外泌体作为介导细胞间通讯的纳米级囊泡(30~150 nm),通过递送蛋白质、核酸等活性分子,在免疫调节与疾病进程中发挥关键作用[1-3]。乳源性外泌体因具有脂质双分子层保护的胃肠稳定性,成为跨物种营养传递的研究热点[3-4]。据报道,母乳外泌体不仅能够促进早产儿肠道成熟,还可显著降低坏死性小肠结肠炎(NEC)等疾病的发病率[5-6];牦牛乳外泌体不仅可在缺氧条件下促进肠上皮细胞增殖,还可通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/补体3(PI3K/AKT/C3)通路缓解脂多糖诱导的肠道炎症[7-8]。此外,牛乳外泌体能够维持肠上皮细胞的完整性,促进机体肠道发育,并在炎症性肠病和坏死性小肠结肠炎等疾病的治疗中展现出潜在的应用价值[9-10]。Lu等[11]研究发现,绵羊乳中的外泌体miRNAs可通过抑制Toll样受体4/肿瘤坏死因子受体关联因子1-核因子κB抑制蛋白α-p65亚基(TLR4/TRAF1-IκBα-p65)信号通路,降低白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-12(IL-12)的含量来缓解小鼠肠道炎症。目前,人乳和牛乳外泌体的分离体系较为完善,功能探索已较为深入;而绵羊乳外泌体尚未建立成熟的分离体系,其功能特性尚未系统阐明。
绵羊乳的脂肪球粒径(3.50 μm)较牛乳(4.55 μm)更小,蛋白凝块更易消化[12],且致敏性S1-酪蛋白含量仅为1%~3%(牛乳约30%)[13],是过敏人群体的理想营养源。羊乳中酪蛋白含量丰富且高丰度的酪蛋白胶束(50~500 nm)与外泌体粒径部分重叠[14];此外,酪蛋白胶束团通过流体力学效应形成空间位阻屏障,进一步影响了外泌体的分离[15]。因此,传统差速离心法存在分离效率低、纯度不足等技术瓶颈[16]。针对以上问题,本研究系统优化了绵羊乳外泌体的提取策略。通过引入柠檬酸钠螯合钙离子破坏酪蛋白胶束稳定性,结合乙酸调节等电点沉淀酪蛋白的预处理方式,并与超高速离心技术进行多维度比较。阐明不同预处理方式对外泌体的颗粒数量、粒径分布、RNA及蛋白质质量的影响,旨在建立高效、稳定的绵羊乳外泌体分离体系。本研究为解析绵羊乳外泌体的生物学特性提供了参考,同时,为后续绵羊乳作为功能性食品开发应用提供了理论支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本研究以新疆地区收集到的10份新鲜东弗里生绵羊奶为样本。为避免细菌污染和蛋白质变性,采用标准挤奶方法采集样品,储存于无菌的50 mL离心管中。将10份羊奶均匀混合后在-80 ℃下保存备用。
1.2 样品前处理
首先,将奶样在4 ℃、3 000×g下离心30 min,去掉脂肪球和细胞碎片,收集上清;然后,将上清12 000×g离心60 min,去掉细胞碎片、酪蛋白和残留的脂肪球等物质,收集上清;最后,将脱脂乳分别经过超高速离心处理、乙酸预处理和柠檬酸钠预处理(图1)。
高速离心处理:脱脂乳12 000×g离心60 min,收集上清。乙酸预处理:将250 μL浓度为1 mol/L的乙酸加入到25 mL脱脂乳中,室温孵育10 min,在4 ℃、10 000×g离心15 min。柠檬酸钠预处理:将脱脂乳与等体积的3.0% (w/v)柠檬酸钠混合,并在4 ℃下摇匀,以充分破坏酪蛋白胶束。45 min后,乳液呈半透明状,4 ℃、8 000×g离心30 min,收集上清,丢弃残留的细胞碎片和其他颗粒。
预处理完成后用超高速离心提取乳中的外泌体。首先将50 mL离心管中的绵羊乳倒入超高速离心管中(6个),4 ℃、35 000×g离心60 min,离心结束后收集上清。然后将上述离心后上清倒入新的离心管中,用磷酸盐缓冲液(PBS)配平,4 ℃、70 000×g离心60 min,离心结束后收集上清。最后将再一次离心后的上清倒入新的离心管中,用PBS配平,4 ℃、120 000×g离心90 min弃上清,管底部的白色胶状物即为外泌体。每管用3 mL PBS溶解,吹散,并用0.22 μm过滤器(Millipore,美国)过滤收集外泌体。
