Chinese Journal of Animal Nutrition >

2025 , Vol. 37 >Issue 9: 6448 - 6460

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.523

RESEARCH PAPER

Process Study on Preparation of Feed Protein Additive by Fermentation of Prawn Processing By-Product with Complex Probiotics

  • YU Jiawei , 1, 2 ,
  • ZHANG Yanyan 1, 2 ,
  • LAO Jianlong 1, 2 ,
  • GONG Han 1, 2 ,
  • YANG Xin 1, 2 ,
  • ZHANG Jin 1, 2 ,
  • JU Xianghong 1, 2 ,
  • LI Youquan 1, 2 ,
  • LIU Xiaoxi 1, 2 ,
  • YONG Yanhong 1, 2, *
Expand
  • 1 Department of Veterinary Medicine, College of Coastal Agricultural Sciences, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524000, China
  • 2 Shenzhen Institute of Guangdong Ocean University, Shenzhen 518108, China
* associate professor, E-mail: yongyanhong-007@163.com

Received date: 2024-11-11

  Online published: 2025-09-12

Fold

Abstract

This study utilized complex probiotics to ferment the prawn processing by-product (shrimp heads and shells), and determined the optimal process for preparing the fermentation liquid of prawn processing by-product. Through orthogonal test, the optimal mixing ratio of Lactobacillus acidophilus, Bacillus subtilis and Candida utilis were screened out among the complex probiotics; single-factor tests were carried out on the inoculation volume, initial pH, fermentation temperature, fermentation time, solid-liquid ratio, and glucose addition amount, respectively; then, based on the results of the single-factor tests, the inoculation volume, fermentation temperature and fermentation time were optimized by response surface method to determine the optimal process of fermentation of shrimp head shell waste with complex probiotics. The fermentation liquid of prawn processing by-product was mixed with compound feed in a 1∶1 ratio, and the changes in nutritional components were analyzed. The results showed as follows: 1) The optimal mixing ratio of Lactobacillus acidophilus, Bacillus subtilis and Candida utilis screened out by the orthogonal test was 2∶1∶2. 2) Through single factor test and response surface test, the optimal process of fermentation of prawn processing by-products was inoculation volume 16%, initial pH 6.5, temperature 38.5 ℃, fermentation for 48 h, solid-liquid ratio 1∶1.5, glucose addition amount 15%. 3) The protein recovery rate of fermentation liquid of prawn processing by-product was (94.7±0.3)%; after being mixed 1∶1 with compound feed, the crude protein content in the feed could be increased by 9.16%, and the total amount of 17 kinds of amino acids could be increased by 2.63%. The results of this study have reference value for enhancing the utilization value of prawn processing by-product and promoting their high-value processing.

Key words： complex probiotic; prawn processing by-product; protein recovery; resource utilization

Cite this article

YU Jiawei , ZHANG Yanyan , LAO Jianlong , GONG Han , YANG Xin , ZHANG Jin , JU Xianghong , LI Youquan , LIU Xiaoxi , YONG Yanhong . Process Study on Preparation of Feed Protein Additive by Fermentation of Prawn Processing By-Product with Complex Probiotics[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2025 , 37(9) : 6448 -6460 . DOI: 10.12418/CJAN2025.523

我国对虾加工的目的主要是生产冷冻虾仁,这一过程中产生的副产物占整虾的30%~40%,虾头、虾壳等副产物含有蛋白质、脂肪、矿物质和甲壳素等营养成分,但利用率低,大部分被丢弃,仅少量用于饲料或肥料,导致资源浪费和环境的污染[1-3]。研究表明,饲料中添加虾壳粉可有效改善斑马鱼的脂质代谢能力[4],虾壳蛋白质水解物富含多种必需氨基酸[5],虾壳活性肽对斑马鱼的氧化应激损伤有保护作用[6],虾壳抗氧化肽对秀丽隐杆线虫具有抗氧化保护作用[7]。
目前,对虾加工副产物的蛋白质回收方法主要有碱法萃取、酶法水解、微生物发酵等。其中碱法萃取虽成本低廉且操作简便,但蛋白质提取率低,易造成污染,且难以控制蛋白质水解程度,反应剧烈且容易导致氨基酸受到不同程度的损伤[8]。酶法水解虽然过程易操控、反应条件温和,且碱性蛋白酶处理对壳聚糖的回收率和质量无显著影响[9],但大批量生产时成本较高且水解过程易发生腐败,还存在蛋白质酶解液易因操作不当产生腥臭味和苦涩味的问题[10]。微生物发酵技术是运用了微生物的代谢功能,不仅可改善蛋白质的品质,还能生成易消化吸收的小肽、氨基酸等成分,使加工废弃物转变为高价值的发酵产品[11]。采用微生物对虾壳进行脱蛋白,不仅条件温和无污染,还能使蛋白质资源得到合理利用[12]。
本研究先通过正交试验确定复合益生菌中嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、产朊假丝酵母(Candida utilis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的混合比例,在此基础上采用单因素试验对接种量、发酵温度、发酵时间、初始pH、固液比和葡萄糖添加量进行筛选,并结合响应面试验确定复合益生菌发酵对虾加工副产物制备对虾加工副产物的最佳工艺,再将制备的对虾加工副产物发酵液与配合饲料以适宜比例混合,分析饲料营养成分变化,以期为充分利用对虾加工副产物制备饲料蛋白质添加剂提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

