玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)又称F-2毒素,是由镰刀菌属真菌产生的一种雌激素类霉菌毒素,广泛存在于霉变饲料中,受霉菌毒素污染的饲料会导致畜禽生长迟缓、免疫抑制,并具有很强的生殖毒性和致畸性[1]。据调查,全世界每年约有25%的谷物会遭受霉菌毒素的污染,在温暖潮湿条件下谷物中ZEN的含量通常过高,ZEN污染现已成为世界性公共安全问题,严重阻滞我国畜牧业的健康发展[2]。ZEN具有较强的非极性和较好的脂溶性,在肠道中易吸收,摄入被ZEN污染的饲料后,ZEN会从胃肠道迅速吸收到血流中,参与体内的代谢循环,破坏畜禽上皮细胞完整性,引起肠道炎症和细胞毒性,影响免疫系统的功能状态,并诱导机体产生氧化应激,从而导致肝脏、肾脏、肠道和生殖系统等多组织损伤[3-4]。霉菌毒素还会在肉、蛋、奶等畜产品中蓄积,从而进入人类食物链,威胁消费者的身体健康[5]。因此,有效减少ZEN蓄积及其对机体造成的毒性损伤对畜牧业至关重要。
中药具有天然不耐药、低残留、多功效等优势[6],我国中药资源丰富,在畜牧业中应用广泛。研究显示,中药及其有效成分可以缓解ZEN诱发的机体损伤,具有防治霉菌毒素中毒的功效[7]。但目前缓解ZEN对机体损伤的研究主要集中于单一中药或有效成分上,未能从总体上探究和总结出治疗ZEN毒性的中药用药规律,不利于新型治疗ZEN中药产品的研发与机制研究。研究表明,猪和反刍动物是最易受ZEN影响的物种,ZEN在猪体内代谢后会转化为更具雌激素活性的α-玉米赤霉烯醇(α-ZEL)[8]。α-ZEL不仅可以显著增加叉头蛋白 O3a(FOXO3a)基因的表达,抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路,引发氧化应激和细胞凋亡[9],还会出现发情周期显著延长等一系列假发症状[10]。因此,本研究运用数据挖掘技术,以猪为研究物种,基于网络药理学及分子对接预测ZEN毒性分子机制与有效化合物,挖掘出治疗ZEN毒性作用的中药,分析用药规律,为治疗ZEN毒性损伤的中药研究与新药研发提供思路与基础。
1 材料与方法
1.1 ZEN毒性作用靶点筛选与信号通路分析
以“Zearalenone”为关键词,通过检索GeneCards(https://www.genecards.org)数据库获取并筛选ZEN毒性作用靶点,再通过STRING数据库(www.string-db.org)对其毒性作用靶点进行同源性验证。利用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov)对毒性作用靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析,物种选择“Sus scrofa”[11]。GO功能分析包括生物学过程(biological process,BP)、细胞组分(cellular component,CC)及分子功能(molecular function,MF),按P值由小到大排序,通过微生信网站(http://www.bioinformatics.com.cn)分别对排在前10位的GO功能富集结果与前20位的KEGG通路富集结果进行可视化分析。
1.2 候选化合物筛选
根据ZEN毒性作用靶点,通过TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php),以类药性(DL)≥0.18和口服生物利用度(OB)≥30%为筛选标准,检索得到与靶点相关的候选化合物。
1.3 “化合物-靶点”网络构建
将候选化合物与毒性作用靶点导入Cytoscape3.7.2软件中,构建“化合物-靶点”网络。网络中,节点表示化合物或靶点,边表示2个节点之间有联系,使用Centiscape2.2插件筛选Betweenness unDir、Closeness unDir、Degree unDir均大于各自均值的化合物节点作为治疗ZEN毒性的重要化合物。
1.4 毒性核心靶点筛选与分子对接
