Chinese Journal of Animal Nutrition >

2025 , Vol. 37 >Issue 11: 7955 - 7969

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.647

RESEARCH PAPER

Optimization of Synergistic Fermentation Process for Seaweed Residue Using EM Complex Bacteria and Cellulase to Produce Fermented Seaweed Feed

  • CONG Yijie
Expand
  • Department of Food and Medicine, Weihai Ocean Vocational College, Rongcheng 264300, China

Received date: 2025-03-13

  Online published: 2025-11-14

Fold

Abstract

In order to improve the comprehensive utilization of seaweed resources, this study used seaweed residue-a byproduct of seaweed processing-as raw material to produce fermented seaweed feed through synergistic fermentation with cellulase and EM complex bacteria, and optimized the fermentation process. A single-factor experiment was first conducted to investigate the effects of material moisture content, EM complex bacteria addition amount, cellulase addition amount, fermentation temperature, and fermentation time on the crude fiber and crude protein contents of the fermented seaweed feed. Subsequently, based on the results of the single-factor experiment, response surface method was used to optimize the EM complex bacteria addition amount, cellulase addition amount, fermentation temperature, and fermentation time, so as to determine the optimal fermentation process for producing fermented seaweed feed from seaweed residue. Finally, the quality of the fermented seaweed feed produced under the optimal process conditions was evaluated. The results showed that the optimal process of seaweed feed was as follows: material moisture content 50%, EM complex bacteria addition amount 14%, cellulase addition amount 4%, fermentation temperature 36 ℃, and fermentation time 7 days. The fermented seaweed feed prepared under these optimal conditions exhibited typical fermented sour aroma, loose and uniform structure, slight discoloration, and was free of off-odors or impurities; the contents of crude fiber and crude protein of the fermented seaweed feed fermented under the optimal process conditions were 14.28% and 16.17%, respectively; all microbial indicators, including total colony count and E. coli count, complied with the Hygienical Standard for Feed (GB 13078—2017). In conclusion, the process parameters for producing fermented seaweed feed from seaweed residue through synergistic fermentation using EM complex bacteria and cellulase by combining single-factor experiment with response surface method are optimized in this study. Consequently, an efficient fermentation process model was established with crude fiber and crude protein contents as the core evaluation indicators.

Key words： fermented seaweed feed; EM complex bacteria; cellulase; response surface optimization; fermentation process

Cite this article

CONG Yijie . Optimization of Synergistic Fermentation Process for Seaweed Residue Using EM Complex Bacteria and Cellulase to Produce Fermented Seaweed Feed[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2025 , 37(11) : 7955 -7969 . DOI: 10.12418/CJAN2025.647

