Chinese Journal of Animal Nutrition >

2025 , Vol. 37 >Issue 10: 6729 - 6743

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.548

RESEARCH PAPER

Effects of Low-Protein Diet Supplemented with Protease and Amino Acids on Performance, Nutrient Apparent Metabolic Rates, Immune Function and Intestinal Health of Laying Hens

  • YANG Shihang , 1, 2 ,
  • WU Kangle 1, 2 ,
  • ZHANG Chongyang 1, 2 ,
  • WANG Fang 1, 2 ,
  • XIE Meizhu 1, 3 ,
  • LI Jiayang 1, 3 ,
  • YAO Kang , 1, 2, * ,
  • YIN Yulong 1, 2
Expand
  • 1 Hunan Engineering Technology Research Center for Healthy Animal Husbandry, Key Laboratory of Agro-Ecological Processes in Subtropical Region, Subtropical Agro-Ecology Institute, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China
  • 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China
  • 3 College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
*professor, E-mail:

Received date: 2025-03-06

  Online published: 2025-10-15

Fold

Abstract

This experiment aimed to investigate the effects of low-protein diet supplemented with protease and amino acids on performance, nutrient apparent metabolic rates, immune function and intestinal health of Hy-Line brown laying hens. A total of 180 healthy 31-week-old Hy-Line brown laying hens with similar body weight and laying rate were selected and randomly divided into 3 groups, with 6 replicates in each group and 10 hens in each replicate. Hens in the control group (CON group) were fed a basal diet with 15.9% crude protein (CP) level, those in the low-protein group (LP group) were fed a low-protein diet with 15.2% CP level, and those in the experimental group (LP+PAA group) were fed the low-protein diet with 15.2% CP level and supplemented with 150 mg/kg protease, 400 mg/kg methionine, 400 mg/kg lysine and 300 mg/kg threonine. The pre-experiment was 3 weeks and the formal experiment was 12 weeks. The results showed as follows: 1) compared with CON group, the laying rate, daily egg mass and body weight gain from weeks 1 to 12 in LP group were significantly decreased (P<0.05), and the feed to egg ratio from weeks 9 to 12 was significantly increased (P<0.05); there was no significant difference in laying performance and body weight gain in LP+PAA group (P>0.05). There was no significant difference in egg quality among each group at each stage (P>0.05). 2) Compared with CON group, the villus height in duodenum in LP group was significantly decreased (P<0.05), and the villus height to crypt depth ratio in duodenal and jejunum in LP+PAA group was significantly increased (P<0.05). 3) Compared with CON group, there was no significant difference in the apparent metabolic rates of CP, calcium and phosphorus in LP group (P>0.05), while the CP apparent metabolic rate in LP+PAA group was significantly increased at weeks 8 and 12 (P<0.05). Compared with LP group, the CP apparent metabolic rate at weeks 8 and 12 and the apparent metabolic rates of phosphorus and crude fiber at week 8 in LP+PAA group were significantly increased (P<0.05). 4) Compared with CON group, there was no significant difference in most serum immune indices in LP group (P>0.05), while the contents of serum immunoglobulin G (IgG) and immunoglobulin Y (IgY) in LP+PAA group were significantly increased (P<0.05). Compared with LP group, the contents of serum IgG and IgY in LP+PAA group were significantly increased (P<0.05), and the serum tumor necrosis factor-α content was significantly decreased (P<0.05). 5) There were no significant differences in the richness, diversity and composition of cecal microbiota among the groups (P>0.05). In conclusion, the low-protein diet with 15.2% CP level can reduce the performance of Hy-Line brown laying hens, but has no significant effects on egg quality, most serum immune indices, cecal microbiota, and apparent nutrient metabolic rates. The low-protein diet supplemented with protease and amino acids can improve the performance, intestinal morphological structure, CP apparent metabolic rate and enhance the immune function, but has no significant improvement effects on egg quality and cecal microbiota.

Key words： low-protein diet; protease; essential amino acids; laying hens; performance

Cite this article

YANG Shihang , WU Kangle , ZHANG Chongyang , WANG Fang , XIE Meizhu , LI Jiayang , YAO Kang , YIN Yulong . Effects of Low-Protein Diet Supplemented with Protease and Amino Acids on Performance, Nutrient Apparent Metabolic Rates, Immune Function and Intestinal Health of Laying Hens[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2025 , 37(10) : 6729 -6743 . DOI: 10.12418/CJAN2025.548