对虾加工副产物(虾头、虾壳)由广东湛江华翰生物科技有限公司提供。将对虾加工副产物切成小块,用破壁机将其搅拌均匀,然后分装,并存于-20 ℃的冰箱内,使用时取出,用自来水解冻。配合饲料(膨化小猪料)由广东茂名鼎壹饲料有限公司提供,将其粉碎后过40目筛备用。嗜酸乳杆菌(CGMCC 1.2686)、产朊假丝酵母(CGMCC 2.1180)购于广东微生物菌种保藏中心;枯草芽孢杆菌(CGMCC1.921)为本实验室保藏菌种。LB液体培养基:氯化钠10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g,蒸馏水定容至1 000 mL,121 ℃灭菌15 min。MRS液体培养基:葡萄糖20.0 g、蛋白胨10.0 g、牛肉膏8.0 g、酵母膏4.0 g、硫酸镁0.5 g、硫酸锰0.3 g、柠檬酸铵2.0 g、乙酸钠5.0 g、吐温-80 1.0 mL,蒸馏水定容至1 000 mL,121 ℃灭菌15 min。YM液体培养基:葡萄糖20.0 g、蛋白胨20.0 g、酵母粉10.0 g,蒸馏水定容至1 000 mL,121 ℃灭菌15 min。固体培养基在上述液体培养基基础上加20 g琼脂。对虾加工副产物和配合饲料营养成分如表1所示。
表1 对虾加工副产物和配合饲料营养成分

Table 1 Nutrients of prawn processing by-product and compound feed

项目
Items		 对虾加工副产物
Prawn processing by-product		 配合饲料
Compound feed
水分Moisture/% 8.4±0.5 14.2±0.2
粗蛋白质CP/% DM 15.1±0.2 16.3±0.4
粗纤维CF/% DM 4.3±0.2 7.9±0.2
粗灰分Ash/% DM 10.1±0.2 7.9±0.2

1.2 仪器与设备

GK-600凯氏自动定氮仪:山东格林凯瑞精密仪器有限公司;V-388S全自动氨基酸分析仪:山东蓝景电子科技有限公司;马弗炉:洛阳科热炉业有限公司;FE28-2台式pH计:梅特勒托多有限公司;MJ-PB50SF破壁机:佛山美的集团股份有限公司;DHP-9162恒温培养箱:广州吉电仪器有限公司;JS-400A恒温振荡器:上海培清科技有限公司;DZKW-S恒温水浴锅:上海精密仪器有限公司;SW-CJ-2F超净工作台:上海博迅实业有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 试验菌株的活化

将嗜酸乳杆菌、产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌的保存管于低温保存条件中取出,置于37 ℃浴槽小试管架上,不断轻微摇动保存管,直至冰完全溶解,用无菌微量吸管从保存管吸取1~2滴菌液,以划线法接种于各固体培养基(嗜酸乳杆菌:MRS固体培养基;产朊假丝酵母:YM固体培养基;枯草芽孢杆菌:LB固体培养基),将接种好的各固体培养基置于37 ℃的培养箱中培养24 h。