将ZEN毒性作用靶点导入STRING平台,模式设为“Multiple proteins”,种属设为“Sus scrofa”,进行蛋白质互作(PPI)网络分析。根据度值筛选出毒性核心靶点。将“化合物-靶点”网络中度值排名前5的重要化合物与PPI网络中排在前6位的毒性核心靶点进行分子对接。在UniProt数据库(https://www.uniprot.org)中下载核心靶点蛋白,选择条件应满足“已验证,物种猪”。在PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)中下载活性成分。将核心靶点蛋白和活性成分导入到AutoduckTools1.5.7软件中进行去水、加氢等前处理后进行半柔性对接分析,选择自由结合能数值最低的结合构象作为最佳构象(结合能越低,对接效果越好),利用PyMOL软件对结果进行可视化处理。
1.5 “靶点-化合物-中药”网络构建及中药频数分析
通过TCMSP数据库获取含有候选化合物的相关中药,建立“靶点-化合物-中药”网络,导入Cytoscape3.7.2软件进行可视化,根据度值大小确定治疗ZEN毒性损伤的重要潜在中药。参照2022年版《中华人民共和国药典》对这些相关中药名称进行规范化处理,同时收集涉及中药的性、味、归经等基本信息[12],分析中药频数。
2 结果与分析
2.1 ZEN毒性作用靶点与毒性可能机制
基于数据库共筛选到103个毒性作用靶点,富集于317个GO功能条目,其中BP、CC、MF分别富集到227、24、66个条目,占比分别为72%、8%、20%,选取BP、CC、MF中P值最小的前10个条目进行分析。如图1所示,BP主要包括应激激活的丝裂原活化蛋白激酶级联反应(stress-activated MAPK cascade)、白细胞介素-8生成的正向调控(positive regulation of interleukin-8 production)等;CC主要包括吞噬泡膜(phagocytic vesicle membrane)、细胞外间隙(extracellular space)等;MF主要包括核受体活性(nuclear receptor activity)、雌激素反应元件结合(estrogen response element binding)等。
图1 GO功能富集分析Enrichment score:富集得分;Biological process:生物过程;Cellular component:细胞组分;Molecular function:分子功能;Toll-like receptor signaling pathway:Toll样受体信号通路;sodium ion import across plasma membrane:钠离子跨质膜内流;stress-activated MAPK cascade:应激激活的丝裂原活化蛋白激酶级联反应;sodium ion transport:钠离子转运;positive regulation of interleukin-8 production:白细胞介素-8生成的正向调控;proton transmembrane transport:质子跨膜转运;positive regulation of interleukin-6 production:白细胞介素-6生成的正向调控;protein phosphorylation:蛋白质磷酸化;inflammatory response:炎症反应;immune response:免疫反应;phagocytic vesicle membrane:吞噬泡膜;early endosome:早期内体;membrane raft:膜筏;apical plasma membrane:顶侧质膜;focal adhesion:黏着斑;recycling endosome membrane:循环内体膜;extracellular space:细胞外间隙;Golgi apparatus:高尔基体;late endosome:晚期内体;basolateral plasma membrane:基底外侧质膜;cytokine activity:细胞因子活性;nuclear receptor activity:核受体活性;scaffold protein binding:支架蛋白结合;interleukin-2 receptor binding:白细胞介素-2受体结合;estrogen response element binding:雌激素反应元件结合;transmembrane signaling receptor activity:跨膜信号受体活性;protein serine/threonine kinase activity:蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性;growth factor activity:生长因子活性;MAP kinase activity:MAP激酶活性;steroid binding:类固醇结合。 Fig.1 GO functional enrichment analysis |
