色氨酸、L-苯丙氨酸等氨基酸代谢物,以及调控核苷酸代谢通路,增强细胞对酸性环境的耐受性,通过调节氧化应激或能量代谢减轻酸毒性[15]。因此,如果苜蓿青贮pH下降缓慢时,酵母菌受到酸抑制的效果不足,会导致酵母菌的大量繁殖,影响青贮有氧稳定性。通过深入研究发现,苜蓿青贮中酵母菌数量超过105 CFU/g时会显著降低饲料有氧稳定性,表现为开窖后72 h内腐败率激增,这一发现表明了严格控制青贮饲料中酵母菌数量和代谢活性的重要性,同时也是确保青贮饲料有氧稳定性的关键措施[16]。
1.2 霉菌诱发有氧稳定性降低对青贮品质的影响
霉菌作为苜蓿青贮饲料中的普遍存在的微生物之一,其活动会严重影响青贮有氧暴露期间的稳定性[17]。霉菌的生长和繁殖会分解苜蓿青贮饲料中的营养物质,某些霉菌还会分解乳酸使得pH升高,剧烈的霉菌活动造成苜蓿青贮饲料的温度升高和腐败,其代谢产生的毒素(如黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮等)不仅抑制乳酸菌活性,反刍动物摄入后,也会损害动物本身的健康,最终还会通过肉类和乳制品将毒素传递给人类[18]。在研究苜蓿青贮过程中霉菌毒素的变化中发现,黄曲霉毒素在青贮第5天增长至初始值的4.1倍(11.34 μg/kg),第30天达11.91 μg/kg;呕吐毒素在第2天即增长7.4倍(418.57 μg/kg),30 d后高达834.28 μg/kg[19]。目前关于苜蓿青贮在何种条件下能够产生何种霉菌毒素还不确定,最适合霉菌生长和霉菌毒素形成的条件研究也尚不明晰,且同批青贮料所形成的霉菌毒素也不一定相同,其发生机理还有待研究。
1.3 梭菌诱发有氧稳定性降低对青贮品质的影响
梭菌发酵会导致青贮饲料的pH升高以及丁酸和氨态氮含量增加,影响苜蓿青贮的有氧稳定性。梭菌主要活跃于苜蓿青贮发酵的后期,尤其是在水分含量高且WSC含量低的青贮中,繁殖过程中分解糖和蛋白质。绝大多数梭菌对酸性条件的抑制较差,当pH在4.2以下时足以抑制其生长。研究发现,产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)能够在高温条件下生长,并且可以利用多种碳源底物,引起苜蓿青贮发生腐败[20]。丁酸梭菌在发酵后期起作用,能够将乳酸转化为丁酸,加速苜蓿青贮的腐败变臭,降低有氧稳定性[21]。减少梭菌对提升青贮有氧稳定性至关重要,这不仅有助于保持青贮饲料的品质和营养价值,还对保障家畜健康具有重要意义。
2 调控苜蓿青贮有氧稳定性的微生物机制
苜蓿青贮发酵是一个复杂的生物化学过程,涉及到多种微生物的活动和代谢产物的形成[22]。而乳酸菌是决定青贮有氧稳定性的关键微生物,在厌氧条件下,乳酸菌(主要是乳酸杆菌和肠球菌)将可溶性糖(如葡萄糖)转化为乳酸[23]。乳酸的积累导致pH下降,抑制其他微生物的生长,尤其是不耐酸的微生物。当pH降到4.5以下时,大多数微生物活动被抑制,乳酸菌的活动也减缓。乳酸和其他有机酸的积累为青贮提供了防腐作用,乳酸含量越高,有氧稳定性越高[24]。当乳酸含量达到苜蓿青贮鲜重的1.5%~2.0%时,绝大多数微生物活动基本停止,养分损失减少,青贮饲料保持新鲜,气味酸香,不易腐败。