1.3.2 种子发酵液的制备

将MRS固体培养基中的嗜酸乳杆菌接种到200 mL MRS液体培养基中,37 ℃静置培养24 h;将YM固体培养基中的产朊假丝酵母接种到200 mL YM液体培养基中,37 ℃、100 r/min培养24 h;将LB固体培养基中的枯草芽孢杆菌接种到200 mL LB液体培养基,37 ℃、100 r/min 培养24 h。将上述培养好的菌液按5%的接种量接种到上述各菌株对应的液体培养基中培养48 h,制成种子发酵液。

1.3.3 试验菌株生长曲线的测定

用未接菌的各菌株的液体培养基作为空白对照,在600 nm波长下每隔4 h用紫外分光光度计测定接种菌株的各液体培养基的吸光度(OD600)值,根据生长曲线确定各菌株的培养时间。

1.3.4 正交试验优化复合益生菌中3种菌株的混合比例

为确定复合益生菌中嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母的混合比例,以蛋白质水解度为评价指标,进行3因素3水平的正交试验。正交试验因素与水平见表2。对虾加工副产物的固态发酵:在500 mL锥形瓶中加入50 g对虾加工副产物,再加入蒸馏水使初始固液比为1∶2(质量比),复合益生菌接种量10%(质量分数),20%葡萄糖(质量分数),锥形瓶盖无菌透气膜进行发酵,发酵温度37 ℃,发酵时间48 h。
表2 正交试验因素水平表

Table 2 Factor and level table of orthogonal test

水平
Levels		 因素Factors
嗜酸乳杆菌
Lactobacillus acidophilus (A)		 枯草芽孢杆菌
Bacillus subtilis (B)		 产朊假丝酵母
Candida utilis (C)
1 1 1 1
2 2 2 2
3 3 3 3

1.3.5 单因素试验优化发酵参数

以蛋白质水解度、发酵液pH为评价指标,分别研究不同接种量(5%、10%、15%、20%、25%)、发酵初始pH(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)、发酵时间(12、24、36、48、60、72 h)、发酵温度(30、32、34、36、38、40、42 ℃)、固液比(1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3)、葡萄糖添加量(0、5%、10%、15%、20%)等6个因素对复合益生菌发酵对虾加工副产物的影响。

1.3.6 响应面试验确定最佳发酵工艺

基于单因素试验的结果进行响应面优化设计,选取接种量、发酵温度、发酵时间3个因素,以蛋白质水解度为响应值,进行3因素3水平的Box-Behnken响应面试验。响应面试验因素与水平见表3。
表3 响应面试验因素与水平

Table 3 Factors and levels of response surface test

水平
Levels		 因素Factors
接种量
Inoculation amount (A)/%		 发酵温度
Fermentation temperature (B)/℃		 发酵时间
Fermentation time (C)/h
-1 10 36 36
0 15 38 48
1 20 40 60

1.3.7 混合饲料营养成分及pH变化

将采用响应面试验确定的最佳工艺发酵对虾加工副产物制备的发酵液与配合饲料以1∶1混合,待混合均匀后在鼓风干燥箱中50 ℃烘8 h,测定其营养成分含量和pH,与配合饲料进行比较。

1.4 测定指标

1.4.1 营养成分的测定

按照GB/T 6432—2018测定粗蛋白质含量,按照GB/T 6438—2007测定粗灰分含量,按照GB/T 6434—2022测定粗纤维含量,按照GB/T 6435—2014测定水分含量,按照GB/T 18246—2019测定氨基酸含量。

1.4.2 pH的测定

采用FE28-2台式pH计测定pH。

1.4.3 蛋白质水解度的测定

参照王剑锋等[13]报道的甲醛滴定法测定氨基酸态氮含量,采用凯氏定氮法测定总蛋白氮含量。按照如下公式计算蛋白质水解度:
蛋白质水解度(%)= x - x 1 D - x 1×100。
式中:D为原料中总蛋白氮含量;x为发酵液中氨基酸态氮含量;x1为原料中氨基酸态氮含量。

1.5 统计分析

利用SPSS 22.0统计学软件对试验数据进行分析,其中配合饲料与混合饲料常规营养成分、氨基酸含量以及pH数据以平均值±标准差表示,采用独立样本t检验分析2种饲料间的差异显著性;其余指标差异显著性采用单因素方差分析(one-way AVOVA),多重比较采用SNK(Student-Newman-Keuls)法进行。P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。应用Design-Expert 8.0软件进行响应面试验设计和分析。采用GraphPad Prism 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 试验菌株的生长曲线