海藻是重要的海洋生物资源,现存大型海藻包括红藻、绿藻、褐藻三大类别[1-2],我国黄渤海地区已发现的属于上述三大类别的海藻多达200种[3]。这些藻类中富含生物活性物质,如蛋白质、多糖、甾醇类化合物、萜类化合物、多酚类化合物、大环内酯类化合物等,具有抗病毒、抗菌、抗辐射、抗氧化以及免疫调节的作用,因此具有较高的应用价值[4]。海藻资源因富含营养物质及活性物质,常被用作动物饲料食用,能够优化饲料的营养结构同时提升饲料综合利用率[5]。
海藻饲料在禽、畜及水产养殖中的应用效果均有研究报道,对养殖动物有诸多好处:其一,海藻饲料可以为动物提供较为全面的营养,满足其生长发育和日常活动的能量需求,促进动物生长。Azizi等[6]评估了不同水平的褐藻和绿藻对肉鸡生长性能的影响,结果表明不同水平的褐藻和绿藻在育雏阶段显著提高了体重和采食量。Jiang等[7]以孔石莼、脱胶海带、毛藻、大叶藻、羊栖菜和鼠尾藻等7种大型海藻的粉末作为硅藻附着的载体,将有载体培养的硅藻和商品饲料分别饲喂湿重为(5.0±2.0) g的幼参,投喂载体硅藻的幼参生长速度提高了约1.5倍。其二,海藻饲料可以改善动物产品如肉、蛋、奶等的品质。Nhlane等[8]研究了不同水平的绿海藻粉对Boschveld土鸡肉品质和稳定性的影响,结果显示时间与饲粮互作对鸡肉的红度值有显著影响,贮藏24 h后,添加3.5%海藻粉组鸡肉的红度值(2.47)显著高于添加3.0%海藻粉组(0.48)。Bratova等[9]研究了海藻粉对母鸡产蛋性能的影响,结果发现,与对照组相比,添加2%海藻粉能够使蛋鸡的产蛋量提高22.7%,蛋壳重量显著增加,蛋壳中钙和镁的含量以及蛋黄中胡萝卜素、维生素A和维生素E的含量也显著提高。其三,海藻饲料可以改善动物的生理功能。Cartes等[10]研究发现,巨藻饲料能够调控奶牛的生产性能、氧化应激能力和瘤胃发酵情况,调整奶牛瘤胃中的菌群结构,提高奶牛产奶品质。Valentin等[11]探究了红藻杉藻不同藻体形态(完整藻体、甲醇提取物及提取残渣)及添加水平(1.5%、3%与6%)对褐篮子鱼幼鱼生长速率、饲料效率及肠道微生物组的影响,结果发现,摄入6%甲醇提取物的试验组特定生长率最高,与对照组相比提升了49%;投喂含藻饲料的试验组2周后肠微生物组中潜在致病性较对照组显著降低;投喂含3%完整藻体饲料的褐篮子鱼,其性成熟个体比例与先天免疫反应均优于对照组。
目前我国饲用海藻的深加工研究较少,一般将大型海藻直接投喂给动物做饲料食用,或将其简单加工成海藻粉与其他基础饲料混合投喂动物。然而,海藻富含纤维素、海藻胶、琼脂等复杂的物质,动物体内缺少能够分解这些复杂物质的特定的酶,因此直接投喂会使动物无法完全消化其中的营养成分,从而造成海藻资源的浪费。研究显示,饲料经过微生物发酵制成发酵饲料后可以有效提高饲料的转化率,促进动物生长发育,提高动物免疫力,改善动物产品品质[12]。
海藻残渣是企业通过浸泡、消解、过滤、沉降等工艺流程生产海藻酸钠、海藻糖胶等过程中的副产物。对海藻残渣的处理方法通常是填埋或者焚烧,处理成本较高且易污染环境。海藻残渣中仍有大量残存的海藻胶和部分蛋白质、氨基酸等,利用海藻残渣制备动物饲料能够有效优化饲料营养结构同时提升海洋资源副产物的利用率。我国利用海藻残渣生产发酵饲料的研究还比较少,并且发酵采用的菌多为单一菌或复合菌,而利用复合菌和纤维素酶联合发酵海藻残渣制备发酵海藻饲料的研究更是鲜有报道。EM复合菌由酵母菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、光合菌、放线菌等有益微生物组成,应用于发酵饲料的制备,可以有效提高饲料的转化率,促进动物生长发育,提高动物免疫力,改善动物产品品质[13]。纤维素酶能够高效破坏海藻细胞壁中粗纤维结构,降低海藻的粗纤维含量,使其更易被动物消化利用[14]。
本试验以海藻残渣为原料,利用EM复合菌与纤维素酶协同发酵制备发酵海藻饲料,采用单因素试验和响应面法优化发酵海藻饲料的发酵工艺,以期为大型海藻类资源加工副产物的利用以及新型功能性饲料的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用海藻残渣为山东威海沿海地区海带、裙带菜等海藻的加工副产物,纤维素酶的活菌数为1.8×105 U/g,EM复合菌由酵母菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、光合菌、放线菌等组成,每毫升含有益菌总数≥2×1010 CFU。