豆粕是目前我国主要的植物蛋白质原料。据中国海关总署统计,我国2024年进口大豆10 503万t,同期国产大豆2 065万t,我国的大豆依存度高达83.6%。为缓解对进口大豆的依赖,农业农村部自2018年起重点推广低蛋白质饲粮技术。中国饲料工业协会2023年也发布了《蛋鸡低蛋白低豆粕多元化日粮生产技术规范》(T/CFIAS 8004—2023)(以下简称《生产技术规范》)[1],旨在降低豆粕用量的同时保证畜禽生产性能和产品品质不受影响。然而,该技术在实际应用过程中存在过度降低饲粮蛋白质含量导致动物必需氨基酸供给失衡或不足的问题[2]。为了应对这一挑战,科学家提出2种解决方案:一是在低蛋白质饲粮中添加蛋白酶用于提高动物对蛋白质的利用率[3],并通过降解抗营养因子来改善动物的消化吸收,研究表明在饲粮中添加碱性蛋白酶可提高5.8%粗蛋白质(CP)代谢率[4];二是添加蛋氨酸、赖氨酸和苏氨酸等必需氨基酸以满足畜禽生长发育的需求。研究表明,蛋氨酸能提高产蛋率和日产蛋重,改善蛋鸡生产性能[5];赖氨酸是肌肉和卵黄蛋白合成的关键底物,可提高蛋白质沉积效率[6];苏氨酸是蛋鸡低蛋白质饲粮的限制性氨基酸[7],额外添加能提高日产蛋重并降低料蛋比[8]。不过,现阶段关于蛋白酶和必需氨基酸在蛋鸡低蛋白质饲粮中的应用多聚焦于单一添加效应,即蛋白酶通过提高CP代谢率发挥作用,而必需氨基酸用于弥补特定限制性氨基酸的不足。目前关于在蛋鸡低蛋白质饲粮中复合添加蛋白酶和必需氨基酸的应用研究较少。二者的复合添加从酶促反应动力学原理上看,可能会因添加的氨基酸造成产物浓度升高,进而对蛋白酶催化效率产生负反馈抑制[9]。但也有研究表明,蛋白酶和必需氨基酸的复合添加可协同提高家禽的生产性能[10]。基于此,本研究假设:在15.2% CP水平蛋鸡低蛋白质饲粮中,蛋白酶与必需氨基酸复合添加可通过提高蛋白质代谢率和满足氨基酸供给的双重机制,提高生产性能和改善肠道健康。因此,本研究将通过生产性能、蛋品质、肠道形态结构、养分表观代谢率、免疫功能和肠道菌群等指标的变化验证这一假设,旨在为低蛋白质饲粮技术在蛋鸡养殖中的推广应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验使用的蛋白酶是一种中碱性丝氨酸蛋白酶,源自葱绿拟诺卡氏菌(Nocardiopsis prasina),在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中表达,酶活性≥75 000 U/g。酶活性的定义:在pH 9.0、37.0 ℃的条件下,每分钟从1 μmol/L底物为琥珀酰基-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺的化合物中降解产生1 μmol对硝基苯胺基团所需要的酶量为1个酶活性单位[11]。L-赖氨酸、DL-蛋氨酸和L-苏氨酸为市售,纯度≥98%,呈白色粉状颗粒。

1.2 试验设计

本研究所有动物试验均按照中国科学院亚热带农业生态研究所实验动物伦理委员会的指导原则进行(伦理批准编号:20230619)。选取180只体重和产蛋率相近的31周龄健康海兰褐蛋鸡,随机分为3组,每组6个重复,每个重复10只鸡。对照组(CON组)饲喂15.9% CP水平的基础饲粮,低蛋白质组(LP组)饲喂15.2% CP水平的低蛋白质饲粮,试验组(LP+PAA组)饲喂15.2% CP水平的低蛋白质饲粮并补充150 mg/kg蛋白酶、400 mg/kg蛋氨酸、400 mg/kg赖氨酸和300 mg/kg苏氨酸(添加量根据前期预试验确定)。预试期3周,正试期12周。
《生产技术规范》中推荐产蛋高峰期的蛋鸡低蛋白质饲粮的CP水平为15.95%,本试验中LP组和LP+PAA组饲粮CP水平为15.2%,已符合其中的蛋鸡低蛋白质饲粮标准。各组饲粮参考《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)和《生产技术规范》配制,其组成及营养水平见表1。
表1 饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of diets (air-dry basis) %

原料
Ingredients		 组别Groups 营养水平
Nutrient levels2)		 组别Groups
CON LP LP+PAA CON LP LP+PAA
玉米Corn 62.30 62.30 62.30 代谢能ME/(MJ/kg) 11.13 11.13 11.13
豆粕Soybean meal 25.00 23.00 23.00 粗蛋白质CP 15.90 15.20 15.20
石粉Limestone 9.00 9.00 9.00 蛋氨酸Met 0.46 0.44 0.48
大豆油Soybean oil 0.70 0.90 0.90 赖氨酸Lys 0.84 0.79 0.83
麸皮Wheat bran 1.80 1.69 苏氨酸Thr 0.59 0.56 0.60
L-赖氨酸L-Lys (98%) 0.04 可消化蛋氨酸DMet 0.38 0.37 0.41
DL-蛋氨酸DL-Met (98%) 0.04 可消化赖氨酸DLys 0.71 0.67 0.71
L-苏氨酸L-Thr (98%) 0.03 可消化苏氨酸DThr 0.49 0.46 0.49
预混料Premix1) 3.00 3.00 3.00 钙Ca 4.02 4.02 4.02
合计Total 100.00 100.00 100.00 总磷TP 0.65 0.65 0.65
蛋白酶Protease 0.015

1)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of diets:VA 9 900 IU,VD3 4 000 IU,VE 25 IU,VK3 2.5 mg,VB1 12 mg,VB2 6 mg,VB6 4 mg,VB12 0.024 mg,生物素 biotin 0.2 mg,泛酸 pantothenic acid 10 mg,烟酰胺 nicotinamide 35 mg,叶酸 folic acid 1 mg,胆碱 choline 360 mg,Fe 80 mg,Cu 10 mg,Mn 100 mg,Zn 100 mg,I 1.2 mg,Se 0.3 mg,蛋氨酸 Met 1.5 g,食盐 NaCl 3.0 g,磷酸氢钙 CaHPO4 9.0 g。2)粗蛋白质、3种必需氨基酸(蛋氨酸、赖氨酸和苏氨酸)、钙和总磷为实测值,分别参考GB/T 6432—2018,GB/T 18246—2019,GB/T 6436—2018和GB/T 6437—2018中方法测定;其余为计算值,参考《中国饲料成分及营养价值表(2020年第31版)》[12]计算得出。CP, three essential amino acids (Met, Lys and Thr), Ca and TP were measured values, referring to GB/T 6432—2018,GB/T 18246—2019,GB/T 6436—2018 and GB/T 6437—2018, respectively; the others were calculated values based on Tables of Feed Composition and Nutritive Values in China (31st ed, 2020)[12].