由图1可知,枯草芽孢杆菌的生长速度较快,其OD600值在16 h时达到最高点,之后进入平稳期;嗜酸乳杆菌和产朊假丝酵母的OD600值约在24 h达到最高点,随后也进入平稳期。为了保证发酵接种的一致性,选取24 h作为培养时间,此时,除枯草芽孢杆菌外,其他菌株均处于对数生长末期,通过测定,嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母的活菌数分别为2.6×108、1.4×108、2.4×108 CFU/mL。选择此时间点接种,有助于这些菌株在接种至对虾加工副产物后迅速繁殖。
图1 试验菌株的生长曲线

Fig.1 Growth curves of test strains

2.2 正交试验结果

以对虾加工副产物的蛋白质水解度为评价指标,复合益生菌中3种菌株的混合比例对发酵对虾加工副产物影响的正交试验与方差分析结果分别见表4、表5。方差分析结果显示嗜酸乳杆菌对发酵对虾加工副产物具有显著影响(P=0.026),正交试验结果显示A2B1C2组合的蛋白质水解度最高,根据k值,理论最优组合为A2B1C2,对该组合进行3次重复验证试验,在相同条件下A2B1C2组合的蛋白质水解度平均为21.16%,结果稳定可行,因此确定复合益生菌中3种菌株的混合比例为嗜酸乳杆菌∶枯草芽孢杆菌∶产朊假丝酵母=2∶1∶2(质量比)以进行后续的试验。
表4 正交试验结果

Table 4 Results of orthogonal test

试验号
Test No.		 因素Factors 蛋白质水解度
Proteolytic degree/%
嗜酸乳杆菌
Lactobacillus acidophilus (A)		 枯草芽孢杆菌
Bacillus subtilis (B)		 产朊假丝酵母
Candida utilis (C)
1 1 1 1 16.9
2 1 2 2 17.2
3 1 3 3 16.8
4 2 1 2 21.3
5 2 2 3 19.5
6 2 3 1 18.2
7 3 1 3 15.7
8 3 2 1 14.8
9 3 3 2 16.4
K1 50.9 53.9 49.9
K2 59.0 51.5 54.9
K3 46.9 51.4 52.0
k1 16.9 17.9 16.6
k2 19.6 17.2 18.3
k3 15.6 17.1 17.3
极差R 4.0 0.8 1.7
表5 正交试验的方差分析

Table 5 Variance analysis for orthogonal test

来源
Sources		 平方和
SS		 自由度
DF		 均方
MS		 F值
F-value		 P值
P-value		 显著性
Significance
A 25.33 2 12.67 37.14 0.026 *
B 1.33 2 0.67 1.96 0.338 NS
C 4.20 2 2.10 6.16 0.140 NS

“*”:显著;“**”、“***”:极显著;“NS”;不显著 no significant。表8和表9同。

“*”: significant; “**” and “***”: extremely significant; “NS”: no significant. The same as Table 8 and Table 9.

2.3 单因素试验结果

2.3.1 接种量

由图2可知,随着接种量的提高,发酵液pH先逐渐降低后缓慢上升,在接种量15%时,发酵液pH达最低值,为4.41;同时,接种量在15%时蛋白质水解度达到最大值,为21.0%,然后随着接种量的继续提升,蛋白质水解度逐渐下降。综合考虑,选择接种量为15%,其中嗜酸乳杆菌∶枯草芽孢杆菌∶产朊假丝酵母为2∶1∶2(质量比)。
图2 接种量对发酵液pH和蛋白质水解度的影响

数据点标注相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下图同。

Fig.2 Effects of inoculum amount on pH and proteolytic degree of fermentation liquor

Data points with the same lowercase letters indicated that the difference was not significant (P>0.05), and with different lowercase letters indicated that the difference was significant (P<0.05). The same as below.