氧气是诱发有氧稳定性改变的核心。当青贮饲料暴露于空气中时,好氧微生物(如酵母菌、霉菌)被激活,酵母菌优先利用乳酸作为底物,将其代谢为二氧化碳和水,这一过程破坏了厌氧发酵形成的酸性环境,降低了乳酸含量,削弱了抑菌作用,导致pH上升。微生物代谢活动释放热量,导致青贮堆温度升高,营养物质的分解和腐败加速[17]。此外,高湿度环境还会促进霉菌孢子的萌发与扩散,加剧稳定性下降,促使腐败菌(如芽孢杆菌、肠杆菌)大量繁殖,进一步分解蛋白质和碳水化合物,产生氨态氮、二氧化碳和热量,引发二次发酵和腐败[5]。在有氧稳定性诱发的二次发酵过程中,青贮品质会受到严重的影响[25]。
综上可知,苜蓿青贮过程中对厌氧环境、温度、湿度和微生物等有着更为严格的工艺要求。
3 苜蓿青贮调制工艺对有氧稳定性的影响
3.1 水分
苜蓿的水分含量是影响青贮发酵有氧稳定性的重要因素之一。研究表明,不同水分梯度对苜蓿青贮发酵品质有显著影响。适当的水分含量有助于乳酸菌的生长和发酵作用,而过高或过低的水分含量都会影响青贮饲料的品质和有氧稳定性[26]。根据苜蓿青贮时的水分含量划分,可以分为以下3大类:高水分青贮(含水率60%~70%)、半干青贮(含水率45%~60%)和低水分青贮(含水率<45%)[27]。研究发现,将添加剂(主要成分为山梨酸钾、苯甲酸钠和亚硝酸钠)用于高水分苜蓿青贮时可以快速减少酵母和肠杆菌等有害微生物,提高有氧稳定性[28]。高水分青贮时会产生更高含量的乙酸和丙酸,提高其有氧稳定性,但是也会产生丁酸,使青贮发臭,影响动物采食[29]。杨晓丽[30]研究表明,当青贮水分含量过高时,以梭菌属为主的厌氧性微生物成为优势菌种,它们会将蛋白质分解成氨或胺等物质,致使青贮饲料发生腐败,暴露在空气中有氧稳定性表现下降的趋势[20]。低水分苜蓿青贮有氧稳定性优于高水分青贮,在青贮苜蓿水分含量由70%逐步降低到50%的过程中,pH会随着水分含量的降低而逐渐下降,渐而达到合适的青贮酸度环境,有氧稳定性会有所提升[16,30]。如果苜蓿青贮时水分含量过低则会影响乳酸和乙酸等酸性物质的产生,苜蓿青贮pH难以达到所需水平,影响有氧稳定性[31]。与前两者相比,半干青贮是目前应用较为广泛的苜蓿青贮方式,其发酵过程慢,同时有高渗压,能够抑制蛋白质水解和丁酸的形成,因而养分损失较少;并且其干物质含量高,动物采食量高[32]。因此,苜蓿青贮调制的水分含量为55%~65%时,有利于苜蓿青贮开窖后的保存。
3.2 压实密度
苜蓿青贮时需要进行压实以排除多余氧气,提供密闭厌氧环境以供乳酸菌进行发酵,因此压实密度对提高苜蓿青贮有氧稳定性有重要作用。在苜蓿青贮调制过程中,装填缓慢或压实密度不足会导致开窖时氧气进入青贮料内部的速率加快,降低有氧稳定性[33]。提高压实密度可以提高乳酸含量、降低pH,从而达到提高青贮有氧稳定性的效果,且这种变化在一定范围内随着装填密度的提高而提高[34]。王艳杰等[34]发现,随着紫花苜蓿青贮密度的提高,在有氧暴露过程中,中、高密度组青贮pH、氨态氮/总氮以及酵母菌数量低于低密度组,乙酸含量高于低密度组,且高密度组有氧稳定性更好。刘逸超等[35]发现,以800 kg/m3的密度装填苜蓿和羊草,可以得到较好的苜蓿青贮有氧稳定性。由此可知,较高密度的青贮不仅有助于排除空气,还增加了原料与微生物之间的接触面积,有利于有氧稳定性的提高。