1.2 试验方法

1.2.1 发酵海藻饲料生产工艺

发酵海藻饲料生产工艺流程如图1所示,其操作要点如下。
图1 发酵海藻饲料生产工艺流程

Fig.1 Production process flow of fermented seaweed feed

样品粉碎:将海藻残渣粉碎至颗粒直径为3~5 mm。
原辅料混匀:按质量比将海藻残渣粉与氯化铵、磷酸二氢钾、玉米粉等其他配料混合搅拌均匀。
菌液配制:将EM复合菌加入浓度为1%的白糖配制的糖水溶液中,充分混匀,静置6 h备用。
发酵处理:将pH调节至5.0~6.0,并调整含水量后将物料装入容器中,添加纤维素酶,将EM复合菌液均匀喷洒在原辅料上,翻拌均匀,置于培养箱中在设定的温度下发酵。

1.2.2 单因素试验

制备发酵海藻饲料的基础配方:海藻残渣粉500 g,水800 g,玉米粉8 g,氯化铵9 g,磷酸二氢钾5 g。依据上述配方进行预试验(工艺参数:EM复合菌添加量为75 mL,纤维素酶添加量为20 g,发酵温度35 ℃,发酵时间7 d),根据预试验结果设计单因素试验,分别考察以下因素对海藻饲料粗纤维和粗蛋白质含量的影响:物料含水量(30%、40%、50%、60%、70%),EM复合菌添加量(5%、10%、15%、20%、25%),纤维素酶添加量(2%、3%、4%、5%、6%),发酵温度(25、30、35、40、45 ℃),发酵时间(3、5、7、9、11 d)。

1.2.3 响应面试验

依据单因素试验结果进行响应面优化,选取EM复合菌添加量(A)、纤维素酶添加量(B)、发酵温度(C)、发酵时间(D)4个因素,以粗纤维含量(Y1)和粗蛋白质含量(Y2)为响应值,进行4因素3水平的Box-Behnken响应面试验(表1),优化发酵海藻饲料的生产工艺。
表1 响应面试验的因素与水平设计

Table 1 Factor and level design of response surface test

水平
Levels		 因素Factors
EM复合菌添加量
EM complex bacteria
addition amount (A)/%		 纤维素酶添加量
Cellulase addition
amount (B)/%		 发酵温度
Fermentation
temperature (C)/℃		 发酵时间
Fermentation
time (D)/d
1 20 5 40 9
0 15 4 35 7
-1 10 3 30 5

1.2.4 海藻饲料质量评价

利用响应面试验得出的最佳发酵工艺制备的发酵海藻饲料,对其质量进行评价。

1.2.4.1 营养成分测定

发酵前后海藻饲料中粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维、粗灰分和水分含量的测定分别参考GB/T 6432—2018、GB/T 6433—2006、GB/T 6434—2022、GB/T 6438—2007和GB/T 6435—2014。

1.2.4.2 发酵海藻饲料微生物指标测定

称取10 g发酵海藻饲料,将其加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中,振荡混合均匀,取1 mL混合好的液体,加入9 mL无菌生理盐水,同理,按10倍梯度进行逐步稀释。分别准备好细菌菌落、志贺氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌、霉菌的选择性固体培养基以及MRS固体培养基,并分别取100 μL梯度稀释液加入上述培养基中进行涂布接种,培养48 h,记录每个培养基的菌落数[15-16]。

1.2.4.3 发酵海藻饲料的感官评价

按照表2中所列评分标准[17]对发酵海藻饲料的外观、气味、质地和杂质进行评分。
表2 发酵海藻饲料的感官评价标准

Table 2 Sensory evaluation criteria of fermented seaweed feed[17]

项目Items 评分标准Scoring standard 得分Score



外观Appearance (20)		 与原料相似,呈褐色,颗粒大小适度,具有饲料应有的形状 16~20
略有变色,呈深褐色或淡黄色,颗粒较大或较小,形状尚可 10~15
变色严重,呈墨色或浅黄色,颗粒太大或太小,形状很差 <10



气味Smell (30)		 有典型的碘味,散发干草味,具有发酵后的酸香气,微带腥味 26~30
微弱的碘味和干草味,发酵酸香气较弱,腥味较重 20~25
无明显碘味,微弱的干草味,发酵酸香气很弱,腥味很重 <20