2.3.2 初始pH

由图3可知,随着初始pH的增加,发酵液pH呈现逐渐上升的趋势,蛋白质水解度呈现先增加后降低的趋势,在初始pH为6.5时蛋白质水解度达最大值,为19.0%。因此,选择初始pH为6.5。
图3 初始pH对发酵液pH和蛋白质水解度的影响

Fig.3 Effects of initial pH on pH and proteolytic degree of fermentation liquor

2.3.3 发酵时间

由图4可知,在发酵的前24 h内,发酵液的pH迅速降低,此后pH降低趋于平缓,这是由于嗜酸乳杆菌在发酵过程中产生的乳酸为弱酸,当酸度达到较高水平后,酸度的变化对pH的数值的影响变小;蛋白质水解度在发酵48 h后逐渐下降。由上述结果可知发酵时间应至少达到48 h以上,综合考虑选择发酵时间为48 h。
图4 发酵时间对发酵液pH和蛋白质水解度的影响

Fig.4 Effects of fermentation time on pH and proteolytic degree of fermentation liquor

2.3.4 发酵温度

由图5可知,发酵液pH随着发酵温度的增加先下降,在38 ℃时pH最低,此后,随着发酵温度增加发酵液pH逐渐增加;蛋白质水解度随着发酵温度的增加先升高后降低,在38 ℃时蛋白质水解度达最大值,为21.7%。因此,选择发酵温度为38 ℃作为初始发酵温度。
图5 发酵温度对发酵液pH和蛋白质水解度的影响

Fig.5 Effects of fermentation temperature on pH and proteolytic degree of fermentation liquor

2.3.5 固液比

由图6可知,当固液比为1∶1时,蛋白质水解度较低,这是水分含量过低不利于营养物质的吸收和微生物的生长和代谢,进而益生菌的生长受到抑制;当固液比大于1∶1.5时,发酵液的pH随着固液比的增加而逐渐增加;当固液比为1∶1.5时蛋白质水解度为18.5%,在固液比为1∶3时蛋白质水解度为19.1%。因固液比过大时不利于浓缩、干燥等后续工艺操作,综合考虑选择固液比为1∶1.5。
图6 固液比对发酵液pH和蛋白质水解度的影响

Fig.6 Effects of solid-liquid ratio on pH and proteolytic degree of fermentation liquor

2.3.6 葡萄糖添加量

由图7可知,随着葡萄糖添加量的递增,发酵液的pH逐渐降低,而蛋白质水解度则逐渐上升,在葡萄糖添加量25%时达最大值,为18.4%。鉴于增加葡萄糖的添加量将直接导致生产成本上升,不利于实现规模化发酵。因此,综合考虑将葡萄糖添加量设定为15%,此时蛋白质水解度为17.0%。
图7 葡萄糖添加量对发酵液pH和蛋白质水解度的影响

Fig.7 Effects of glucose addition amount on pH and proteolytic degree of fermentation liquor

2.4 响应面试验结果

根据单因素试验结果,选择接种量、发酵温度、发酵时间进行3因素3水平Box-Behnken响应面试验。以蛋白质水解度为响应值,采用响应面法进行分析,试验结果如表6所示。
表6 响应面试验结果

Table 6 Results of response surface test

试验号
Test No.		 因素Factors 蛋白质水解度
Proteolytic degree/%
接种量
Inoculation
amount (A)/%		 发酵温度
Fermentation
temperature (B)/℃		 发酵时间
Fermentation
time (C)/h
1 15 36 60 18.91
2 15 40 60 19.87
3 20 36 48 18.69
4 15 38 48 21.58
5 10 40 48 19.98
6 10 38 60 18.28
7 15 38 48 20.98
8 10 36 48 18.12
9 15 38 48 21.69
10 10 38 36 19.41
11 20 38 36 20.18
12 15 38 48 20.59
13 20 40 48 20.21
14 15 40 36 19.01
15 20 38 36 19.69
16 15 38 48 21.21
17 15 36 36 19.23
使用响应面软件,对试验数据进行拟合,获得二次回归方程:Y=21.21+0.417 9A+0.515B-0.082 9C-0.085AB+0.264 3AC+0.295BC-0.867A2-1.09B2-0.862 1C2。
依据表7所呈现的方差分析结果,模型的P值小于0.05,这表明模型在统计学上具有显著性。失拟项的P值为0.086,未显现出统计学上的显著性,从而进一步验证了模型的有效性。模型的决定系数(R2)为0.872 5,校正决定系数(Adj R2)为0.708 7,这说明模型能够解释约70%的蛋白质水解度的变异,拟合度良好。因此,该模型适用于对发酵对虾加工副产物条件进行分析和预测。通过F值的分析,可以得出影响蛋白质水解度的因素依次为发酵温度、接种量和发酵时间。
表7 响应面试验的方差分析