1.3 外泌体的鉴定
将稀释后的外泌体滴加并使其充分附着在铜网上。然后滴加乙酸双氧铀负染30 min,静置干燥。干燥后的铜网于透射电镜(TEM, Hitachi H-7500 Hitachi,日本)下观察并拍照。
采用纳米颗粒跟踪分析(NTA)测定外泌体的粒径和颗粒数。将稀释后的外泌体在恒流条件下(流速=50 μL/min)自动注入NTA系统。采用NTA3.4软件分析外泌体的粒径和颗粒数。
1.4 外泌体中RNA和蛋白质的浓度分析
使用TRIzol(Invitrogen,美国)法提取外泌体总RNA。将400 μL纯化外泌体与1 mL TRIzol混合,涡旋30 s后室温孵育10 min,冰浴5 min强化裂解;加入200 μL氯仿振荡乳化,4℃、12 000×g离心15 min,收集上层水相并与等体积异丙醇及1 μL糖原(20 mg/mL)混合沉淀,4 ℃、12 000×g离心15 min收集RNA;沉淀经75%乙醇洗涤后溶解于20~30 μL无RNase水,55 ℃孵育5 min促进溶解。使用Nanodrop分光光度计(Thermo Scientific,美国)测定样品在260和280 nm处的吸光度。试验全程使用RNase-free耗材,离心条件均在4 ℃进行以降低降解风险。
使用预冷的放射免疫沉淀分析裂解缓冲液(RIPA)和苯甲基磺酰氟(PMSF)(1∶100)进行全蛋白提取。将外泌体与裂解缓冲液按1∶2 (v/v)比例混合,冰上孵育30 min,期间每10 min涡旋振荡30 s以促进裂解。随后于4 ℃、12 000×g离心10 min,收集上清液来测定蛋白质的浓度。根据制造商的使用说明书,使用BCA蛋白检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)测定总蛋白浓度。
1.5 数据统计分析
所有数据均以“平均值±标准差”表示,每次测量均重复3次。使用GraphPad Prism 10进行方差分析和作图。P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。
2 结果与分析
2.1 外泌体的形态
外泌体是由细胞分泌的具有膜结构的囊泡,透射电镜可清晰看到其形态结构。如图2所示,所有的外泌体都表现出典型的“杯状”形态。普通超高速离心的外泌体以粒径为主,颗粒数相对较少且分散;乙酸预处理后的外泌体粒径大小不一,颗粒丰富且较集中;柠檬酸钠预处理后的外泌体以小粒径为主,且颗粒数丰富。综上所述,经过乙酸或柠檬酸钠预处理后提取的外泌体的颗粒数更多,浓度更高。
2.2 外泌体的粒径分析
采用NTA分析3种处理方法提取外泌体的颗粒数及粒径大小发现,超高速离心、乙酸和柠檬酸钠预处理下的绵羊外泌体的粒径主要分布于50~150 nm(图3)。进一步分析峰值发现,超高速离心或柠檬酸钠预处理分离的外泌体的粒径峰值分别为124.7和140.9 nm(图3-A和图3-C)。而通过乙酸预处理分离的外泌体的粒径有2个峰值,分别为148.8和248.3 nm,所占比例分别为87.5%和12.5%(图3-B)。此外,通过超高速离心、乙酸、柠檬酸钠预处理提取外泌体的平均粒径分别为(138.0±42.3) nm、(175.4±55.2) nm和(162.4±50.3) nm;通过3种方法分离的外泌体的颗粒数分别为5.2×107、2.4×107和6.3×107 粒/mL(图3-A~图3-C)。以上结果表明,相对于传统的超高速离心处理,通过柠檬酸钠预处理产生的外泌体颗粒数更多。