3.3 发酵底物
苜蓿青贮时自身所附着的乳酸菌较少,因此青贮时混合的原料对有氧稳定性的影响尤为重要[36]。苜蓿与不同原料混贮可以为乳酸菌的繁殖提供足够的碳源,同时随着原料的改变微生物区系也会发生改变,可以在一定程度上提高有氧稳定性。吴羽晨等[37]研究发现,多年生黑麦草与紫花苜蓿混合青贮的有氧稳定性优于单一青贮,这可能是由于黑麦草为苜蓿青贮提供了WSC,促进了发酵益生菌的生长。甜高粱茎秆富含蔗糖、果糖、葡萄糖和麦芽糖等,其充足碳源为苜蓿青贮的有益菌提供了良好的条件,从而迅速降低pH,减缓或抑制腐败菌的繁殖。将甜高粱与苜蓿进行混合青贮时,提高紫花苜蓿混合比例,可以抑制酵母菌、霉菌和梭菌孢子的生长,有益于提高混合青贮饲料的有氧稳定性[38]。王青兰等[39]用不同精料(豆粕、玉米粉、麦麸和玉米干全酒糟)复配添加到紫花苜蓿中进行青贮,发现这些精料均能有效提高苜蓿青贮的有氧稳定性。此外,一些特殊原料自身含有杀菌物质,能够抑制杂菌生长,从而提高有氧稳定性。王晓娜等[40]发现,松针与苜蓿按照3∶7混合青贮有氧稳定性显著提高。不同原料混贮使苜蓿发酵底物碳氮比发生改变,进而使发酵益生菌的生存环境得到改善,从而增强了底物与微生物间介质的传递,提高微生物对青贮底物的利用率,增强发酵体系的缓冲能力,并提高苜蓿青贮的稳定性。此外,原料及时制作青贮与否也会影响有氧稳定性,当苜蓿原料延迟青贮后,会显著增加酵母菌和好氧菌等的数量,严重降低青贮苜蓿的有氧稳定性,延迟青贮的苜蓿比正常青贮的苜蓿会更快变质[41]。
3.4 发酵温度
影响苜蓿青贮有氧稳定性的微生物对温度耐受范围通常在5~50 ℃,而青贮时的温度波动较大,不同发酵温度会对有氧稳定性产生一定影响。温度可以调控益生菌群的生长,从而提升青贮有氧稳定性,当青贮温度超过50 ℃后乳酸菌会失活,而耐高温的腐败菌会大量繁殖造成营养流失,降低有氧稳定性,引发青贮苜蓿腐败[42]。与20和30 ℃的青贮温度相比,40 ℃的青贮温度能够更快地降低pH,并达到最终较低的pH[43]。低温(6 ℃以下)条件下,乳酸菌活动会被抑制,产酸能力大大下降,整个苜蓿青贮的周期延长;而耐低温的梭菌会将蛋白质分解成氨或胺,并把青贮苜蓿中的WSC分解成丁酸,降低有氧稳定性,从而使青贮饲料产生恶臭[44]。综上所述,当青贮温度保持在25~40 ℃时,可以使苜蓿青贮保持较好的有氧稳定性。
4 外源添加剂对苜蓿青贮有氧稳定性的影响
4.1 微生物制剂对苜蓿青贮有氧稳定性的影响
菌剂中不同的微生物可以产生不同的次生代谢产物,能影响青贮发生的进程[13]。乳酸菌作为青贮发酵的益生菌有同型和异型之分[45]。常见的同型乳酸菌包括植物乳杆菌、屎肠球菌、乳酸片球菌和戊糖片球菌等,当苜蓿青贮中添加同型发酵乳酸菌时,对青贮品质有较大提升,但对有氧稳定性影响不显著,其原因是单独添加同型发酵乳酸菌可能提高了乳酸的产生,同时也增加了霉菌和酵母菌生长的底物[46]。