Table 7 Variance analysis for response surface test

来源Sources 平方和SS 自由度DF 均方MS F值F-value P值P-value
模型Model 16.84 9 1.87 5.32 0.019 2
A 0.977 8 1 0.977 8 2.780 0 0.139 3
B 2.12 1 2.12 6.04 0.043 7
C 0.038 4 1 0.038 4 0.109 4 0.750 5
AB 0.028 9 1 0.028 9 0.082 2 0.782 6
AC 0.150 4 1 0.150 4 0.428 0 0.533 9
BC 0.348 1 1 0.348 1 0.990 4 0.352 8
A2 2.58 1 2.58 7.35 0.030 2
B2 4.10 1 4.10 11.67 0.011 2
C2 2.55 1 2.55 7.27 0.030 8
残差Residual 2.46 7 0.351 5
失拟项Omission item 1.54 2 0.767 8 4.15 0.086 6
误差Error 0.924 7 5 0.18 49
合计Total 19.3 16

P<0.05表示显著,P<0.01表示极显著;决定系数(R2)=0.872 5,校正决定系数(Adj R2)=0.708 7。

P<0.05 mean significant, and P<0.01 mean extremely significant, coefficient of determination (R2)=0.872 5, and adjusted coefficient of determination (Adj R2)=0.708 7.

根据响应面及等高线(图8、图9和图10)能更直观反映3个因素的交互作用对蛋白质水解度的影响。
图8 接种量和发酵温度的交互作用图

Fig.8 Interaction plot of inoculation amount and fermentation temperature

图9 接种量和发酵时间的交互作用图

Fig.9 Interaction plot of inoculation volume and fermentation time

图10 发酵温度和发酵时间的交互作用图

Fig.10 Interaction plot of fermentation temperature and fermentation time

在48 h的发酵过程中,图8显示了接种量和发酵温度对蛋白质水解度的影响。当接种量维持不变时,蛋白质水解度随着发酵温度的提升呈现先上升后下降的趋势,在38 ℃时达到顶峰;当发酵温度维持稳定时,蛋白质水解度随着接种量的增多也呈现先上升后下降的走势,在接种量为15%时达到顶峰。
在38℃的发酵温度条件下,图9展示了接种量与发酵时间对蛋白质水解度的影响。当接种量保持恒定时,蛋白质水解度随发酵时间的延长呈现出先增加后降低的趋势,在48 h时达到顶峰;而当发酵时间固定不变时,蛋白质水解度随着接种量的增加同样表现出先升后降的模式,在接种量为15%时达到最高点。
在接种量为15%的条件下,图10展示了发酵温度和发酵时间对蛋白质水解度的影响。发酵温度保持不变时,蛋白质水解度会随着发酵时间的延长先增加后减少,并在48 h时达到最高值;反之,在发酵时间保持恒定时,蛋白质水解度也会随着发酵温度的提高先增加后减少,在38 ℃时达到峰值。
通过响应面软件Design-Expert 8.0分析得出的最优发酵工艺为:接种量16.171%,发酵温度38.46 ℃,发酵时间48.323 h,预测的最大蛋白质水解度为21.317%。基于分析结果,实际操作中我们调整了发酵工艺,将接种量、发酵温度和发酵时间分别设定为16%、38.5 ℃和48 h,进行验证试验。

2.5 验证试验

本次试验所选的对虾加工副产物(虾头、虾壳混合物)实测的粗蛋白质含量为(15.1±0.2)%。在500 mL锥形瓶种加入50 g对虾加工副产物,设定固液比为1∶1.5,发酵温度为38.5 ℃,接种量为16%,初始pH为6.5,葡萄糖添加量为15%,发酵时间为48 h。按此条件进行3次重复试验,测得蛋白质水解度分别为21.4%、21.6%、21.4%,与试验预测的21.317%非常接近,发酵液的粗蛋白质含量经测定为(14.3±0.2)%,即蛋白质回收率达(94.7±0.3)%,该结果说明响应面优化法预测的蛋白质水解度较准确。

2.6 配合饲料与对虾副产物发酵液混合后营养成分含量和pH变化

由表8可知,对比配合饲料,将配合饲料与对虾副产物发酵液以1∶1混合后得到的混合饲料的粗蛋白质含量平均提升9.16%,粗纤维含量平均下降1.63%,粗灰分含量平均提升1.40%,水分含量平均提升1.6%,pH平均降低0.15。
表8 常规营养成分含量和pH分析