图3 纳米颗粒跟踪分析不同处理提取绵羊乳外泌体的粒径A:超高速离心处理后外泌体的粒径和颗粒数;B:乙酸预处理后外泌体的粒径和颗粒数;C:柠檬酸钠预处理后外泌体的粒径和颗粒数;D:粒径在30~150 nm的外泌体颗粒数;E:粒径>150 nm的外泌体颗粒数。**代表差异极显著(P<0.01);ns代表差异不显著(P>0.05)。 Fig.3 Nanoparticle tracking analysis of particle size of sheep milk exosomes extracted by different treatments A: The particle size and particle number of exosomes after ultra-high-speed centrifugation pretreatment; B: the particle size and particle number of exosomes after acetic acid pretreatment; C: the particle size and particle number of exosomes after sodium citrate pretreatment; D: the number of exosome particles with a particle size ranging from 30 to 150 nm; E: the number of exosome particles with a particle size larger than 150 nm.** indicates extremely significant difference (P<0.01);ns indicates no significant difference (P>0.05). |
2.3 外泌体中RNA和蛋白质的质量分析
图4 不同处理提取绵羊乳外泌体中RNA及蛋白质的质量分析*代表差异显著(P<0.05);**代表差异极显著(P<0.01);ns代表差异不显著(P>0.05)。 Fig.4 Quality analysis of RNA and protein extracted from sheep milk exosomes extracted by different treatments * indicates significant difference (P<0.05);** indicates extremely significant difference (P<0.01); ns indicates no significant difference (P>0.05). |
3 讨论
羊奶因其独特的营养价值和保健功效,被人们誉为“奶中之王”。它含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素以及矿物质等营养成分,这些成分易于被人体吸收,能够有效增强免疫力,对各个年龄段的人群都有诸多益处,特别是对于儿童、老人以及有特殊健康需求的人群来说,羊奶更是一种理想的营养补充来源[17]。近年来,随着科学技术的不断进步以及研究方法的日益完善,外泌体的研究迎来了快速发展的新阶段。相关研究表明,外泌体中的蛋白质成分在细胞间的信号传导和细胞增殖中发挥重要作用;其中的RNA通过调控免疫耐受,先天免疫中的Toll样受体(TLR)信号和适应性免疫反应,对维持机体的健康状态以及疾病防控有深远影响[18];而外泌体所含的DNA、脂质等其他成分,与外泌体的生物合成过程、细胞识别机制以及受体细胞对外泌体的有效摄取等关键环节密切相关,展现出巨大的医学应用潜力和研究价值[19-21]。因此,优化外泌体的提取流程对于深入挖掘其潜在价值、推动相关研究与应用的发展具有至关重要的意义。