KEGG通路富集到142条通路,图2为P值最小的前20个KEGG通路,主要涉及Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、C型凝集素受体信号通路(C-type lectin receptor signaling pathway)、Janus激酶-信号传导和转录激活蛋白信号通路(JAK-STAT signaling pathway)等与免疫过程、细胞增殖、分化和凋亡相关通路。以上结果揭示,ZEN对机体的损伤与其调控多通路诱发的免疫抑制与细胞凋亡密切相关。
2.2 候选化合物及其与毒性作用靶点的关系
图3 化合物-靶点网络图橙色箭形代表候选化合物,蓝色三角形代表潜在靶点,连线代表两者之间存在相互联系。 Fig.3 Compound-target network diagram Orange arrow represents the candidate compound, blue triangle represents the potential target, and connecting line represents the mutual connection between the two. |
2.3 分子对接结果
根据度值挖掘ZEN毒性核心靶点。如图5所示,PPI网络中心颜色最深最大的节点为网络中度值最大的6个靶点,即毒性核心靶点,分别为肿瘤坏死因子(TNF)、白蛋白(ALB)、丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、白细胞介素-6(IL-6)、Toll样受体4(TLR4)和雌激素受体1(ESR1)。对治疗ZEN毒性损伤的5个重要化合物(汉黄芩素、四甲氧基木犀草素、异甘草黄酮醇、粘毛黄芩素Ⅱ、异橙黄酮)与6个毒性核心靶点进行50次半柔性对接,选择构象最高、结合自由能绝对值最大的对接结果。一般认为,结合亲和力(affinity)<0 kcal/mol(1 kcal/mol=4.184 kJ/mol)表示二者间可以结合,affinity<-5.0 kcal/mol表示二者结合活性较好,当affinity<-7.0 kcal/mol表示二者结合活性强烈。如表1所示,5个重要化合物和6个毒性核心靶点均可稳定结合,其中异甘草黄酮醇与ALB、MAPK14结合活性强烈(affinity<-7.0 kcal/mol),分子间相互作用关系如图6所示。
表1 靶点与化合物分子对接结果Table 1 Molecular docking results of targets with compounds |
| 项目 Items | 结合自由能Binding free energy/(kcal/mol) | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 肿瘤坏 死因子 TNF | 白蛋白 ALB | 丝裂原活化 蛋白激酶14 MAPK14 | 白细胞 介素-6 IL-6 | Toll样 受体4 TLR4 | 雌激素 受体1 ESR1 | |
| 汉黄芩素Wogonin | -5.14 | -6.09 | -5.93 | -5.21 | -6.30 | -5.62 |
| 粘毛黄芩素Ⅱ Viscidulin Ⅱ | -5.72 | -6.62 | -6.70 | -3.48 | -6.42 | -6.00 |
| 四甲氧基木犀草素 Tetramethoxyluteolin | -4.35 | -6.10 | -5.27 | -4.38 | -4.33 | -5.36 |
| 异甘草黄酮醇 Isolicoflavonol | -4.87 | -7.06 | -7.00 | -4.81 | -5.80 | -5.92 |
| 异橙黄酮 Isosinensetin | -3.07 | -3.21 | -3.63 | -2.66 | -3.07 | -2.53 |
2.4 “靶点-化合物-中药”网络
272个候选化合物通过TCMSP数据库及2022年版《中华人民共和国药典》,共筛选到433味相关中药,将度值大于6的重要中药导入Cytoscape软件,构建“靶点-化合物-中药”网络。如图7所示,网络共包含43个化合物、19个靶点和73味中药,存在580种相互联系,网络中度值大于10的中药共有17个,甘草、黄芩、青蒿、银杏叶为度值排在前4位的中药,为治疗ZEN毒性作用的重要中药。