Table 8 Analysis of conventional nutrient contents and pH

项目
Items		 配合饲料
Compound feed		 混合饲料
Mixed feed		 均值差
MD		 P值
P-value		 显著性
Significance
水分Moisture/% 14.2 15.8 1.6 0.186 NS
粗蛋白质CP/% DM 16.3 25.4 9.1 <0.001 ***
粗纤维CF/% DM 7.9 6.2 1.7 0.006 **
粗灰分Ash/% DM 7.9 9.3 1.4 <0.001 ***
pH 5.4 5.3 0.1 0.151 NS
混合饲料中17种氨基酸的总量以及13种氨基酸含量均较配合饲料有所提升,总氨基酸含量由13.56%提升至16.19%,极显著升高(P<0.05);此外,苯丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸含量极显著升高(P<0.01),亮氨酸含量显著升高(P<0.05),具体见表9。
表9 氨基酸含量分析(干物质基础)

Table 9 Analysis of amino acid contents (DM basis) %

项目
Items		 配合饲料
Compound feed		 混合饲料
Mixed feed		 均值差
MD		 P值
P-value		 显著性
Significance
总氨基酸Total amino acids 13.56 16.19 2.63 0.002 **
苯丙氨酸Phe 0.73 0.86 0.13 <0.001 ***
丙氨酸Ala 0.80 0.83 0.03 0.327 NS
甘氨酸Gly 0.62 0.70 0.08 0.007 **
谷氨酸Glu 2.71 3.00 0.29 0.105 NS
精氨酸Arg 0.85 0.97 0.12 0.075 NS
赖氨酸Lys 0.81 0.98 0.16 <0.001 ***
酪氨酸Tyr 0.35 0.39 0.04 0.103 NS
亮氨酸Leu 1.27 1.37 0.10 0.018 *
脯氨酸Pro 0.88 0.99 0.11 0.085 NS
丝氨酸Ser 0.76 0.83 0.07 0.347 NS
苏氨酸Thr 0.58 0.63 0.05 0.227 NS
天门冬氨酸Asp 1.43 1.52 0.08 0.066 NS
缬氨酸Val 0.64 0.72 0.08 0.177 NS

3 讨论

3.1 复合益生菌中3种菌株的混合比例对发酵对虾加工副产物蛋白质水解度的影响

蛋白质水解度指的是蛋白质分子被拆分成较短肽链或氨基酸的水平,这个程度体现了蛋白质被分解的水平。适宜的接种比例能够提升发酵的效率,增进产品的品质和营养价值。有研究发现,嗜酸乳杆菌在发酵对虾加工副产物过程中起主要发酵作用[14],枯草芽孢杆菌在发酵前期可以迅速增殖,其强力耗氧能力可为嗜酸乳杆菌的增殖提供有利条件,促进嗜酸乳杆菌的增殖[15-16],产朊假丝酵母增殖过程中的耗氧、产热进一步促进嗜酸乳杆菌的增殖[17]。本试验结果显示,嗜酸乳杆菌∶枯草芽孢杆菌∶产朊假丝酵母的混合比例为2∶1∶2时,蛋白质水解度可达21.3%。这可能是添加的3种菌株在发酵对虾加工副产物过程中产生了协同作用,相互促进增殖,提高了对虾加工副产物的发酵效率。