1.3 饲养管理

本试验在湖南中晟农牧蛋鸡场开展。整个试验阶段鸡舍环境平均温度和相对湿度分别为25.6 ℃和79.5%。鸡群同层饲养,每日定时饲喂3次(07:00、11:00和16:00各1次)。试验期间鸡群自由采食和饮水,每天光照16 h,按常规程序进行免疫。

1.4 检测指标

1.4.1 生产性能和蛋品质的测定

正试期每天记录产蛋数和蛋重,每周记录饲粮消耗量。参考袁华根等[13]的方式,每4周以重复为单位计算以下生产性能指标。计算公式如下:

产蛋率(%)=100×总产蛋数/(鸡只数×试验天数);

平均蛋重(g)=总蛋重/总产蛋数;

日产蛋重(g/d)=平均蛋重×产蛋率;

平均日采食量(ADFI,g/d)=总耗料量/(鸡只数×试验天数);

料蛋比=总耗料量/总蛋重。

记录蛋鸡试验期初与期末体重,监测鸡群体重变化,计算体增重。
分别于正试期第4周末、第8周末和第12周末,以重复为单位随机选5枚鸡蛋进行蛋品质测定,取平均值进行分析[13]。其中,蛋白高度、蛋黄颜色和哈氏单位使用多功能蛋品质自动分析仪(EMT-5200,Robotmation,日本)测定,蛋壳强度使用蛋壳强度分析仪(EFG-0503,Robotmation,日本)测定,蛋壳厚度、鸡蛋长径和短径使用游标卡尺测定,并计算蛋形指数(长径/短径);分离蛋黄并称重,并计算蛋黄率。

1.4.2 养分表观代谢率的测定

分别于正试期第4周末、第8周末和第12周末,以重复为单位收集3 d排泄物样本,于-20 ℃保存。排泄物样本烘干粉碎后过40目筛[14]。饲粮和排泄物样本中CP、粗纤维、粗灰分、钙和磷含量分别参照GB/T 6432—2018、GB/T 6434—2006、GB/T 6438—2007、GB/T 6436—2018和GB/T 6437—2018中方法测定。养分表观代谢率计算公式如下[15]:

某养分表观代谢率(%)=100×(饲粮该养分含量×采食量-排泄物该养分含量×

排泄物重)/(饲粮该养分含量×采食量)。

1.4.3 血清免疫指标的测定

分别于正试期第4周末、第8周末和第12周末,以重复为单位随机选择1只蛋鸡进行翅下静脉采血5 mL,698.75×g离心10 min,分离出血清样本,于-20 ℃保存待测[14]。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(江苏酶免实业有限公司)测定血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白E(IgE)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白Y(IgY)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)含量。

1.4.4 肠道形态结构的测定

试验结束时,以重复为单位随机选择1只蛋鸡屠宰,剪取十二指肠、空肠和回肠各2 cm左右样品,置于4%多聚甲醛溶液固定,参考刘雅婷等[16]制作石蜡切片,并用苏木精-伊红染色。利用Image Analysis软件分析肠道形态结构,每个样品随机选取6~8根绒毛,测量绒毛高度及其对应的隐窝深度,取平均值,并计算绒隐比(绒毛高度/隐窝深度)。

1.4.5 盲肠菌群的分析

试验结束时,以重复为单位随机选择1只蛋鸡屠宰,取2 g盲肠内容物置于EP管中,液氮冻存后转入-80 ℃冰箱备用。采用通用引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')对细菌16S rDNA的V3~V4可变区进行测序,通过Illumina MiSeq平台进行高通量双末端测序[16]。使用uParse软件以97%的相似性进行操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU)聚类。利用Mothur软件分析菌群α多样性,并通过QIIME软件分析β多样性的距离矩阵。在美吉生物云平台(https://cloud.majorbio.com)进行结果分析。

1.5 数据统计处理

试验数据采用Excel 2016进行初步处理,然后采用SPSS 26.0进行单因素方差分析。在数据分析前,通过Levene检验对组间方差齐性进行验证(显著性水平α=0.05),满足方差齐性假设(P>0.05)后,采用Duncan氏法进行多重比较检验。结果以平均值和均值标准误(SEM)表示,P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 低蛋白质饲粮添加蛋白酶和氨基酸对蛋鸡生产性能和蛋品质的影响

由表2可知,与CON组相比,LP组蛋鸡第5~8周日产蛋重以及第1~12周产蛋率和日产蛋重显著降低(P<0.05),第9~12周料蛋比显著提高(P<0.05);LP+PAA组上述指标均无显著差异(P>0.05)。试验各阶段,各组间平均蛋重和ADFI无显著差异(P>0.05)。与CON组相比,LP组蛋鸡期末体重和体增重显著降低(P<0.05),LP+PAA组无显著差异(P>0.05)。
表2 低蛋白质饲粮添加蛋白酶和氨基酸对蛋鸡生产性能的影响

Table 2 Effects of low-protein diet supplemented with protease and amino acids on performance of laying hens

项目
Items		 时间
Time		 组别Groups 均值标准误
SEM		 P值
P-value
CON LP LP+PAA



产蛋率
Laying rate/%		 第1~4周Weeks 1 to 4 93.63 89.94 93.81 0.846 0.098
第5~8周Weeks 5 to 8 96.79 95.00 96.07 0.378 0.153
第9~12周Weeks 9 to 12 95.12 92.38 95.60 0.683 0.108
第1~12周Weeks 1 to 12 95.18a 92.44b 95.16a 0.444 0.011