质地Texture (35)		 松散均匀,无结块,略带黏性,紧握成团 31~35
松散较均匀,黏性较大或稍有结块,紧握很难成团或紧握成团用力可散开 25~30
质地不均匀,黏性很大或有较多结块,紧握无法成团或成团后无法散开 <25



杂质Impurity (15)		 无霉变、虫蛀或异物 11~15
有少量霉变、虫蛀或异物 5~10
有较多霉变、虫蛀或异物 <5

1.3 数据统计分析

单因素试验结果采用Microsoft 365(Excel)作图,响应面试验结果运用Design-Expert 13.0进行响应面分析,发酵前后海藻饲料中营养成分含量利用SPSS 22.0软件分析差异显著性。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 物料含水量的影响

由图2可知,随着物料含水量的增加,发酵海藻饲料的粗纤维含量呈现先下降后上升的趋势,粗蛋白质含量呈现先上升后下降的趋势。当物料含水量达到50%时,海藻饲料的粗纤维和粗蛋白质含量均达到极值,分别为15.08%和16.38%。因此,确定最佳物料含水量为50%。
图2 物料含水量的影响

Fig.2 Impact of material moisture content

2.1.2 EM复合菌添加量的影响

由图3可知,当EM复合菌添加量低于15%时,随着添加量的增加,发酵海藻饲料的粗纤维含量先下降后升高,粗蛋白质含量先升高后逐渐下降;当EM复合菌接种量为15%时,发酵海藻饲料的粗纤维含量达到最低值(15.34%),粗蛋白质含量达到最高值(16.64%);当添加量超过15%时,随着添加量的继续增加,发酵海藻饲料的粗纤维含量逐渐上升,粗蛋白质含量逐渐下降。因此,确定最佳EM复合菌添加量为15%。
图3 EM复合菌添加量的影响

Fig.3 Impact of EM complex bacteria addition amount

2.1.3 纤维素酶添加量的影响

由图4可知,当纤维素酶添加量小于4%时,随着添加量的增加,发酵海藻饲料的粗纤维含量逐渐下降,粗蛋白质含量逐渐上升;当纤维素酶添加量达到4%时,粗纤维和粗蛋白质含量均达到极值,分别为16.03%和16.65%;当纤维素酶添加量超过4%时,发酵海藻饲料的粗纤维含量随着添加量的增加而逐渐上升,粗蛋白质含量则开始逐渐下降。综合粗纤维和粗蛋白质含量2个指标,确定最佳纤维素酶添加量为4%。
图4 纤维素酶添加量的影响

Fig.4 Impact of cellulase addition amount

2.1.4 发酵温度的影响

由图5可知,随着发酵温度的升高,发酵海藻饲料的粗纤维含量呈先下降后上升趋势,粗蛋白质含量呈先上升后下降趋势;在发酵温度为35 ℃时,发酵海藻饲料的粗纤维和粗蛋白质含量均达到极值,分别为15.23%和16.38%。因此,确定最佳发酵温度为35 ℃。
图5 发酵温度的影响

Fig.5 Impact of fermentation temperature

2.1.5 发酵时间的影响

由图6可知,随着发酵时间的延长,发酵海藻饲料的粗纤维含量呈先下降后上升趋势,粗蛋白质含量呈先上升后下降趋势;在发酵7 d时,发酵海藻饲料的粗纤维和粗蛋白质含量均达到极值,分别为15.78%和16.38%;当发酵时间超过7 d后继续发酵,粗纤维含量开始逐渐上升,粗蛋白质含量开始逐渐下降,发酵效果变差。因此,确定最佳发酵时间为7 d。
图6 发酵时间的影响

Fig.6 Impact of fermentation time

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验结果

结合实际工作需求,本试验重点探究EM复合菌和纤维素酶添加量及其作用温度和时间对海藻饲料发酵工艺的影响,因此在前期单因素试验结果的基础上,选取最佳物料含水量50%,作为响应面试验的基础条件。响应面试验结果如表3所示。
表3 响应面试验结果