2.5 中药性味归经频数统计
表2 候选中药性味分析Table 2 Property and taste analysis of candidate Chinese herbal medicines |
| 药性 Properties | 频次 Frequency | 占比 Proportion/% | 药味 Tastes | 频次 Frequency | 占比 Proportion/% | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 寒Cold | 162 | 38.03 | 苦Bitter | 250 | 58.69 | |
| 温Warm | 127 | 29.81 | 辛Pungent | 176 | 41.31 | |
| 平Equilibrium | 86 | 20.19 | 甘Sweet | 142 | 33.33 | |
| 凉Cool | 41 | 9.62 | 酸Acid | 30 | 7.04 | |
| 热Heat | 10 | 2.35 | 涩Puckery | 27 | 6.34 | |
| 咸Salty | 17 | 3.99 |
3 讨论
ZEN是一种由镰刀菌属菌株产生的真菌毒素,具有多种毒性作用,ZEN经动物摄入后,在小肠内被快速吸收并在肝脏中被代谢转化,继而引起肝脏、肾脏、脾脏、子宫、睾丸等器官病变,严重影响了动物的生产性能[13],给养殖业带来严重经济损失。欧洲食品安全局(EFSA)已报道羊奶、猪奶、牛奶和鸡蛋中均有ZEN检出,可诱发人类性早熟和乳腺癌,对人类造成安全隐患[14]。因此,研发出毒副作用小、无残留并有效治疗ZEN毒性作用的药物迫在眉睫。中药具有安全、毒副作用低、价格低廉等优点,被广泛应用于促进动物生产和疾病防治,通过数据挖掘分析治疗ZEN毒性作用的中药及其用药规律,可为动物ZEN毒性作用的防治以及相关药物的开发提供思路。
KEGG通路富集分析结果显示,TLR、TNF、JAK-STAT等信号通路与ZEN的毒性有较大相关性。Islam等[15]研究表明,TLR在ZEN诱导的炎症中发挥重要作用,ZEN暴露的妊娠大鼠肾脏中TLR4、TLR9 mRNA和蛋白表达水平增加,ZEN还可通过激活NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症体和核因子-κB(NF-κB)/p65通路,促进炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-10(IL-10)产生,加剧炎症反应,诱发氧化应激和凋亡[16]。PPI网络筛选出的TNF、IL-6、MAPK14、TLR4等毒性核心靶点均富集于TLR信号通路。TNF是从细胞增殖、细胞死亡和分化到炎症诱导和免疫调节的广泛生物活动的中心介质,通过与其受体结合激活IL-1β、TNF-α、IL-6等促炎基因的表达。另外,TNF可间接向干扰素调节因子-1(IRF-1)发出信号,以诱导类型干扰素(IFN)的产生,而IFN又可以结合IFNα/β受体并促进炎症介质的转录[17],从而引起机体免疫功能损伤。JAK-STAT信号通路是受细胞因子调节的主要信号通路,对于控制炎症和免疫反应至关重要。研究显示,靶向JAK/STAT信号通路的小分子抑制剂可抑制慢性炎症反应,有效减少慢性炎症标志物[18],在抵御霉菌感染中具有重要作用。以上结果说明,毒性作用靶点可通过多条通路介导炎性反应参与ZEN毒性损伤,抑制炎性反应可能是治疗ZEN毒性作用的重要途径。
基于数据挖掘技术,筛选出的5个对ZEN毒性作用具有治疗潜能的重要化合物(汉黄芩素、粘毛黄芩素Ⅱ、四甲氧基木犀草素、异甘草黄酮醇和异橙黄酮)均为黄酮类物质,这些化合物具有广泛的抗炎活性,可通过抗炎作用缓解ZEN毒性损伤。研究显示,在妊娠和哺乳母猪的饲粮中添加汉黄芩素可改善生产性能、提高免疫力,防治因霉菌感染诱发的疾病[19]。ZEN暴露可诱发肝细胞发生氧化应激,导致肝细胞肿胀和弥漫性坏死等肝脏损伤[20]。汉黄芩素可通过下调促炎细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的表达水平,抑制NLRP3炎性小体的激活,改善氧化应激和炎症反应[21],缓解ZEN诱发的器官损伤。