本研究通过系统比较超高速离心、乙酸及柠檬酸钠预处理对绵羊乳外泌体分离效率的影响,揭示了不同预处理策略在粒径控制、颗粒富集及RNA和蛋白质质量等方面的差异性。结果表明,柠檬酸钠预处理的外泌体颗粒数极显著高于其他处理,这一现象可能与其独特的钙离子螯合机制密切相关。柠檬酸钠可通过竞争性结合酪蛋白胶束中的钙离子(Ca2+),破坏胶束的三维网络结构[22-24],从而减少外泌体与酪蛋白的共沉淀。相比之下,乙酸预处理分离的外泌体的粒径有2个峰值,这有可能是因为乙酸预处理会影响外泌体的聚集或解聚行为,从而产生2个不同的粒径群体[25]。此外,乙酸虽能通过降低pH至酪蛋白等电点(pH 4.6)促进其沉淀[23],但酸化过程可能导致外泌体表面电荷失衡,促使颗粒聚集形成248.3 nm的大粒径群体,这与牛乳外泌体的酸敏感性研究结果[25]一致,提示乳源外泌体的理化稳定性存在物种特异性差异。本研究发现,绵羊乳外泌体的平均粒径为138.0~175.4 nm,略大于牛乳外泌体(120~150 nm)[26],但显著小于山羊乳外泌体(100~250 nm)[27]。这种种属差异可能源于乳腺上皮细胞分泌调控通路的特异性。例如,牦牛乳外泌体因高原适应性进化富含缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)等缺氧响应蛋白[8,28],而绵羊乳外泌体较小的粒径(50~150 nm,占比>85%)可能与其脂肪球小(3.8 μm)、蛋白凝块易消化的特性相关[13]。
本研究进一步对外泌体中RNA的质量进行了检测,发现3种处理方式提取的外泌体均未引起核酸显著降解。其中,柠檬酸钠预处理RNA浓度较超高速离心处理提高约40%,这可能归因于螯合剂对核酸酶的抑制作用[23],提示该方法在功能性RNA提取方面具有独特优势。同时,本研究的蛋白质浓度数据为评估预处理方法的纯化效率提供了关键证据。超高速离心处理的高蛋白质浓度可能反映其对外泌体特异性分离能力的不足,这与在牛乳研究中观察到的结果一致:未预处理的离心法易导致外泌体与酪蛋白胶束共沉淀[23,29]。乙酸预处理处理蛋白质浓度最低,表明其通过调节pH至酪蛋白等电点(pH 4.6)有效去除了乳源性杂蛋白,但其外泌体颗粒数极显著低于柠檬酸钠,提示酸化可能对外泌体完整性造成部分破坏。柠檬酸钠预处理在平衡蛋白质去除与外泌体保留方面表现最优:其蛋白质浓度较超高速离心处理降低29%,同时外泌体浓度提高21%。这一结果可能归因于柠檬酸钠的钙离子螯合作用选择性破坏酪蛋白胶束,而非外泌体膜结构[23,25]。然而,未来仍需通过Western blot检测外泌体标志蛋白[如分化簇 63(CD63)、肿瘤易感基因 101(TSG101)]进一步验证纯度,并评估功能蛋白的纯化效率。
从技术创新的角度来看,本研究通过双路径预处理(钙离子螯合与等电点沉淀)解决了绵羊乳中酪蛋白-外泌体共分离的技术难题,为低丰度外泌体的高效提取和精准表征提供了方法学参考;同时,通过与既往研究对比,乳源外泌体在粒径分布上存在种属差异,绵羊乳外泌体独特的粒径范围可能与绵羊乳腺上皮细胞的高代谢速率相关[30]。从应用前景来看,优化后的柠檬酸钠-超速离心法为绵羊乳外泌体的规模化制备提供了可行方案。鉴于绵羊乳的低致敏性及外泌体的肠道保护作用,其或可开发为新型营养干预剂,用于过敏体质人群的肠道健康管理。此外,绵羊乳外泌体较小的粒径有利于其穿透生物屏障,在药物递送系统设计中也具有潜在价值。这些应用方向的实现,亟需跨学科合作以攻克外泌体保存稳定性、靶向修饰及功效评价等技术瓶颈。
4 结论
本试验通过超高速离心、乙酸和柠檬酸钠预处理,结合超速离心技术优化了绵羊乳外泌体的分离效率,获得了形态结构完整、浓度较高且优质的外泌体。与超高速离心相比,乙酸和柠檬酸钠预处理均能有效减少酪蛋白的干扰;同时,柠檬酸钠预处理提取的外泌体颗粒数多、粒径小且纯度好,提取效率最佳。