Chinese Journal of Animal Nutrition >

2025 , Vol. 37 >Issue 9: 5863 - 5876

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.477

RESEARCH PAPER

Effects of Fermented Feed on Laying Performance, Intestine Morphology, Digesta Digestive Enzyme Activities and Cecal Microbiota of Laying Hens

  • LU Jian , 1 ,
  • GUO Wei 1 ,
  • ZHANG Xin ,
  • YANG Xiaodong 2 ,
  • WANG Qiang 1 ,
  • MA Meng 1 ,
  • LI Yongfeng 1 ,
  • SHAO Dan 1 ,
  • TONG Haibing 1 ,
  • QU Liang , 1, *
Expand
  • 1 Jiangsu Institute of Poultry Sciences, Yangzhou 225125, China
  • 2 Xianglong Poultry Development Co., Ltd. of Yangzhou, Yangzhou 225261, China
* professor, E-mail:

Received date: 2024-12-03

  Online published: 2025-09-12

Fold

Abstract

This experiment was conducted to study the effects of dietary different supplemental levels of fermented feed on laying performance, intestinal morphology, digesta digestive enzyme activities and cecal microbiota of laying hens. A total of 360 Hy-Line brown laying hens at 40 weeks of age were randomly divided into 3 groups with 8 replicates per group and 15 hens per replicates. Hens in the control group were fed a corn-soybean meal basal diet, and others in experimental groups were fed experimental diets containing 5% and 10% fermented feed, respectively. The experiment lasted for 12 weeks. The results showed as follows: 1) there were no significant differences in laying rate, average egg weight, daily average egg weight, average daily feed intake and feed to egg ratio among all groups (P>0.05). 2) The gizzard weight of 5% and 10% fermented feed groups was significantly lower than that of the control group (P<0.05), and the gizzard relative weight of 10% fermented feed group was significantly lower than that of the control group (P<0.05). 3) The villus height in jejunum of 5% fermented feed group and the villus height and villus height/crypt depth ratio in jejunum of 10% fermented feed group were significantly higher than those in control group (P<0.05). 4) The jejunal digesta lipase activity of 5% and 10% fermented feed groups was significantly higher than that in control group (P<0.05). 5) The Observed species index and Shannon index of cecal microbiota of 10% fermented feed group were significantly higher than those of the control group (P<0.01). At the phyla level, the relative abundances of Proteobacteria and Verrucomicrobiota in cecum of 10% fermented feed group were significantly higher than those of the control group (P<0.01), the relative abundance of Actinobacteriota in cecum was significantly lower than that of the control group (P<0.01), and the relative abundances of Synergistota and Verrucomicrobiota in cecum were significantly higher than those of 5% fermented feed group (P<0.05). 6) The microbial groups that played an important role in 5% fermented feed group were concentrated in the Ruminococcaceae, and in the 10% fermented feed group were concentrated in the Akkermansiaceae. In conclusion, the use of fermented feed in the diet can improve the jejunal morphology of laying hens, enhance the jejunal digestive enzyme activity, and increase the species richness, diversity index and beneficial microorganisms’ numbers. Comprehensive analysis, it is recommended to use fermented feed at a level of 10% in diet for laying hens after the laying peak period.

Key words： fermented feed; laying hens; intestinal morphology; digestive enzymes activity; intestinal microbiota

Cite this article

LU Jian , GUO Wei , ZHANG Xin , YANG Xiaodong , WANG Qiang , MA Meng , LI Yongfeng , SHAO Dan , TONG Haibing , QU Liang . Effects of Fermented Feed on Laying Performance, Intestine Morphology, Digesta Digestive Enzyme Activities and Cecal Microbiota of Laying Hens[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2025 , 37(9) : 5863 -5876 . DOI: 10.12418/CJAN2025.477