平均蛋重
Average egg weight/g		 第1~4周Weeks 1 to 4 56.80 55.73 56.59 0.293 0.314
第5~8周Weeks 5 to 8 58.79 57.72 58.46 0.265 0.260
第9~12周Weeks 9 to 12 61.30 60.19 60.77 0.242 0.180
第1~12周Weeks 1 to 12 58.96 57.88 58.60 0.338 0.422



日产蛋重
Daily egg mass/(g/d)		 第1~4周Weeks 1 to 4 53.18 50.13 53.11 0.687 0.116
第5~8周Weeks 5 to 8 56.90a 54.84b 56.15a 0.325 0.015
第9~12周Weeks 9 to 12 58.32 55.61 58.09 0.602 0.119
第1~12周Weeks 1 to 12 56.14a 53.53b 55.78ab 0.493 0.048



平均日采食量
ADFI/(g/d)		 第1~4周Weeks 1 to 4 108.08 106.58 109.15 1.448 0.800
第5~8周Weeks 5 to 8 112.93 113.53 112.65 0.968 0.943
第9~12周Weeks 9 to 12 114.30 116.20 114.06 0.673 0.402
第1~12周Weeks 1 to 12 111.77 112.10 111.95 0.781 0.986



料蛋比
Feed/egg		 第1~4周Weeks 1 to 4 1.90 1.91 1.93 0.017 0.988
第5~8周Weeks 5 to 8 1.92 1.97 1.93 0.013 0.418
第9~12周Weeks 9 to 12 1.87b 1.93a 1.88b 0.011 0.021
第1~12周Weeks 1 to 12 1.90 1.94 1.91 0.008 0.154

体重
BW/kg		 第1周Week 1 1.72 1.74 1.73 0.006 0.691
第12周Week 12 1.87a 1.80b 1.83ab 0.009 0.005
体增重BW gain/kg 第1~12周Weeks 1 to 12 0.15a 0.06b 0.10ab 0.012 0.009

同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05),不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

In the same row,values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

由表3可知,试验各阶段(第4周、第8周和第12周),各组间哈氏单位、蛋壳强度、蛋壳厚度、蛋形指数、蛋白高度、蛋黄颜色、蛋黄重和蛋黄率均无显著差异(P>0.05)。
表3 低蛋白质饲粮添加蛋白酶和氨基酸对蛋鸡蛋品质的影响

Table 3 Effects of low-protein diet supplemented with protease and amino acids on egg quality of laying hens

项目
Items		 时间
Time		 组别Groups 均值标准误
SEM		 P值
P-value
CON LP LP+PAA


哈氏单位
Haugh unit		 第4周Week 4 82.03 80.77 86.00 1.688 0.429
第8周Week 8 90.58 86.32 92.52 1.162 0.081
第12周Week 12 93.77 90.96 92.82 0.952 0.483


蛋壳强度
Eggshell strength/(N/cm2)		 第4周Week 4 47.32 44.31 43.17 0.944 0.180
第8周Week 8 44.82 44.90 45.31 0.617 0.945
第12周Week 12 42.88 43.84 45.04 0.885 0.627


蛋壳厚度
Eggshell thickness/mm		 第4周Week 4 0.422 0.412 0.421 0.004 0.114
第8周Week 8 0.381 0.379 0.374 0.007 0.518
第12周Week 12 0.367 0.369 0.365 0.009 0.845


蛋形指数
Egg shape index		 第4周Week 4 1.291 1.290 1.294 0.007 0.968
第8周Week 8 1.308 1.318 1.309 0.005 0.632
第12周Week 12 1.305 1.312 1.303 0.005 0.753


蛋白高度
Albumen height/mm		 第4周Week 4 6.91 6.33 7.39 0.258 0.252
第8周Week 8 8.19 7.45 8.26 0.169 0.095
第12周Week 12 8.96 8.32 8.73 0.178 0.345


蛋黄颜色
Yolk color		 第4周Week 4 12.00 11.96 12.25 0.080 0.282
第8周Week 8 10.71 10.08 10.33 0.153 0.253
第12周Week 12 12.17 11.83 12.08 0.084 0.250


蛋黄重
Yolk weight/g		 第4周Week 4 15.04 13.64 14.77 0.256 0.057
第8周Week 8 16.21 16.03 16.03 0.176 0.892
第12周Week 12 17.50 17.08 16.84 0.176 0.315


蛋黄率
Yolk percentage/%		 第4周Week 4 26.54 24.65 26.26 0.423 0.142
第8周Week 8 27.51 27.22 27.17 0.193 0.762
第12周Week 12 28.03 28.40 27.99 0.198 0.662

2.2 低蛋白质饲粮添加蛋白酶和氨基酸对蛋鸡肠道形态结构和养分表观代谢率的影响

由表4和图1可知,与CON组相比,LP组蛋鸡十二指肠绒毛高度显著降低(P<0.05),LP+PAA组十二指肠绒隐比显著提高(P<0.05)。与CON组相比,LP组空肠绒毛高度、隐窝深度和绒隐比无显著差异(P>0.05);LP+PAA组空肠隐窝深度显著降低(P<0.05),空肠绒隐比显著提高(P<0.05)。与CON组相比,LP组和LP+PAA组回肠绒毛高度、隐窝深度和绒隐比均无显著差异(P>0.05)。
表4 低蛋白质饲粮添加蛋白酶和氨基酸对蛋鸡肠道形态结构的影响