Table 3 Results of response surface test

序号
Serial
numbers		 EM复合菌添加量
EM complex
bacteria addition
amount (A)/%		 纤维素酶添加量
Cellulase addition
amount
(B)/%		 发酵温度
Fermentation
temperature
(C)/℃		 发酵时间
Fermentation
time (D)/d		 粗纤维含量
Crude fiber
content
(Y1)/%		 粗蛋白质含量
Crude protein
content
(Y2)/%
1 10 3 35 7 16.71 13.82
2 15 3 40 7 16.66 12.31
3 15 4 35 7 14.92 16.17
4 15 5 35 5 16.30 13.33
5 20 4 30 7 15.98 11.52
6 15 3 30 7 16.51 11.51
7 15 4 40 9 16.27 14.65
8 15 4 35 7 14.62 16.72
9 20 3 35 7 16.01 12.08
10 20 4 35 9 15.28 13.84
11 20 4 35 5 15.93 13.33
12 10 4 35 5 16.07 13.52
13 15 4 35 7 14.74 16.21
14 10 4 35 9 16.29 15.29
15 15 4 30 9 15.78 13.95
16 15 5 40 7 15.97 14.41
17 15 4 35 7 14.41 16.23
18 15 4 35 7 14.82 16.85
19 10 4 30 7 16.52 14.31
20 15 4 40 5 15.88 14.62
21 20 5 35 7 15.83 13.21
22 15 3 35 5 16.22 13.23
23 10 4 40 7 15.97 14.96
24 10 5 35 7 16.11 14.63
25 15 3 35 9 16.05 12.47
26 15 4 30 5 16.95 13.07
27 15 5 30 7 16.80 10.81
28 20 4 40 7 16.24 14.42
29 15 5 35 9 15.84 14.70

2.2.2 回归模型及方差分析

运用Design-Expert 13.0对发酵海藻饲料的粗纤维和粗蛋白质含量的响应面试验结果进行回归拟合,得到的回归方程如下:
Y1=14.7-0.2A-0.109 2B-0.129 2C-0.153 3D+0.105AB+0.202 5AC-0.217 5AD-0.245BC-0.072 5BD+0.39CD+0.592 8A2+0.851 5B2+0.916 5C2+0.582 7D2;
Y2=16.44-0.677 5A+0.472 5B+0.85C+0.316 7D+0.08AB+0.562 5AC-0.315AD+0.7BC+0.532 5BD-0.212 5CD-1.1A2-2.15B2-1.65C2-0.967 6D2。
由方差分析(表4)得知,上述2个回归模型均为极显著(P<0.000 1),且粗纤维含量失拟项P=0.799 7、粗蛋白质含量失拟项P=0.149 5,均不显著,说明粗纤维含量(Y1)、粗蛋白质含量(Y2)的回归方程拟合度均比较好,能够用于试验结果的估算。
表4 回归模型方差分析