发酵饲料是使用农业农村部《饲料原料目录》和《饲料添加剂品种目录》中的饲料原料、菌种和添加剂,通过发酵工程、酶工程等发酵工程技术开发的生物饲料产品,主要包括发酵饲料、酶解饲料、菌酶协同发酵饲料和生物饲料添加剂4类[1]。近年来,我国常规饲料原料短缺和进口依赖性强的问题已成为制约蛋鸡产业可持续发展的重要因素,农业农村部《“十三五”全国农业农村信息化发展规划》指出,生物饲料产业的发展是养殖业供给侧结构改革的重要突破口,是解决畜牧业可持续发展的重要途径。因此,研究发酵饲料在蛋鸡上的应用对促进农副产品资源饲料资源化利用、降低蛋鸡养殖成本、实现蛋鸡养殖玉米和豆粕减量替代以及无抗养殖和减排环保等方面具有重要意义。研究表明,发酵过程中微生物产生的酶、有机酸、益生菌等生物活性物质可以将饲料原料中的抗营养因子和生物聚合物分解成更容易吸收的简单营养物质[2-3],提高营养物质的利用率[4-5],减少粪便中氮含量和氨气排放[6];在肉鸡和水禽上的研究发现,有益微生物的生长可以阻止有害菌在肠道定植,在肠道形成微生物屏障,降低发病率[7-8];在蛋鸡上研的究发现,饲粮中使用适宜水平发酵饲料可以显著提高机体抗氧化能力[9-10],降低饲料转化率[11],增加鸡蛋蛋白高度、哈氏单位[11]、蛋壳强度[12-13]、小黄卵泡数量、大白卵泡数量[12]以及血清卵泡刺激素和黄体生成素水平等[12],对产蛋性能无不良影响[14]。由此可见,饲粮中使用适宜水平发酵饲料对提高蛋鸡饲料转化率、改善蛋品质、促进生殖器官发育、提高机体抗氧化能力和血清激素水平等具有良好的作用。然而,发酵饲料研发及其在蛋鸡上的应用还处于起步阶段,饲粮中使用发酵饲料对蛋鸡消化道健康和肠道菌群影响的系统研究较少。因此,本试验旨在研究饲粮中使用不同水平发酵饲料对蛋鸡产蛋性能、消化道组织形态、食糜消化酶活性和盲肠微生物的影响,为蛋鸡饲粮中使用发酵饲料提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验动物为38周龄体况良好、产蛋率和体重接近的海兰褐蛋鸡,饲养于江苏省家禽科学研究所试验基地。
试验用发酵饲料的主要发酵原料为小麦麸、喷浆玉米皮、玉米和豆粕等,配比为70∶20∶5∶5。发酵用复合菌粉主要含枯草芽孢杆菌(8.0×109 CFU/g)、地衣芽孢杆菌(7.0×109 CFU/g)、酵母菌(5.0×109 CFU/g)和乳酸菌(1.0×1011 CFU/g)。将复合菌粉以1∶40(质量体积比)的比例溶于37 ℃水中,搅拌均匀为稀释混合菌液,将稀释混合菌液和发酵原料按1∶99(质量比)充分混匀,调节混合后饲料水分含量不超过40%。堆积槽式发酵时加盖保温层(保温海绵),37 ℃好氧发酵48 h,然后将饲料转移到自封袋中,室温厌氧发酵72 h。

1.2 试验设计

本试验经江苏省家禽科学研究所试验动物福利与动物实验伦理审查委员会批准(No.2022—0015)。选用38周龄海兰褐蛋鸡360只,随机分成3个组,每组8个重复,每个重复15只。38~39周龄,各组蛋鸡均饲喂玉米-豆粕型基础饲粮,平均产蛋率(94.22%、94.15%、94.28%)差异不显著(P>0.05)。40~52周龄,对照组饲喂玉米-豆粕型基础饲粮,试验组分别饲喂含有5%和10%发酵饲料的试验饲粮。试验期12周。

1.3 试验饲粮与饲养管理

发酵饲料代谢能采用全收粪法测定,pH采用pH计测定,水分、粗蛋白质、粗纤维、钙和总磷含量分别按照GB/T 6435—2014、GB/T 6432—2018、GB/T 6434—2022、GB/T 6436—2018和GB/T 6437—2018方法测定,枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌数量分别按照GB/T 26428—2010、NY/T 1461—2007、SN/T 5090.1—2018和GB 4789.35—2023方法测定。发酵饲料营养水平见表1。
表1 发酵饲料营养水平和细菌数量(风干基础)

Table 1 Nutrient levels and bacteria numbers of fermented feed (air-dry basis)

项目Items 含量Content
水分Moisture/% 38.45
pH 4.23
代谢能ME/(MJ/kg) 8.45
粗蛋白质CP/% 19.29
粗纤维CF/% 1.13
钙Ca/% 0.15
总磷TP/% 0.83
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis/(CFU/g) 2.0×107
地衣芽孢杆菌
Bacillus licheniformis/(CFU/g)		 3.9×107
酵母菌Yeast/(CFU/g) 3.0×109
乳酸菌Lactic acid bacteria/(CFU/g) 3.0×108

实测值 measured values。

参照《海兰褐饲养管理手册(2021版)》推荐的营养需要配制试验饲粮,其组成及营养水平见表2。饲粮水分、粗蛋白质、粗纤维、钙和总磷含量测定方法同发酵饲料,氨基酸含量按照GB/T 18246—2019方法测定。营养水平(计算值)参考《中国饲料成分及营养价值表(2022年第33版)》计算得出。试验鸡采用《海兰褐饲养管理手册(2021版)》中的饲养管理技术和密闭式鸡舍光照程序,3层个体阶梯笼饲养,自由采食和饮水。
表2 试验饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 2 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) %