Table 4 Effects of low-protein diet supplemented with protease and amino acids on intestinal morphological structure of laying hens

项目
Items		 组别Groups 均值标准误
SEM		 P值
P-value
CON LP LP+PAA
十二指肠Duodenum
绒毛高度Villus height/μm 453.31a 398.77b 469.01a 8.346 <0.001
隐窝深度Crypt depth/μm 85.31 83.24 74.79 1.923 0.171
绒隐比V/C 5.50b 4.97b 6.37a 0.188 0.014
空肠Jejunum
绒毛高度Villus height/μm 421.98 379.31 438.11 10.975 0.084
隐窝深度Crypt depth/μm 71.34a 66.79a 48.51b 2.644 <0.001
绒隐比V/C 6.21b 6.38b 9.37a 0.376 <0.001
回肠Ileum
绒毛高度Villus height/μm 317.96 310.52 328.02 6.648 0.597
隐窝深度Crypt depth/μm 48.10 46.49 43.49 1.787 0.643
绒隐比V/C 7.99 7.02 7.78 0.428 0.595
图1 蛋鸡肠道不同部位形态结构

Fig.1 Morphological structure of different parts of intestinal tract of laying hens

由表5可知,第4周,各组间蛋鸡各养分表观代谢率均无显著差异(P>0.05)。第8周,与CON组相比,LP组粗纤维表观代谢率显著降低(P>0.05),LP+PAA组CP表观代谢率显著提高(P<0.05);与LP组相比,LP+PAA组CP、磷和粗纤维表观代谢率显著提高(P<0.05)。第12周,与CON组相比,LP组和LP+PAA组粗灰分表观代谢率显著降低(P<0.05),LP+PAA组CP表观代谢率显著提高(P<0.05);与LP组相比,LP+PAA组CP表观代谢率显著提高(P<0.05)。
表5 低蛋白质饲粮添加蛋白酶和氨基酸对蛋鸡养分表观代谢率的影响

Table 5 Effects of low-protein diet supplemented with protease and amino acids on nutrient apparent metabolic rates of laying hens %

项目
Items		 时间
Time		 组别Groups 均值标准误
SEM		 P值
P-value
CON LP LP+PAA


粗蛋白质CP		 第4周Week 4 56.10 55.74 57.43 0.326 0.076
第8周Week 8 56.43b 55.11b 60.43a 0.742 0.003
第12周Week12 55.68b 54.43b 60.75a 0.852 <0.001


粗灰分Ash		 第4周Week 4 39.03 38.03 37.54 0.628 0.664
第8周Week 8 38.18 40.06 41.36 0.567 0.061
第12周Week 12 38.87a 36.49b 36.70b 0.449 0.045


钙Ca		 第4周Week 4 43.99 43.98 42.33 0.822 0.666
第8周Week 8 44.86 43.43 46.52 0.685 0.188
第12周Week 12 43.00 43.67 44.88 0.604 0.461


磷P		 第4周Week 4 40.07 40.40 39.66 0.841 0.944
第8周Week 8 39.88ab 39.09b 42.08a 0.509 0.034
第12周Week 12 38.69 38.73 38.73 0.465 0.999


粗纤维CF		 第4周Week 4 25.85 25.55 26.13 0.545 0.920
第8周Week 8 27.83a 25.90b 28.31a 0.352 0.004
第12周Week 12 27.00 26.23 26.62 0.630 0.897

2.3 低蛋白质饲粮添加蛋白酶和氨基酸对蛋鸡血清免疫指标的影响

由表6可知,LP组蛋鸡除第4周血清IL-10含量显著低于CON组(P<0.05)外,其他试验各阶段血清免疫指标与CON组相比均无显著差异(P>0.05)。LP+PAA组试验各阶段血清IgG和IgY含量均显著高于CON组和LP组(P<0.05),血清TNF-α含量显著低于LP组(P<0.05),血清IgA、IgE、IgM、IL-6和INF-γ含量与CON组和LP组相比均无显著差异(P>0.05)。
表6 低蛋白质饲粮添加蛋白酶和氨基酸对蛋鸡血清免疫指标的影响

Table 6 Effects of low-protein diet supplemented with protease and amino acids on serum immune indices of laying hens

项目
Items		 时间
Time		 组别Groups 均值标准误
SEM		 P值
P-value
CON LP LP+PAA


免疫球蛋白A
IgA/(mg/mL)		 第4周Week 4 0.59 0.54 0.62 0.020 0.216
第8周Week 8 0.66 0.66 0.63 0.024 0.819
第12周Week 12 0.70 0.70 0.66 0.022 0.715


免疫球蛋白E
IgE/(mg/mL)		 第4周Week 4 1.69 1.75 1.68 0.023 0.970
第8周Week 8 3.49 3.29 2.53 0.019 0.203
第12周Week 12 2.34 2.14 2.09 0.024 0.253


免疫球蛋白G
IgG/(mg/mL)		 第4周Week 4 6.15b 5.92b 8.87a 0.122 <0.001
第8周Week 8 7.85b 7.50b 11.01a 0.232 0.002
第12周Week 12 8.24b 7.90b 11.28a 0.084 0.004


免疫球蛋白M
IgM/(mg/mL)		 第4周Week 4 0.84 0.78 0.83 0.363 0.247
第8周Week 8 1.30 1.27 1.28 0.443 0.076
第12周Week 12 1.59 1.43 1.53 0.436 0.174


免疫球蛋白Y
IgY/(mg/mL)		 第4周Week 4 0.44b 0.44b 0.71a 0.018 <0.001
第8周Week 8 0.57b 0.55b 0.77a 0.053 0.001
第12周Week 12 0.48b 0.53b 1.02a 0.077 <0.001