Table 4 Regression model variance analysis

项目
Items		 自由度
Degree of
freedom		 粗纤维含量Crude fiber content 粗蛋白质含量Crude protein content
平方和
Sum of
squares		 均方
Mean
square		 F值
F-value		 P值
P-value		 平方和
Sum of
squares		 均方
Mean
square		 F值
F-value		 P值
P-value
模型Model 14 12.050 0 0.861 0 32.860 0 <0.000 1** 66.140 0 4.720 0 18.610 0 < 0.000 1**
A 1 0.480 0 0.480 0 18.320 0 0.000 8** 5.510 0 5.510 0 21.700 0 0.000 4**
B 1 0.143 0 0.143 0 5.460 0 0.034 9* 2.600 0 2.600 0 10.260 0 0.006 4*
C 1 0.200 2 0.200 2 7.640 0 0.015 2* 8.760 0 8.760 0 34.490 0 <0.000 1**
D 1 0.282 1 0.282 1 10.770 0 0.005 5** 1.290 0 1.290 0 5.070 0 0.040 9*
AB 1 0.044 1 0.044 1 1.680 0 0.215 5 0.025 6 0.025 6 0.100 9 0.755 5
AC 1 0.164 0 0.164 0 6.260 0 0.025 4* 1.270 0 1.270 0 4.990 0 0.042 4*
AD 1 0.189 2 0.189 2 7.220 0 0.017 7* 0.396 9 0.396 9 1.560 0 0.231 6
BC 1 0.240 1 0.240 1 9.16 00 0.009 0** 1.960 0 1.960 0 7.720 0 0.014 8*
BD 1 0.021 0 0.021 0 0.802 5 0.385 5 1.220 0 1.220 0 4.810 0 0.045 7*
CD 1 0.608 4 0.608 4 23.220 0 0.000 3** 0.202 5 0.202 5 0.797 8 0.386 8
A2 1 2.280 0 2.280 0 86.990 0 <0.000 1** 7.790 0 7.790 0 30.690 0 < 0.000 1**
B2 1 4.700 0 4.700 0 179.500 0 <0.000 1** 30.220 0 30.220 0 119.060 0 < 0.000 1**
C2 1 5.450 0 5.450 0 207.950 0 <0.000 1** 17.680 0 17.680 0 69.650 0 < 0.000 1**
D2 1 2.200 0 2.200 0 84.070 0 <0.000 1** 6.210 0 6.210 0 24.460 0 0.000 2**
残差
Residual error		 14 0.366 8 0.026 2 3.550 0 0.253 8
失拟项
Missing fit		 10 0.211 9 0.021 2 0.547 3 0.799 7 3.140 0 0.313 7 3.010 0 0.149 5
纯误差
Pure error		 4 0.154 9 0.038 7 0.416 3 0.104 1
总方差
Total variance		 28 12.420 0 69.700 0

“*”代表显著(P<0.05),“**”代表极显著(P<0.01)。

“*” means significant (P<0.05), and “**” means extremely significant (P<0.01).

由表5可知,通过模型可信度分析,粗纤维含量回归方程的决定系数(R2)=0.970 5,调整决定系数( R A d j 2)=0.940 9,即94.09%的试验数据可以用该模型进行分析,即模型中94.09%的粗纤维含量变化来自此试验中的自变量A、B、C、D。结合方差分析,分析其F值,影响发酵海藻饲料粗纤维含量的各因素顺序为EM复合菌添加量(A)>发酵时间(D)>发酵温度(C)>纤维素酶添加量(B)。由P值可知,一次项A、D和二次项BC、CD、A2、B2、C2、D2对粗纤维含量的影响极显著(P<0.01),一次项B、C和二次项AC、AD对粗纤维含量的影响显著(P<0.05),其他项不显著(P>0.05)。粗蛋白质含量回归方程的R2=0.949 0, R A d j 2=0.898 0,即89.8%的试验数据可以用该模型进行分析,即模型中89.8%的发酵海藻饲料的粗蛋白质含量变化来自此试验中的自变量A、B、C、D。通过F值得到影响粗蛋白质含量的各因素顺序为发酵温度(C)>EM复合菌添加量(A)>纤维素酶添加量(B)>发酵时间(D)。由P值可知,一次项A、B、C和二次项A2、B2、C2、D2对粗蛋白质含量的影响极显著(P<0.01),一次项D和二次项AC、BC、BD对粗蛋白质含量的影响显著(P<0.05),其他项不显著(P>0.05)。粗纤维含量的变异系数(CV)=1.02%、粗蛋白质含量的CV=3.60%,说明试验的稳定性较高。粗纤维含量的信噪比(AP)=18.655 6、粗蛋白质含量的AP=13.517 2,均大于4,表明试验结果具有较高的可信度。综合分析,最终得到的粗纤维含量和粗蛋白质含量的2个回归模型其拟合度均比较好,试验结果均具有较高的可信度,能够作为发酵海藻饲料工艺优化的预测模型。
表5 模型可信度分析