项目
Items		 发酵饲料添加水平
Fermented feed supplemental levels/%
0 5 10
原料Ingredients
玉米Corn 62.50 60.25 57.90
豆粕Soybean meal 23.00 21.05 19.20
发酵饲料Fermented feed 5.00 10.00
石粉Limestone 9.50 9.50 9.50
沸石粉Zeolite powder 2.00 1.00
大豆油Soybean oil 1.00 1.20 1.40
磷酸氢钙CaHPO4 1.00 1.00 1.00
食盐NaCl 0.35 0.35 0.35
胆碱Choline (50%) 0.15 0.15 0.15
DL-蛋氨酸DL-Met 0.20 0.20 0.20
预混料Premix 0.30 0.30 0.30
合计Total 100.00 100.00 100.00
营养水平(计算值) Nutrient levels (calculated values)
代谢能ME/(MJ/kg) 11.09 11.08 11.09
粗蛋白质CP 16.00 15.99 16.00
可消化氨基酸Digestible amino acids
蛋氨酸Met 0.45 0.45 0.44
赖氨酸Lys 0.77 0.74 0.72
蛋氨酸+胱氨酸Met+Cys 0.73 0.73 0.72
色氨酸Try 0.18 0.17 0.17
苏氨酸Thr 0.55 0.54 0.53
钙Ca 3.90 3.90 3.90
总磷TP 0.45 0.46 0.47
非植酸磷NPP 0.24 0.24 0.25
营养水平(实测值) Nutrient levels (measured values)
水分Moisture 12.27 13.09 14.58
粗蛋白质CP 16.08 16.02 16.10
粗纤维CF 2.62 2.53 2.45
赖氨酸Lys 0.75 0.74 0.77
蛋氨酸Met 0.44 0.45 0.46
钙Ca 3.95 4.02 3.82
总磷TP 0.42 0.46 0.44

预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of diets:VA 8 800 IU,VD3 3 300 IU,VE 20 IU,VB12 23 μg,核黄素 riboflavin 5.5 mg,烟酸 niacin 30 mg,泛酸 pantothenic acid 8 mg,VK3 1.2 mg,叶酸 folic acid 1.75 mg,吡哆醇 pyridoxine 1.2 mg,硫胺素 thiamine 1.7 mg,生物素 biotin 55 μg,Cu [Cu2(OH)3Cl] 8.12 mg,Fe (FeSO4·H2O) 80.1 mg,Zn (ZnSO4·H2O) 80.04 mg,I [Ca(IO3)2] 1.2 mg,Se (Na2SeO3) 0.3 mg。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 产蛋性能测定

每天09:00准时收蛋,以重复为单位准确记录产蛋数和蛋重。每周末定时退料、称重,统计各重复的实际采食量。根据试验记录,整理统计各试验组蛋鸡产蛋率、平均蛋重、日均蛋重、平均日采食量和料蛋比。

1.4.2 消化道组织形态测定

试验期第12周末,每重复选取接近平均体重和平均产蛋率的蛋鸡各1只,每组8只,屠宰后分离腺胃、肌胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和直肠,测量十二指肠、空肠、回肠、盲肠和直肠的长度,称量腺胃和肌胃重量,分别计算其与体重的比值。
空肠中段处取1~2 cm肠段,置于装有4%多聚甲醛的10 mL离心管中固定,用于切片制作。固定好的肠段经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片、苏木精-伊红(HE)染色和封片等程序制作切片,光学显微镜40×镜下观察,LY-WN-HP SUPPER CCD软件测量肠壁肌层厚度、绒毛高度和隐窝深度等,并计算绒隐比(绒毛高度与隐窝深度的比值)。

1.4.3 小肠食糜pH和消化酶活性测定

用pH计测定十二指肠、空肠和回肠中段食糜的pH,然后将空肠和回肠中段食糜挤入冻存管中,置于液氮速冻,用于测定α-淀粉酶和脂肪酶活性。测定时按试剂盒测定要求用生理盐水稀释匀浆,1 288.80×g离心取上清,用试剂盒测定消化酶活性,试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.4.4 盲肠微生物测定

蛋鸡屠宰后,快速取2 mL盲肠内容物至无菌冻存管中,液氮中充分速冻后转入-80 ℃超低温冰箱中保存。肠道微生物多样性由北京诺禾生物信息技术有限公司测定。

1.5 统计分析

数据采用SPSS 15.0软件进行单因子方差分析(one-way ANOVA),以重复为试验数据单元,差异显著时用Duncan氏法进行多重比较;非参数检验检测盲肠微生物16S的组间差异显著性。0.05≤P<0.10表示存在差异显著的趋势,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 发酵饲料对40~52周龄蛋鸡产蛋性能的影响