白细胞介素-6
IL-6/(pg/mL)		 第4周Week 4 15.59 13.53 12.07 0.032 0.137
第8周Week 8 14.41 12.88 14.44 0.033 0.689
第12周Week 12 22.87 20.26 21.11 0.060 0.658


白细胞介素-10
IL-10/(pg/mL)		 第4周Week 4 99.54a 72.56b 105.33a 5.308 0.022
第8周Week 8 118.91 105.24 116.79 2.971 0.129
第12周Week 12 138.79 127.31 143.30 3.182 0.105


肿瘤坏死因子-α
TNF-α/(pg/mL)		 第4周Week 4 18.40ab 19.64a 15.12b 0.742 0.032
第8周Week 8 18.64ab 19.91a 15.47b 0.745 0.039
第12周Week 12 20.27ab 21.64a 16.74b 0.811 0.034


干扰素-γ
INF-γ/(pg/mL)		 第4周Week 4 58.00 62.00 53.31 2.911 0.321
第8周Week 8 61.65 66.02 57.16 3.164 0.380
第12周Week 12 87.30 84.62 74.83 3.276 0.173

2.4 低蛋白质饲粮添加蛋白酶和氨基酸对蛋鸡盲肠菌群的影响

如图2-a所示,CON组、LP组和LP+PAA组蛋鸡盲肠菌群分别包含了2 455、2 296和2 359个OTU,3组共有的OTU数为1 289个。如图2-b所示,各组盲肠菌群的物种稀释曲线都趋于平缓,说明测序数据量合理,结果可靠性高。如图2-c~图2-g所示,与CON组相比,LP组和LP+PAA组蛋鸡盲肠菌群Sob指数、Shannon指数、Ace指数和Chao1指数均有所降低,而Simpson指数有所提高,但差异均不显著(P>0.05),表明各组盲肠菌群α多样性无显著差异。如图2-h所示,各组样品测序覆盖度均超过99.3%,说明测序数据能够准确反映样品中的几乎所有菌群物种。本试验采用主坐标分析(PCoA)对蛋鸡盲肠菌群进行β多样性分析,并通过Bray-Curtis距离比较不同分组样本群落的差异性,样本的距离越接近,表示样本的物种组成结构越相似[17]。如图2-i所示,主坐标1(PCo1)和主坐标2(PCo2)分别占总变量的15.81%和13.80%,各组样点相互距离接近,表明各组间蛋鸡盲肠菌群β多样性无显著差异(P>0.05)。
图2 蛋鸡盲肠菌群多样性分析

a:盲肠菌群OTU数目 OTU number in cecum microbiota;b:稀释曲线 dilution curve;c:Sobs指数 Sobs index;d:Shannon指数 Shannon index;e:Simpson指数 Simpson index;f:Ace指数 Ace index;g:Chao1指数 Chao1 index;h:Coverage指数 Coverage index;i:OTU水平的主坐标分析 PCoA on OTU level。

Fig.2 Analysis of cecum microbiota diversity of laying hens

如图3-a所示,各组蛋鸡盲肠菌群在门水平的主要菌群为拟杆菌门(Bacteroidota)、厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteriota),相对丰度合计均超过90%。如图3-b所示,各组盲肠菌群在属水平的主要菌群为拟杆菌属(Bacteroides)、理研菌科RC9肠道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、乳杆菌属(Lactobacillus)和瘤胃球菌属扭链群(Ruminococcus_torques_group)等,相对丰度合计超过40%。
图3 蛋鸡盲肠菌群组成分析