异型发酵乳酸菌通过磷酸酮醇酶途径能利用更多的碳源(如阿拉伯糖、木糖),若苜蓿青贮中以异型乳酸菌主导时,会产生更多的乙酸,能有效抑制霉菌和酵母菌的生长,减少青贮饲料在有氧条件下的变质,提高青贮饲料的有氧稳定性[16]。因此,合理控制异型乳酸菌的接种量是提高苜蓿青贮有氧稳定性的重要途径;而筛选和改良具有更高发酵效率和抗逆性的菌株,则成为利用微生物制剂提高苜蓿青贮有氧稳定性另一有效途径。目前对乳酸菌的关注度主要集中在2个方面,其一是筛选抗性更强,产酸更多的新型乳酸菌(如干酪乳杆菌),其二是通过如CRISPR-Cas系统等对乳酸菌的基因组进行定向改造,以增强其在青贮发酵中的功能(如耐低温性、产酸能力或抑制有害菌的能力)[47]。乳杆菌是近年来苜蓿青贮使用最多的异型乳酸菌之一,外源添加布氏乳杆菌的苜蓿青贮中乙酸的含量会得到提高,从而使苜蓿青贮的有氧稳定性得到提高[48]。在苜蓿青贮中添加布氏乳杆菌的同时添加葡萄糖或岩藻多糖,青贮有氧稳定性会进一步提高[49-50]。青贮用菌剂的混合使用在其协同作用下可以发挥更好的效果,对青贮有氧稳定性有很大提高。研究人员以植物乳杆菌和布氏乳杆菌为主的复合型乳酸菌剂制作苜蓿青贮饲料,其有氧稳定性要高于以植物乳杆菌为主的同型乳酸菌剂[51-52]。薛莉萍等[52]研究发现,添加5 g/t乳酸菌+23 kg/t玉米面粉以及5 g/t乳酸菌对紫花苜蓿裹包青贮有氧稳定性均有提高。综上所述,异型乳酸菌在青贮发酵时产生的乳酸、乙酸等物质可以降低苜蓿青贮饲料的pH,是苜蓿青贮的主要微生物之一,能够保障苜蓿青贮有氧稳定性,一些异型乳酸菌还能产生多肽等代谢产物,对牲畜具有潜在健康益处。
4.2 酶制剂对苜蓿青贮有氧稳定性的影响
阻碍pH下降的能力称为缓冲能力,苜蓿的缓冲能力较强,不利于青贮[53]。外源添加酶制剂可以将苜蓿中的结构性碳水化合物转化为WSC,为乳酸菌提供更多底物,从而产生更多乳酸来降低青贮饲料pH,达到提高有氧稳定性的目的。纤维素酶和木聚糖酶是常用的酶类添加剂[54]。纤维素酶可通过将植物细胞壁中的纤维成分降解成糖,再供给乳酸菌利用发酵产生乳酸和乙酸,使pH和氨态氮含量达到较低的水平,从而抑制杂菌的生长,提高牧草青贮品质和有氧稳定性[55-56]。李玉玉等[57]在苜蓿中添加5.0‰青贮专用复合纤维素酶(纤维素酶活性≥60 000 U/g、木聚糖酶活性≥2 500 U/g、淀粉酶活性≥300 000 U/g、β-葡聚糖酶活性≥300 000 U/g)进行青贮,与未添加相比青贮有氧稳定性显著提高。酶制剂将各种纤维成分降解为糖类,为苜蓿青贮有益菌的快速繁殖提供了条件,从而提供一个抑制有氧腐败菌的生长的青贮环境,达到改善有氧稳定性的目的。同时,相较于不添加或单一添加酶制剂,复合酶制剂更有利于改善苜蓿青贮的有氧稳定性。
4.3 酸制剂对苜蓿青贮有氧稳定性的影响