由表3可知,各组之间蛋鸡产蛋率、平均蛋重、日均蛋重、平均日采食量和料蛋比均差异不显著(P>0.05)。
表3 发酵饲料对40~52周龄蛋鸡产蛋性能的影响

Table 3 Effects of fermented feed on laying performance of laying hens aged from 40 to 52 weeks

项目
Items		 发酵饲料添加水平
Fermented feed supplemental levels/%		 SEM P值P-value
0(对照组
Control group)		 5 10 方差分析
ANOVA		 线性
Linear		 二次
Quadratic
产蛋率Laying rate/% 92.40 93.65 94.28 0.902 0.949 0.616 0.864
平均蛋重
Average egg weight/g		 64.28 65.23 63.13 0.353 0.414 0.434 0.324
日均蛋重
Average daily egg weight/(g/d)		 59.39 61.08 59.51 0.692 0.872 0.956 0.772
平均日采食量
Average daily feed intake/(g/d)		 119.28 124.75 123.75 0.983 0.159 0.041 0.296
料蛋比Feed to egg ratio 2.01 2.04 2.08 0.024 0.673 0.272 0.729

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 发酵饲料对52周龄蛋鸡消化道器官指数的影响

由表4可知,5%和10%发酵饲料组蛋鸡肌胃重量显著低于对照组(P<0.05),10%发酵饲料组蛋鸡肌胃相对重量显著低于对照组(P<0.05)。随发酵饲料添加量增加,空肠、回肠和盲肠长度以及空肠和盲肠相对长度有线性降低的趋势(0.05<P<0.10)。各组之间蛋鸡十二指肠和直肠长度和相对长度均差异不显著(P>0.05)。
表4 发酵饲料对52周龄蛋鸡消化道器官指数的影响

Table 4 Effects of fermented feed on digestive tract organ indexes of laying hens at 52 weeks of age

项目
Items		 发酵饲料添加水平
Fermented feed supplemental levels/%		 SEM P值P-value
0(对照组
Contro group)		 5 10 方差分析
ANOVA		 线性
Linear		 二次
Quadratic
重量Weight/g
腺胃Proventriculus 8.78 8.51 9.00 0.431 0.907 0.840 0.698
肌胃Gizzard 25.39a 22.28b 21.91b 0.618 0.033 0.017 0.252
相对重量Relative weight/(g/kg BW)
腺胃Proventriculus 4.27 4.32 4.49 0.206 0.906 0.674 0.899
肌胃Gizzard 12.34a 11.31ab 10.97b 0.263 0.041 0.033 0.509
长度Length/cm
十二指肠Duodenum 29.06 28.33 29.06 0.404 0.709 1.000 0.412
空肠Jejunum 65.84 65.75 59.38 1.594 0.067 0.040 0.345
回肠Ileum 58.79 55.86 51.83 2.025 0.087 0.075 0.898
盲肠Caecum 18.06 15.29 14.78 0.834 0.081 0.054 0.520
直肠Colon 9.09 8.45 7.84 0.363 0.390 0.175 0.987
相对长度Relative length/(cm/kg BW)
十二指肠Duodenum 14.14 14.37 14.58 0.195 0.679 0.385 0.984
空肠Jejunum 32.00 33.34 29.83 0.783 0.085 0.054 0.145
回肠Ileum 28.54 28.31 26.02 0.952 0.111 0.099 0.620
盲肠Caecum 8.74 7.76 7.41 0.376 0.092 0.061 0.702
直肠Colon 4.41 4.28 3.93 0.175 0.529 0.281 0.767

2.3 发酵饲料对52周龄蛋鸡空肠组织形态的影响

由表5可知,5%发酵饲料组空肠绒毛高度显著高于对照组(P<0.05);10%发酵饲料组空肠绒毛高度和绒隐比均显著高于对照组(P<0.05);10%发酵饲料组空肠肌层厚度显著低于5%发酵饲料组(P<0.05),但与对照组差异不显著(P>0.05)。各组之间蛋鸡空肠隐窝深度差异不显著(P>0.05)。
表5 发酵饲料对52周龄蛋鸡空肠组织形态的影响

Table 5 Effects of fermented feed on jejunum morphology of laying hens at 52 weeks of age

项目
Items		 发酵饲料添加水平
Fermented feed supplemental levels/%		 SEM P值P-value
0(对照组
Control group)		 5 10 方差分析
ANOVA		 线性
Linear		 二次
Quadratic
肌层厚度
Muscular thickness/μm		 283.18ab 301.77a 234.34b 11.189 0.037 0.070 0.065
绒毛高度Villus height/μm 943.80b 1 021.33a 1 042.21a 37.074 0.028 0.028 0.721
隐窝深度Crypt depth/μm 149.02 166.13 146.29 4.245 0.117 0.790 0.041
绒隐比Villus height/crypt depth 6.45b 6.19b 7.26a 0.237 0.039 0.035 0.184