a:门水平 phylum level;b:属水平 genus level。

Fig.3 Analysis of cecum microbiota composition of laying hens

3 讨论

3.1 低蛋白质饲粮添加蛋白酶和氨基酸对蛋鸡生产性能和蛋品质的影响

蛋鸡的生产性能是影响蛋鸡产业经济效益的首要因素。本试验表明,长期采食15.2%CP低蛋白质饲粮会降低蛋鸡产蛋率和日产蛋重。研究报道,饲粮CP水平从15.5%降低至13%,对产蛋率和料蛋比也有类似的负面影响[8]。Novak等[6]发现,16% CP水平饲粮降低2个百分点CP水平会降低蛋鸡体增重和产蛋率。张增玉等[18]报道,15.92% CP水平蛋鸡饲粮降低0.78个百分点CP水平会导致料蛋比显著提高3%以上。降低饲粮CP水平造成生产性能降低的原因可能是由于蛋白质分解供给的限制性氨基酸不足,蛋鸡优先将有限的氨基酸用于维持基础生命活动而非产蛋[19],最终导致生产性能的降低。
本试验还表明,在15.2% CP水平饲粮中复合添加蛋白酶和氨基酸可提升产蛋率和日产蛋重,改善料蛋比和蛋鸡体增重,达到与15.9% CP水平饲粮相当的生产水平。Rojas等[8]在低蛋白质饲粮中补充苏氨酸能够提升蛋鸡生产性能。Harsha等[20]在蛋鸡13.09% CP水平饲粮中添加400 g/t酸性蛋白酶能够提高蛋鸡产蛋率和平均蛋重。Ma等[5]发现,在蛋鸡低蛋白质饲粮中添加适量蛋氨酸可以提高日产蛋重,并且降低料蛋比。赖氨酸是肌肉和卵黄蛋白合成的关键底物,可提高蛋白质沉积效率[6],这可能是LP+PAA组蛋鸡体增重提高的原因之一。根据酶促反应理论,同时添加蛋白酶和反应产物氨基酸可能出现负反馈抑制酶解速率的情况[9],但动物消化道的排空特性和肠道高效的氨基酸转运系统可削弱氨基酸产物积累的抑制作用[21],而且饲粮蛋白质底物浓度(15.2% CP)远大于添加氨基酸浓度(总添加量为0.11%),蛋白质底物浓度占据主导地位,足以维持蛋白酶的酶解效率[22]。Maqsood等[10]发现,与仅添加200 mg/kg蛋白酶或者0.13%赖氨酸相比,复合添加200 mg/kg蛋白酶和0.13%赖氨酸能够显著提高肉鸡第1~21天的体增重并降低料重比,这与本试验结果一起印证了复合添加蛋白酶和氨基酸对理论上的“负反馈抑制”效应并不明显。蛋白酶通过与蛋白质分子的肽键或抗营养因子的结构位点结合,催化其水解断裂,生成小分子肽或氨基酸,从而提高营养物质的消化率[23]。添加的蛋氨酸、赖氨酸和苏氨酸分别为蛋鸡的第1、第2和第3限制性氨基酸,它们能在低蛋白质摄入条件下满足蛋鸡的营养需求并提高生产性能[5-6,24]。蛋白酶与必需氨基酸复合添加可能通过提高蛋白质代谢率和满足氨基酸供给的双重机制,提高蛋鸡生产性能。值得注意的是,LP组在降低0.7个百分点CP水平后饲粮中赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸含量分别为0.79%、0.44%和0.56%,均符合国家标准GB/T 5916—2020中对产蛋高峰期蛋鸡的这3类必需氨基酸的最低含量要求。LP组和LP+PAA组饲粮CP水平为15.2%,处于国家标准推荐区间15.00%~17.50%的下限,虽满足基本要求,但在实际生产应用时需警惕总氨基酸供给不足的风险。
蛋品质是影响蛋鸡产业经济效益的重要因素。研究表明,蛋鸡饲粮CP水平从15.92%分别降至15.12%和14.60%,除了提高蛋黄颜色外对其余蛋品质指标无显著影响[18]。Torki等[25]将52周龄来航蛋鸡饲粮的CP水平从16.5%降低至15.0%,同样仅观察到蛋黄颜色的提升,蛋形指数、哈氏单位、蛋黄率、蛋壳重量和蛋壳厚度均无显著变化。张琦[26]发现,即便将高峰期产蛋鸡饲粮CP水平从16.5%降低至于12.5%,蛋黄颜色会变深,但蛋壳厚度和硬度、蛋形指数、哈氏单位以及蛋白高度均无显著变化。与前人研究结果类似,本试验表明,各组间蛋品质指标均无显著差异,表明蛋品质受饲粮CP水平影响程度较小[27]。蛋壳强度和蛋壳厚度主要受饲粮矿物质和微量元素影响[28]。蛋黄颜色主要受脂溶性色素(如玉米中的叶黄素)影响[28],而本试验中各组饲粮配方的玉米含量相同,这可能是蛋黄颜色差异不显著的原因。孟艳莉等[29]在高峰期产蛋鸡15.2% CP水平饲粮中补充125 mg/kg蛋白酶,对蛋白高度和哈氏单位均无影响。Geng等[30]研究发现,13.49% CP水平饲粮若缺乏必需氨基酸会降低蛋重,但对哈氏单位、蛋壳厚度和蛋壳强度等蛋品质指标无影响。添加蛋氨酸和半胱氨酸提高了蛋鸡产蛋率,但对关键蛋品质指标无提升效果[19]。与以上单独添加蛋白酶或必需氨基酸的结论相似,本试验表明15.2% CP水平饲粮复合添加蛋白酶和必需氨基酸对鸡蛋品质的提升效果不显著,其原因可能是关键蛋品质指标受遗传因素影响较大,营养调控的改善空间有限[19]。