3.2 复合益生菌发酵对虾加工副产物工艺的优化

不同的微生物对pH有不同的适应范围。适宜的pH可以促进微生物的生长和代谢活动,提高发酵效率[18]。本试验通过发酵液的pH和蛋白质水解度来评估对虾加工副产物的发酵参数,发现接种量、发酵温度和发酵时间是影响发酵的关键因素。蛋白质水解度随着接种量的增加而提高,但超过15%后,蛋白质水解度会下降。这可能是因为菌体密度过高时微生物间竞争加剧,抑制了某些菌株的生长,影响了发酵效果;同时,代谢产物的积累可能对发酵环境产生负面影响,降低蛋白质水解度。不同接种量的乳酸菌对水产品的pH和杀菌效果有显著影响,适宜接种量的乳酸菌可获得更稳定和优质的发酵产品及提高发酵产品的安全性和稳定性[19-20]。Kotb[21]研究指出,过低或过高的枯草芽孢杆菌接种量均不利于虾壳发酵,前者因菌株不足无法有效降解蛋白质和矿物质,后者则因代谢产物积累影响发酵效果。因此,选择适宜的接种量至关重要。
对虾加工副产物的蛋白质水解度随发酵时间的增加而提高,48 h时达到峰值,之后延长发酵时间会降低蛋白质水解度。这是因为蛋白质含量随时间减少,而底物浓度降低可能减弱微生物活性。Deng等[22]研究发现,发酵时间延长导致底物浓度降低,从而降低蛋白质水解度。
对虾加工副产物的蛋白质水解度随发酵温度发升高而增加,38 ℃时达到峰值,但若发酵温度继续升高,蛋白质水解度则会下降。这是因为发酵温度直接影响微生物生长和对虾加工副产物内源酶活性,过高的温度抑制枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母的活性,进而影响复合益生菌的脱蛋白效果。李兴华等[23]通过正交试验优化虾酱配方,确定发酵温度在30 ℃时虾酱风味形成最丰富,含水量和水分活度适中,整体效果最佳。郭晓宇等[24]研究了不同发酵温度对液体发酵饲料营养成分、挥发性脂肪酸含量和活菌数的影响,发酵温度为25 ℃时,饲料中粗蛋白质含量以及乳酸菌和酵母菌活菌数均高于发酵温度为20、30 ℃时。
从单因素试验结果中可以发现,初始pH为6.5时,蛋白质水解度最高。这可能是因为初始pH为6.5时,适宜嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母的生长而使其迅速增殖。Liu等[25]研究发现,pH异常会抑制或杀死嗜酸乳杆菌等菌种。本试验中,固液比超过1∶1.5时,蛋白质水解度缓慢上升,pH在固液比为1∶1.5时最低,但从实际生产考虑,过高的固液比不利于后续工艺。彭元怀等[26]研究发现,提取虾壳中甲壳素的最佳固液比为1∶12(mL/g),此时脱蛋白率为21.3%。当葡萄糖添加量超过15%时,发酵液的蛋白质水解度稳定,不再有显著变化。这可能是因为高渗透压抑制了菌体生长,影响了发酵过程。Li等[27]采用响应面法在对虾加工副产物中接种发酵乳杆菌,结果发现添加8.6%的葡萄糖时脱蛋白率为85.11%。因此,初始pH、固液比、葡萄糖添加量要选择合适范围。在实际的发酵流程中,接种量、发酵时间、发酵温度、初始pH、固液比、葡萄糖添加量是共同发挥作用来影响对虾加工副产物的发酵进程。采用响应面软件对试验数据进行拟合,获得二次回归方程,通过模型的F值,得出影响蛋白质水解度的3个主要因素为发酵温度、接种量和发酵时间。通过响应面软件分析并基于实际操作,确定最佳的接种量、发酵温度和发酵时间分别为16%、38.5 ℃和48 h。

3.3 对虾加工副产物发酵液对配合饲料营养成分的影响

将对虾加工副产物发酵液烘干后与配合饲料混合,极显著提升了混合饲料的粗蛋白质和总氨基酸含量,该研究结果对提高对虾副产品的利用价值和促进其高值化加工具有参考价值。这一效果归因于水分蒸发导致的发酵液浓缩,酵母菌体蛋白和无机铵盐转化成的氨基酸。此外,益生菌如枯草芽孢杆菌产生的蛋白酶将大分子蛋白质分解成氨基酸,进一步增加了氨基酸含量。Pan等[28]通过加入不同含量的枯草芽孢杆菌发酵鱿鱼副产品替代鱼粉饲喂黑虎虾的研究发现,枯草芽孢杆菌在发酵过程中可有效地改善饲料的营养价值并将抗营养因子和酶抑制剂转化为有益的代谢产物,提高了其可消化性,可以作为动物饲料蛋白质源替代鱼粉。

4 结论

① 通过正交试验确定,复合益生菌中嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母的最佳混合比例为2∶1∶2。
② 通过单因素试验和响应面优化试验确定,复合益生菌发酵对虾副产品的最佳工艺为16%的接种量、初始pH 6.5、固液比1∶1.5、葡萄糖添加量15%、38 ℃发酵48 h,此条件下对虾加工副产物发酵液的蛋白质回收率可达94.7%。
③ 将发酵液与配合饲料按1∶1混合烘干后,粗蛋白质含量平均提升了9.16%,总氨基酸含量平均增加了2.63%。

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