2.4 发酵饲料对52周龄蛋鸡小肠食糜消化酶活性和pH的影响

由表6可知,空肠食糜脂肪酶活性随发酵饲料添加量增加呈先增加后降低的二次曲线(P<0.05),5%和10%发酵饲料组空肠食糜脂肪酶活性均显著高于对照组(P<0.05),其中5%发酵饲料组空肠食糜脂肪酶活性显著高于10%发酵饲料组(P<0.05)。各组之间蛋鸡空肠α-淀粉酶活性、回肠α-淀粉酶和脂肪酶活性以及十二指肠、空肠和回肠pH均差异不显著(P>0.05)。
表6 发酵饲料对52周龄蛋鸡小肠食糜消化酶活性和pH的影响

Table 6 Effects of fermented feed on digestive enzyme activities and pH in small intestinal digesta of laying hens at 52 weeks of age

项目
Items		 发酵饲料添加水平
Fermented feed supplemental levels/%		 SEM P值P-value
0(对照组
Control group)		 5 10 方差分析
ANOVA		 线性
Linear		 二次
Quadratic
空肠食糜Jejunum digesta
α-淀粉酶
Amylase/(U/mg prot)		 61.38 56.14 55.64 6.702 0.573 0.357 0.616
脂肪酶Lipase/(U/g prot) 37.06c 75.97a 55.00b 6.143 0.027 0.190 0.016
回肠食糜Ileum digesta
α-淀粉酶
Amylase/(U/mg prot)		 22.10 31.37 23.97 2.599 0.318 0.769 0.142
脂肪酶Lipase/(U/g prot) 28.55 26.96 27.26 1.806 0.943 0.791 0.814
pH
十二指肠Duodenum 6.07 6.15 5.99 0.042 0.307 0.463 0.178
空肠Jejunum 5.89 5.98 5.86 0.089 0.858 0.875 0.601
回肠Ileum 6.17 6.44 6.69 0.139 0.326 0.139 0.973

2.5 发酵饲料对52周龄蛋鸡盲肠微生物的影响

2.5.1 发酵饲料对蛋鸡盲肠微生物多样性以及操作分类单元(OTU)数量的影响

Alpha多样性分析结果显示(图1-A、图1-B),10%发酵饲料组盲肠微生物的Shannon指数和Observed species指数均极显著高于对照组(P<0.01),表明10%发酵饲料组蛋鸡盲肠微生物菌群物种分布较均匀。Beta多样性分析结果显示(图1-C、图1-D),5%发酵饲料组和10%发酵饲料组重叠较多,2组之间主坐标分析(PCoA)聚类相似性较大,物种组成相似,与对照组具有一定的差异。Venn图分析结果显示(图1-E),对照组、5%发酵饲料组和10%发酵饲料组的特有OTU数量分别为91、112和106个,3组共有OTU数量为1 063个。
图1 发酵饲料对蛋鸡盲肠微生物多样性指数以及OTU数量的影响

C:对照组;FF.5:5%发酵饲料组;FF.10:10%发酵饲料组。*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01)。下图同。C: control group; FF.5: 5% fermented feed group; FF.10: 10% fermented feed group. ** indicated significant difference (P<0.05), and ** indicated extremely significant difference (P<0.01). The same as below.

A:Observed species指数;B:Shannon指数;C:主坐标分析;D:非度量多维尺度分析;E:Venn图。A: Observed species index; B: Shannon index; C: principal co-ordinates analysis; D: non-metric multi-dimensional scaling analysis; E: Venn graph.

Fig.1 Effects of fermented feed on microbial diversity index and OTU number in cecum of laying hens

2.5.2 发酵饲料对蛋鸡盲肠微生物组成的影响

对所有样品门、科、属水平相对丰度前10的盲肠微生物类别进行分析发现,在门水平上,相对丰度前10的菌门分别为拟杆菌门(Bacteroidota,53.08%)、厚壁菌门(Firmicutes,32.87%)、热脱硫杆菌门(Desulfobacterota,2.44%)、疣微菌门(Verrucomicrobiota,1.10%)、变形菌门(Proteobacteria,1.08%)等(图2-A);在科水平上,相对丰度前10的菌科分别为拟杆菌科(Bacteroidaceae,26.11%)、理研菌科(Rikenellaceae,9.75%)、毛螺菌科(Lachnospiraceae,9.35%)、乳酸杆菌科(Lactobacillaceae,5.25%)、氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae,3.60%)等(图2-B);在属水平上,相对丰度前10的菌属分别为拟杆菌属(Bacteroides,26.11%)、理研菌科RC9肠道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group,8.29%)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium,3.60%)、瘤胃球菌属torques群([Ruminococcus] torques group,3.10%)等(图2-C)。
图2 发酵饲料对蛋鸡盲肠微生物门、科、属水平相对丰度的影响

A:门水平上物种相对丰度柱形图;B:科水平上物种相对丰度柱形图;C:属水平上物种相对丰度柱形图。

Fig.2 Effects of fermented feed on relative abundance of species at phylum, family and genus levels of laying hens

A: relative abundance of species at phylum level; B: relative abundance of species at family level; C: relative abundance of species at genus level.