青贮饲料在好氧变质过程中,由于酵母菌等有氧腐败菌剧烈活动导致蛋白质和氨基酸被分解,消耗乳酸和乙酸等有机酸产生乙醇、丙二醇等物质使pH而升高,因此青贮前添加酸制剂可以增加有机酸的含量,提高苜蓿青贮的有氧稳定性[9]。对青贮品质进行评价时虽然以挥发性脂肪酸(VFA)的生成量低为优,但VFA含量高时,苜蓿青贮调制的全混合日粮在饲喂时有氧稳定期长[58]。目前主要研究并用于青贮的酸制剂包括甲酸、乙酸和丙酸等。甲酸通过扰乱氧化还原平衡、抑制ATP合成等途径损害酵母细胞。在苜蓿青贮中添加6 mL/kg的甲酸,有氧暴露6 d后仍可以保持pH<4.5的酸性环境,延缓了紫花苜蓿青贮后二次发酵,提升了有氧稳定性[59]。杨逢源等[60]将红色三叶草和玉米的附生微生物菌群交叉接种到不同青贮原料上,可以显著提高青贮饲料中乙酸的含量,从而提高青贮饲料的有氧稳定性。乙酸是一种高效的抗真菌剂,在以7∶3比例混合的燕麦与紫花苜蓿青贮中,添加0.4%的乙酸对好氧性微生物有明显抑制效果,改善了苜蓿混合青贮发酵品质和有氧稳定性[61]。丙酸比青贮使用的其他酸的酸性弱,但其抗真菌能力强,能显著抑制酵母等杂菌的生长繁殖,有效防止青贮发生腐败症状,提高青贮的有氧稳定性[62]。闫星全等[63]研究发现,在苜蓿青贮中添加0.4%的丙酸可以显著提高有氧稳定性。但是需要注意的是,苜蓿青贮早期的pH偏高,而丙酸在高pH的条件下会发生解离,因此单独使用丙酸很难达到预期效果,需要与其他酸制剂混合使用。
4.4 其他
除上述添加剂外,还存在一些有机酸盐、糖类、农副产物类等添加剂也对苜蓿青贮有氧稳定性产生不同的影响。李伟等[64]在苜蓿中添加20 mg/kg植物精油进行青贮发酵,改善了青贮有氧稳定性。张欢等[65]研究发现,在苜蓿中添加60 g/kg的枸杞副产物可以提高苜蓿青贮的有氧稳定性。薛春胜等[56]在陇东紫花苜蓿青贮中添加蔗糖,发现其对陇东紫花苜蓿有氧稳定性均有一定程度的改善。王亚楠等[66]发现,在青贮饲料中添加糖蜜可显著提高乳酸含量,有氧稳定性也显著提高。此外在苜蓿青贮时添加苹果酸、柠檬酸处理同样可以提高有氧稳定性,还促进了瘤胃的发酵,提高了饲料消化率[67]。陶旭雄等[68]研究发现,高水平柠檬酸渣和乳酸菌组合会加速紫花苜蓿青贮有氧腐败,而添加1.2%的柠檬酸渣和乳酸菌能够提高紫花苜蓿青贮的有氧稳定性。张玲[69]研究表明,将残次枣粉添加至高水分紫花苜蓿中进行青贮能有效改善青贮饲料的发酵和营养品质,提高有氧稳定性。
5 小结
综上所述,在苜蓿青贮过程中,提高苜蓿青贮有氧稳定性需把握以下几点:一是苜蓿青贮水分含量应当控制在55%~65%;二是压实密度应当控制700~800 kg/m3;三是保持最终发酵底物的WSC残留量应≥2%(干物质基础);四是青贮温度控制在25~40 ℃。实际生产中可以通过“萎蔫+高吸水性材料吸附”的方法调控水分含量,或是机械破除茎秆蜡质层,加速原料水分蒸发;优化苜蓿的切割长度和分层压实的厚度,改造青贮窖的结构(如金字塔型)会更容易达到需求的青贮密度;在考虑底物(如禾本科作物)WSC含量的基础上,选择具有较高吸水能力的原材料(如秸秆类、膨润土等),也可以多种材料复合,满足苜蓿青贮所需的底物发酵;利用便携式探针实时监测青贮的密度与温度,通过红外热成像的方法实时反馈发酵温度变化。目前,通过添加如微生物制剂、酶制剂和有机酸等调控青贮发酵有氧稳定性研究较多,但是开发潜力仍旧巨大。对于水分、压实密度、温度和发酵底物等工艺的探索依然不足,经济效益与技术开发是制约其发展的重要原因。未来在改善苜蓿青贮有氧稳定性时,这两方面仍然值得重点关注。