3.2 低蛋白质饲粮添加蛋白酶和氨基酸对蛋鸡肠道形态结构和养分表观代谢率的影响

肠道形态结构是评价畜禽肠道健康的重要指标,绒毛高度、隐窝深度及绒隐比反映了肠道的消化吸收能力[16]。Macelline等[31]认为,低蛋白质饲粮会损害家禽的肠道绒毛高度。本试验表明,15.9% CP水平饲粮降低0.7个百分点CP水平对蛋鸡十二指肠绒毛高度产生不利影响。其原因可能是必需氨基酸供应不足,影响肠道细胞的增殖和分化,进而影响不同肠段的绒毛高度和隐窝深度[32]。本试验结果还表明,15.2% CP水平饲粮复合添加蛋白酶和氨基酸可提高绒毛高度和降低隐窝深度,进而改善绒隐比。Wang等[33]研究指出,13.5% CP水平饲粮中添加蛋白酶可缓解北京鸭肠道受到的负面影响。Teng等[34]发现,在16% CP水平饲粮中添加0.75%苏氨酸能提高十二指肠绒毛高度。Ding等[35]报道,分别降低饲粮1和2个百分点CP水平会导致小肠各部位的绒毛高度和绒隐比降低,而在降低饲粮CP水平基础上添加300 mg/kg蛋白酶则可提高这些指标。蛋白酶能通过提高水解食糜蛋白质的效率,减少大体积食糜对肠道结构的机械损伤,并降解大豆抗原蛋白等抗营养因子[4]。Wang等[36]试验显示,热应激条件下在14.5% CP水平饲粮中添加赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸能减少家禽肠道上皮的损伤,补充的苏氨酸作为黏蛋白合成的重要成分,可增强肠道屏障功能[24]。由此可见,蛋白酶和必需氨基酸的复合添加能够协同促进蛋鸡肠道形态结构的改善。
饲粮养分表观代谢率与生产性能密切相关,是衡量蛋鸡对营养物质消化吸收效率的重要指标。王江水等[15]发现,降低蛋鸡饲粮2个百分点CP水平至15.3%,对CP表观代谢率没有显著影响。张思轩等[37]研究发现,降低蛋鸡2~4个百分点CP水平对蛋鸡钙表观代谢率无影响。与前人研究结果相似,本试验结果表明,饲粮CP水平降至15.2%对蛋鸡CP和钙表观代谢率没有显著影响。可能是低蛋白质饲粮通过刺激肠道分泌更多胰蛋白酶或提高酶活性等方式来提高CP表观代谢率,用于弥补蛋白质总量摄入的不足[38]。本试验还发现,15.2% CP水平饲粮添加蛋白酶和必需氨基酸可提高蛋鸡CP表观代谢率。孟艳莉等[29]报道,蛋鸡饲粮CP水平降低1个百分点且添加蛋白酶能提高44.39%的CP表观代谢率。肉鸡低蛋白质饲粮降低2个百分点CP水平后添加60 mg/kg蛋白酶可提高CP和必需氨基酸代谢率[4]。Fru-Nji等[39]在饲粮中添加200 mg/kg碱性蛋白酶可提高5.9% CP表观回肠消化率和7.2%能量表观回肠消化率。这种提高养分表观代谢率的原因可能是蛋白酶可分解饲料原料中的抗营养因子为小分子肽,而必需氨基酸的补充可以促进肠道结构的发育和完整[16],进而增强蛋鸡的消化吸收功能。本试验还发现,低蛋白质饲粮添加蛋白酶和必需氨基酸提高了蛋鸡粗纤维表观代谢率,这可能是由于蛋白酶能够分解植物细胞壁中的糖蛋白等结构,使肠道微生物能够更有效地接触底物,从而加速了植物纤维的微生物降解[40]。综上所述,蛋白酶和必需氨基酸的复合添加能够改善蛋鸡肠道形态结构,提高其对饲粮的养分表观代谢率,进而提高生产性能。

3.3 低蛋白质饲粮添加蛋白酶和氨基酸对蛋鸡血清免疫指标和盲肠菌群的影响

免疫球蛋白含量是评估体液免疫功能的关键指标,细胞因子则通过调节炎症反应来影响免疫功能[41]。张恒硕[14]研究表明,降低蛋鸡饲粮1个百分点CP水平对蛋鸡血清免疫球蛋白IgA、IgG、IgM以及细胞因子白细胞介素-4(IL-4)和TNF-α等血清生化指标均无显著影响。Kamely等[42]发现,降低罗斯肉鸡饲粮2个百分点CP水平后,血清TNF-α含量无显著变化。本试验结果表明,降低饲粮0.7个百分点CP水平至15.2%并未影响蛋鸡大部分血清免疫指标,如IgA、IgE、IgG、IgM、IgY、IL-6、TNF-α和INF-γ,推测该CP水平仍可满足免疫器官对营养的需求[14]。本试验还表明,15.2% CP水平饲粮复合添加蛋白酶和必需氨基酸能提高蛋鸡血清IgG和IgY含量,降低血清TNF-α含量。TNF-α含量的升高会加速畜禽体内养分代谢,提高蛋白质降解速率并降低合成速率,从而影响畜禽生产性能[41]。研究发现,蛋鸡饲粮补充苏氨酸含量在0.57%~0.67%可提高血清IgG和总免疫球蛋白含量[43],这可能是因为必需氨基酸的添加能够促进免疫球蛋白的形成,从而增强蛋鸡体液免疫功能,进而抑制促炎细胞因子的分泌[7]。
盲肠菌群对家禽营养代谢十分重要。本试验中,降低饲粮0.7个百分点CP水平至15.2%对蛋鸡盲肠菌群α和β多样性无显著影响,这与De Cesare等[44]及张恒硕[14]在肉鸡和蛋鸡研究中得出的结论相似,可能是因为微生物可通过代谢调节适应营养变化。15.2% CP水平饲粮复合添加蛋白酶和氨基酸后盲肠菌群多样性无改善效果,可能是添加的必需氨基酸主要在上消化道吸收,对盲肠菌群影响有限[3];而外源蛋白酶能够提高蛋白质在小肠中的消化吸收速率,从而减少未消化食糜进入盲肠对微生物群落产生影响[4]。本试验结果还显示,15.9% CP水平饲粮降低0.7个百分点CP水平对蛋鸡盲肠菌群组成结构无显著影响,复合添加蛋白酶和氨基酸亦无显著变化。3组蛋鸡盲肠菌群在门水平上主要由厚壁菌门和拟杆菌门构成,在属水平上主要由拟杆菌属、理研菌科RC9肠道群和乳杆菌属等构成[23]。推测可能是微生物自适应调节和饲粮CP水平变化较小等原因,使得肠道菌群的多样性和组成结构受影响程度较小。

4 结论

① 15.2% CP水平低蛋白质饲粮会降低海兰褐蛋鸡生产性能,但对蛋品质以及大部分血清免疫指标、盲肠菌群和养分表观代谢率无显著影响。
② 15.2% CP水平饲粮添加150 mg/kg蛋白酶和400 mg/kg蛋氨酸、400 mg/kg赖氨酸和300 mg/kg苏氨酸后能改善海兰褐蛋鸡生产性能、肠道形态结构、CP表观代谢率并增强免疫功能,但对蛋品质和盲肠菌群没有显著提升效果。

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