在门水平上,对照组盲肠放线菌门(Actinobacteriota)相对丰度极显著高于10%发酵饲料组(图3-A,P<0.01),盲肠Proteobacteria和Verrucomicrobiota相对丰度极显著低于10%发酵饲料组(图3-B、图3-D,P<0.01);10%发酵饲料组盲肠互养菌门(Synergistota)和Verrucomicrobiota相对丰度显著高于5%发酵饲料组(图3-C、图3-D,P<0.05)。
图3 发酵饲料对蛋鸡盲肠微生物门水平差异菌相对丰度的影响

A:放线菌门相对丰度;B:变形菌门相对丰度;C:互养菌门相对丰度;D:疣微菌门相对丰度。

Fig.3 Effects of fermented feed on relative abundance of differential bacteria at phylum levels of laying hens

A: relative abundance of Actinobacteriota; B: relative abundance of Proteobacteria; C: relative abundance of Synergistota; D: relative abundance of Verrucomicrobiota.

各组组间群落差异的核心菌群分析发现,对照组、5%发酵饲料组和10%发酵饲料组中相对丰度显著差异(LDA得分≥3.5)的物种种类分别为7、3和6(图4-A)。线性判别分析效应量(LefSe)分析发现(图4-B),对照组中起重要作用的微生物类群集中在芽孢杆菌纲(Bacilli)中乳酸杆菌目(Lactobacillales)中乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、韦荣氏球菌目(Veillonellales)和月形单胞菌目(Selenomonadales);5%发酵饲料组中起重要作用的微生物类群集中在颤螺旋菌目(Oscillospirales)中瘤胃球菌科(Ruminococcaceae);10%发酵饲料组中起重要作用的微生物类群集中在疣微菌纲(Verrucomicrobiae)中疣微菌目(Verrucomicrobiales)中阿克曼菌科(Akkermansiaceae)。
图4 LDA得分分布柱状图(A)和进化分支图(B)

Fig.4 LDA score distribution histogram (A) and cladogram (B)

2.5.3 发酵饲料对蛋鸡盲肠微生物的功能预测

使用Tax4fun分析预测各组蛋鸡盲肠微生物区系的功能差异,由图5可知,对照组蛋鸡盲肠微生物功能显著富集的通路有8条,分别是同源重组、嘌呤代谢、DNA复制蛋白、错配修复、半乳糖代谢、嘧啶代谢、DNA修复和重组蛋白、肽聚糖生物合成和降解蛋白;5%发酵饲料组蛋鸡盲肠微生物功能无显著富集通路;10%发酵饲料组蛋鸡盲肠微生物功能显著富集的通路有16条,分别是原核生物中的碳固定途径、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、丙酮酸代谢、线粒体生物合成、乙醛酸和二羧酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、分泌系统、柠檬酸盐循环、群体感应、氨酰基tRNA生物合成、伴侣和折叠催化剂、核糖体、核糖体生物合成、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、胞外体、氨基酸相关酶。
图5 发酵饲料对蛋鸡盲肠微生物功能预测

Fig.5 Effects of fermented feed on microbial function in cecum of laying hens

3 讨论

3.1 发酵饲料对40~52周龄蛋鸡产蛋性能的影响

本研究结果表明,饲粮中使用5%和10%的发酵饲料对40~52周龄海兰褐蛋鸡产蛋性能无不良影响。由于发酵饲料的发酵原料、菌种、发酵工艺等以及蛋鸡品种和周龄等差异,饲粮中使用不同水平发酵饲料对蛋鸡产蛋性能影响的研究结果并不一致,研究表明,饲粮中使用2.5%发酵玉米-豆粕饲料[15]、3%发酵菜粕饲料[14]、4%发酵豆粕饲料[12]以及6%克氏乳杆菌发酵饲料或唾液酸乳杆菌发酵饲料[11]对蛋鸡产蛋性能均无不良影响,但使用高水平的发酵杂粕或棉籽粕饲料(8%发酵杂粕[12],7.5%、15.0%、22.5%、30.0%发酵棉籽粕[13])显著降低了蛋鸡产蛋率。本研究为40~52周龄海兰褐蛋鸡,试验前根据个体产蛋记录选取产蛋率相近的蛋鸡,平均产蛋率相对较高,使用5%和10%发酵饲料后未改善蛋鸡产蛋性能,也未产生不良影响。本研究结果可能与发酵饲料原料、菌种以及各试验组饲粮营养水平有关。本试验使用发酵饲料的发酵原料主要为小麦麸、玉米胚芽粕、玉米和豆粕,均为蛋鸡饲粮中常规原料,采用的发酵菌株为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌,各试验组饲粮中粗蛋白质、钙、总磷等主要营养物质含量基本相同,此外,发酵饲料中的有益菌等可以减少抗营养因子的含量,可能改善了鸡群健康状态[2-3]。因此,使用含发酵饲料的饲粮后对蛋鸡产蛋性能未产生不良影响。