Table 5 Model reliability analysis

项目
Items		 标准差
SD		 决定系数
R2		 均值
Mean		 调整决定系数
R A d j 2		 变异系数
CV/%		 信噪比
AP
粗纤维含量Crude fiber content 0.161 9 0.970 5 15.92 0.940 9 1.02 18.655 6
粗蛋白质含量Crude protein content 0.503 8 0.949 0 14.00 0.898 0 3.60 13.517 2
各因素交互作用对粗纤维含量影响的响应曲面和等高线见图7。图7-A显示,EM复合菌添加量与发酵温度的交互作用对发酵海藻饲料粗纤维含量的影响显著(P<0.05),粗纤维含量随着EM复合菌添加量和发酵温度的增加均呈现先升高后下降的趋势;图7-B显示,EM复合菌添加量与发酵时间的交互作用对发酵海藻饲料粗纤维含量的影响显著(P<0.05),粗纤维含量随着EM复合菌添加量和发酵时间的增加均呈现先升高后下降的趋势;图7-C显示,响应面的曲面坡度较陡,纤维素酶添加量与发酵温度的交互作用对发酵海藻饲料粗纤维含量的影响极显著(P<0.01),粗纤维含量随着纤维素酶添加量和发酵温度的增加均呈现先升高后下降的趋势;图7-D显示,发酵温度与发酵时间的交互作用对发酵海藻饲料粗纤维含量的影响极显著(P<0.01)。响应曲面和等高线结果与回归模型方差分析一致。
图7 各因素交互作用对粗纤维含量影响的响应曲面和等高线

A:EM复合菌添加量与发酵温度的交互作用;B:EM复合菌添加量与发酵时间的交互作用;C:纤维素酶添加量与发酵温度的交互作用;D:发酵温度与发酵时间的交互作用。

Fig.7 Response surfaces and contours of interactions of various factors on influence of crude fiber content

A: the interaction effect of EM complex bacteria addition amount and fermentation temperature; B: the interaction effect of EM complex bacteria addition amount and fermentation time; C: the interaction effect of cellulase addition amount and fermentation temperature; D: the interaction effect of fermentation temperature and fermentation time.

各因素交互作用对粗蛋白质含量影响的响应曲面和等高线见图8。图8-A显示,EM复合菌添加量与发酵温度的交互作用对发酵海藻饲料粗蛋白质含量的影响显著(P<0.05),粗蛋白质含量随着EM复合菌添加量和发酵温度的增加均呈现先升高后下降的趋势;图8-B显示,纤维素酶添加量与发酵温度的交互作用对发酵海藻饲料粗蛋白质含量的影响显著(P<0.05),粗蛋白质含量随着纤维素酶添加量和发酵温度的增加均呈现先升高后下降的趋势;图8-C显示,纤维素酶添加量与发酵时间的交互作用对发酵海藻饲料粗蛋白质含量的影响显著(P<0.05),粗蛋白质含量随着纤维素酶添加量和发酵时间的增加均呈现先升高后下降的趋势。响应曲面和等高线结果与回归模型方差分析一致。
图8 各因素交互作用对粗蛋白质含量影响的响应曲面和等高线

A:EM复合菌添加量与发酵温度的交互作用;B:纤维素酶添加量与发酵温度的交互作用;C:纤维素酶添加量与发酵时间的交互作用。

Fig.8 Response surfaces and contours of interactions of various factors on influence of crude protein content

A: the interaction effect of EM complex bacteria addition amount and fermentation temperature; B: the interaction effect of cellulase addition amount and fermentation temperature; C: the interaction effect of cellulase addition amount and fermentation time.

通过响应面软件分析,得到发酵海藻饲料理论预测的最佳发酵工艺条件为:EM复合菌添加量13.834%,纤维素酶添加量4.162%,发酵温度36.111 ℃,发酵时间7.407 d,发酵海藻饲料的粗纤维含量为14.797%,粗蛋白质含量为16.704%。

2.2.3 模型验证

结合实际生产条件,选取EM复合菌添加量14%,纤维素酶添加量4%,发酵温度36 ℃,发酵时间7 d,其他因素不变,在该条件下进行3次平行试验,最终得到发酵海藻饲料的粗纤维含量为14.28%,粗蛋白质含量为16.17%,接近理论预测值,证明此试验模型可以用于优化海藻饲料的发酵工艺。因此,确定海藻残渣制备发酵海藻饲料的最佳工艺为物料含水量50%,EM复合菌添加量14%,纤维素酶添加量4%,发酵温度36 ℃,发酵时间7 d。