粘毛黄芩素Ⅱ作为一种天然抗氧化剂,能够清除体内的自由基,饲粮中添加粘毛黄芩素Ⅱ可有效增强养殖动物的抗病能力,减少ZEN毒性对动物机体的氧化应激损伤[22]。四甲氧基木犀草素是一种新型黄酮类化合物,具有显著的抗炎活性,能抑制肥大细胞(MCs)激活,减少IL-6、TNF的释放,其机制可能与抑制动物细胞内钙水平的增加有关,可用于治疗霉菌感染和由炎症引起的疾病[23]。异甘草黄酮醇是一种异戊二烯基类黄酮,具有抗菌、抗炎等多种活性,通过抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化,下调促炎性细胞因子、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧化酶2(COX2)表达发挥抗炎作用[24],还可通过抑制NLRP3炎性小体的激活缓解肝脏损伤[25]。异橙黄酮为柑橘皮和果肉中的黄酮类化合物,具有抗氧化、抗炎、抑菌、抗病毒等多种活性[26],可通过激活Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)/核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路来上调抗氧化酶的表达水平,降低细胞内活性氧(ROS)水平,发挥抗氧化损伤作用,恢复细胞内稳态[27]。分子对接验证,5个重要化合物与6个毒性核心靶点均可稳定结合,汉黄芩素与6个靶点的结合能均<-5 kcal/mol,表明这些化合物对ZEN毒性损伤具有较好的药效活性,说明黄酮类化合物及其富含的中药是研发治疗ZEN药物的重要资源。
甘草、黄芩、青蒿、银杏叶是基于“靶点-化合物-中药”网络筛选出的与ZEN毒性作用靶点相关性最强的4味中药。甘草中含有异甘草黄酮醇、甘草酸、甘草多糖等活性成分,常被添加到饲粮中用于改善动物生长性能、免疫性能和肉品质。饲粮中添加甘草茎叶能提高育肥巴什拜羔羊的生长性能、屠宰性能及免疫功能[28]。甘草提取物可缓解ZEN导致的肉鸡肝脏损伤[29],其机制可能与下调肝脏中TNF-α和NADPH氧化酶2(NOX2)mRNA表达以及上调SOD、GSH活性进而抑制氧化应激有关[30]。饲粮中添加甘草多糖可增加动物盲肠微生物群的多样性并改变其组成,通过改善动物新陈代谢和应激状态加速霉菌毒素从体内消除及减少其与靶器官的结合[31]。甘草酸则可以通过抑制半胱天冬酶-3(Caspase-3)、TNF-α释放和NF-κB核移位,发挥抗凋亡作用,从而缓解由霉菌毒素引起的肝脏损伤[32]。黄芩富含汉黄芩素、粘毛黄芩素Ⅱ等黄酮类化合物,具有抗氧化、抗炎等作用。研究表明,黄芩可通过提高雌性动物血清抗氧化能力及性激素水平、增强子宫及卵巢雌激素受体α的表达来缓解ZEN造成的氧化损伤和生殖毒性[33]。青蒿具有抑制霉菌生长及毒素合成的作用[34],在动物饲粮中加入青蒿可有效抑制饲料霉变,降低动物霉菌毒素毒性风险,其提取物还具有抑制促炎细胞因子TNF-α和IL-17表达,缓解动物肺脏损伤的作用[35]。银杏叶及其提取物含有黄酮、多糖等多种活性物质,可导致霉菌细胞死亡,其机制与诱发霉菌细胞内产生过量ROS导致DNA损伤和细胞凋亡有关[36],同时,银杏叶内生真菌产生的次生代谢产物,协同加强了银杏叶抗菌效果。中药青蒿、银杏叶及其活性成分在治疗ZEN毒性作用方面未见相关报道,值得深入研究与探讨。
肝脏是ZEN攻击的主要靶器官[37],肝脏受损会诱发ROS的产生和脂质过氧化,抑制蛋白质的合成,导致动物生长迟缓。治疗ZEN毒性作用相关中药主要归肝经、肺经次之,肝为生机之主使,肝气损伤、气机失调为疾病的源头,入肝经药多具有清热、祛风湿、活血化瘀的功效,故采用归肝经中药如青蒿,肺为气之主,呼吸之本,直接关系到人体的气血运行,入肺经药多具有清热、解表、补虚的功效,故采用归肺经中药,如甘草、黄芩、银杏叶,肝肺共同作用使气机升降有序,从而保证气血津液的正常运行。基于性味分析发现,候选中药中以寒、温、苦、辛为主,苦寒药物如黄芩以清泻内热为主要治法,苦味能泄、能燥,寒性药物多具清热泻火、凉血解毒的功效,温性中药则具有抗炎、抗菌、镇痛、影响免疫功能等药理作用,并以辛味疏肝行气活血,以达标本兼治[38]。综上可知,治疗ZEN毒性损伤的中药应寒热配伍,以扶正祛邪,补气助阳、滋阴养血为治疗原则,其用药规律与治疗黄曲霉菌[39]基本一致。
4 结论
本研究系统地分析了ZEN毒性分子机制、中药治疗的物质基础、治疗靶标和用药规律,与中医药的“多成分、多靶点、多通路”治疗理念相吻合。