3.2 发酵饲料对52周龄蛋鸡消化道器官指数的影响

胃肠道是家禽消化吸收营养物质的重要器官,家禽的腺胃分泌含蛋白酶和盐酸的胃液,饲粮中蛋白质在腺胃初步消化后进入肌胃,饲粮在肌胃中磨碎并与消化酶进一步混合,小肠肠液中的消化酶对饲粮中蛋白质、脂肪和淀粉等进行分解,分解后的营养物质被肠黏膜吸收到血液和淋巴[16]。本研究发现,饲喂发酵饲料12周后,5%和10%发酵饲料组蛋鸡肌胃重量以及10%发酵饲料组肌胃相对重量均显著低于对照组,空肠、回肠和盲肠长度随发酵饲料添加量增加有线性减小的趋势。与本研究结果不同,有研究发现,发酵饲料减缓了脂多糖(LPS)诱导疫应激肉鸡十二指肠和空肠相对重量的下降[17]。有关发酵饲料对蛋鸡胃肠道器官指数影响的研究较少,饲粮营养水平、微生物菌群、形态、颗粒大小和摄入量等都是影响胃肠道器官指数的重要因素[18]。本试验中,使用发酵饲料增加了蛋鸡肠道微生物区系的物种丰富度和多样性指数,改善了蛋鸡的空肠组织形态,提高了空肠消化酶活性,说明使用发酵饲料在一定程度上改善了蛋鸡肠道健康,但使用发酵饲料显著影响了蛋鸡肌胃重量,其原因有待进一步研究。

3.3 发酵饲料对52周龄蛋鸡空肠组织形态的影响

小肠是分解饲粮营养物质的重要消化器官,肠黏膜是营养物质吸收的主要部位,肠黏膜上的绒毛直接参与营养物质的吸收,绒毛高度决定了与营养物质的接触面积,绒毛高度越高与营养物质接触面积越大,对营养物质的吸收效率越高。本研究发现,发酵饲料组蛋鸡空肠绒毛高度均显著高于对照组,10%发酵饲料组空肠绒隐比显著高于对照组。与本研究结果相似,前人研究发现饲粮中添加4%发酵豆粕或发酵杂粕显著增加了空肠绒毛高度、隐窝深度和和绒隐比[12];饲粮中添加4%、6%和8%发酵玉米豆粕饲料显著减小了蛋鸡空肠隐窝深度,增加了绒隐比[19]。本试验结果表明,饲喂发酵饲料对蛋鸡空肠形态有改善作用,说明蛋鸡饲粮中使用发酵饲料改善了蛋鸡肠道健康状态,发酵饲料中的有益菌及其产生的外源酶可能是改善肠道组织形态的原因之一。研究发现,使用乳杆菌发酵饲料显著提高了蛋鸡十二指肠和回肠的绒隐比及空肠绒毛高度[11]。但是,本研究在5%发酵饲料组发现了隐窝深度较对照组增加了11.48%(166.13 μm vs 149.02 μm),理论上绒毛高度和隐窝深度增加时隐窝深度会不变或减小,但本研究中5%发酵饲料组蛋鸡空肠绒毛高度、绒隐比和隐窝深度同时增加,此结果与Lu等[12]研究结果一致,其原因有待进一步的研究分析。

3.4 发酵饲料对52周龄蛋鸡小肠食糜消化酶活性和pH的影响

小肠肠液以及流入的胰液含有蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶,胆囊分泌的胆汁可以乳化脂肪促进消化,消化酶活性与对蛋白质、脂肪和淀粉的消化利用率密切相关。本研究发现,发酵饲料组空肠食糜脂肪酶活性显著高于对照组,但发酵饲料对各肠段食糜pH无显著影响。刘莹露等[19]使用含4%、6%和8%发酵玉米-豆粕饲料的饲粮饲喂26~52周龄京粉6号蛋鸡,发现35周龄空肠食糜胰蛋白酶和脂肪酶活性显著提高,但对50周龄小肠食糜消化酶活性无显著影响。本研究中,使用发酵饲料同时增加了蛋鸡空肠绒毛高度和食糜脂肪酶活性,说明发酵饲料对食糜消化酶活性的提高可能与肠道组织形态改善密切相关,这与Hu等[20]研究观点一致,小肠绒毛高度增加能提高消化酶活性。此外,饲粮中添加不同水平益生菌也可以提高蛋鸡肠道黏膜消化酶活性[21]。本试验使用的发酵饲料含有的有益菌及其产生的外源酶可能也是肠道消化酶活性提高的原因之一。

3.5 发酵饲料对52周龄蛋鸡肠道微生物的影响

发酵饲料中的益生菌能够在畜禽肠道定植或繁殖,对畜禽肠道微生物具有一定的调控作用[22]。使用发酵饲料后肉鸭肠道的乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌等有益菌数量均有提升,大肠杆菌和沙门氏菌等有害菌数量均有降低[23]。本研究Alpha多样性结果表明,10%发酵饲料组蛋鸡盲肠微生物的Shannon指数和Observed species指数与对照组有显著差异,微生物菌群物种分布更加均匀;Beta多样性结果表明,发酵饲料组物种组成相似,与对照组有一定差异趋势。
家禽的肠道微生物组成主要由Firmicutes、Bacteroidota、Proteobacteria、Actinobacteriota和梭杆菌门(Fusobacteria)等[24]。张孟阳等[25]饲喂育雏期蛋鸡发酵饲料发现,发酵饲料组蛋鸡肠道Firmicutes相对丰度显著增加,脱硫弧菌属、螺杆菌属等致病菌相对丰度以及Bacteroidota/Firmicutes的比值显著降低,认为发酵饲料改善了雏鸡肠道健康状况。本研究发现,10%发酵饲料组盲肠Proteobacteria和Verrucomicrobiota相对丰度极显著高于对照组,盲肠Synergistota和Verrucomicrobiota相对丰度显著高于5%发酵饲料组,说明饲喂不同水平发酵饲料可以改变产蛋高峰期海兰褐蛋鸡的盲肠微生物组成,改善了盲肠微生物菌群。LEfSe分析各组的标志微生物发现,5%发酵饲料组中起重要作用的微生物类群集中在Oscillospirales的Ruminococcaceae,10%发酵饲料组中起重要作用的微生物类群集中在Verrucomicrobiae中Verrucomicrobiales中Akkermansiaceae。Ruminococcaceae属于Firmicutes,是消化系统和生态环境中常见菌,在维持肠道健康、食物消化等方面发挥了重要作用[26]。Akkermansiaceae在人类多种疾病治疗中具备潜在功能,在代谢调节和免疫治疗中具备良好应用潜力,是应用前景广阔的下一代益生菌及后生元前体菌种[27]。由此可知,发酵饲料改变了蛋鸡的盲肠微生物菌群,增加了有益微生物数量。
消化道微生物参与营养物质的消化、毒素分解、免疫反应、病原微生物清除和宿主内分泌等[28],同时微生物与消化道间的相互作用还会影响微生物的稳定性、消化道组织形态、食糜消化酶活性等,进而影响饲料转化效率[29]。分析差异微生物的功能发现,饲喂发酵饲料后,肠道微生物功能发生很大变化,对照组和10%发酵饲料组蛋鸡盲肠微生物显著富集的通路分别为8和16条,其中10%发酵饲料组蛋鸡盲肠微生物显著富集的通路增加了氨基酸代谢、柠檬酸循环等营养物质代谢通路,表明采食含发酵饲料的饲粮后蛋鸡肠道微生物的功能更加丰富。
综上所述,蛋鸡饲粮中使用发酵饲料可以改变海兰褐蛋鸡的盲肠微生物多样性和组成,增加Ruminococcaceae和Akkermansiaceae等标志性益生菌数量,肠道微生物区系的改变伴随着菌群的功能改善[30-31],使得海兰褐蛋鸡盲肠的菌群功能更丰富,特别是物质代谢相关的通路过程,从而改变宿主蛋鸡的肠道生理和机体健康状况[32]。

4 结论

① 饲粮中使用10%发酵饲料对蛋鸡产蛋性能无不良影响,可提高空肠绒毛高度和绒隐比以及空肠食糜脂肪酶活性。
② 饲粮中使用10%发酵饲料可以改善蛋鸡肠道微生物区系的物种丰富度和多样性指数,提高Proteobacteria、Synergistota、Verrucomicrobiota相对丰度,增加Ruminococcaceae和Akkermansiaceae等有益特征微生物数量,增加氨基酸代谢、柠檬酸循环等营养物质代谢过程的富集通路。
③ 综合分析,建议产蛋高峰期后蛋鸡饲粮中发酵饲料的使用水平为10%。

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