2.3 发酵海藻饲料的质量评价

2.3.1 海藻残渣发酵前后营养成分含量

本试验所用发酵原料海藻残渣与发酵后所得的发酵海藻饲料主要营养成分含量如表6所示。海藻残渣经发酵后,粗纤维含量显著降低(P<0.05),粗蛋白质含量显著提高(P<0.05),粗灰分和粗脂肪含量无显著变化(P>0.05);此外,由于添加了水进行发酵,因此水分含量也显著提高(P<0.05)。
表6 海藻残渣发酵前后营养成分含量

Table 6 Nutritional component contents of seaweed residue before and after fermentation%

项目
Items		 粗蛋白质
Crude protein		 粗脂肪
Crude lipid		 粗纤维
Crude fiber		 粗灰分
Crude ash		 水分
Moisture
发酵前Before fermentation 8.78±0.35b 0.47±0.08 27.63±1.57a 47.34±1.44 9.28±0.75b
发酵后After fermentation 16.17±1.28a 0.51±0.11 14.28±0.86b 45.75±1.37 34.65±1.69a

同列数据不同字母表示差异显著(P<0.05)。

In the same column, values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

2.3.2 发酵海藻饲料的微生物指标

发酵海藻饲料的各项微生物指标如表7所示。依据《饲料卫生标准》(GB 13078—2017),发酵海藻饲料的各项微生物指标均符合国家标准的相关规定。
表7 海藻饲料微生物指标

Table 7 Microbiological indexes of seaweed feedCFU/g

项目Items 标准限值Standard limit 检测结果Detection results
总菌Total bacteria <2×106 <1×106
大肠杆菌Escherichia coli 无明确规定 未检出
沙门氏菌Salmonella 不得检出 未检出
志贺氏菌Shigella 无明确规定 未检出
霉菌Mold <2×104 未检出
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 无明确规定 2.68×109

2.3.3 发酵海藻饲料的感官评价

发酵海藻饲料的感官评价结果见表8,外观得17分,气味得26分,质地得32分,杂质得14分,总分为89分。
表8 发酵海藻饲料的感官评价

Table 8 Sensory evaluation of fermented seaweed feed

项目
Items		 要求标准
Requirement standard		 感官品质
Sensory quality		 得分
Score
外观Appearance (20) 与原料相似,呈褐色,颗粒大小适度,
具有饲料应有的形状		 略有变色,颜色稍微变深,
颗粒大小适度,具有饲料应有的形状		 17
气味Smell (30) 有典型的碘味,散发干草味,具有
发酵后的酸香气,微带腥味		 有典型的碘味,散发浓郁的干草味,
有较浓的发酵酸香气,略微带有腥味		 26
质地Texture (35) 松散均匀,无结块,略带黏性,
紧握成团		 结构完好,较松散均匀,有黏性,
紧握后成团		 32
杂质Impurity (15) 无霉变、虫蛀或异物 无霉变、虫蛀,无异物 14
总分Total score (100) 89

3 讨论

3.1 海藻残渣制备发酵海藻饲料工艺的优化

海藻作为极具开发潜力的海洋生物资源,富含多糖、蛋白质、矿物质、萜类化合物、多酚类物质等多种营养成分与生物活性物质。正是由于海藻富含多种营养成分与生物活性物质,其大量被用于提取褐藻胶、碘等成分,产生了大量的海藻残渣,若得不到及时有效的处理,会引发一系列环境问题。当前我国海藻饲料开发仍以粗加工直接投喂为主,由于海藻中含有大量纤维素、海藻胶、琼脂等难以被动物消化的成分,这种粗放式应用方式严重影响动物的采食量与营养消化率,进而降低了海藻饲料的整体利用效率,亟待通过技术创新实现突破[18]。开发发酵海藻饲料不仅能够有效填补我国养殖业新型饲料资源的供给缺口,更可推动行业可持续发展,实现海洋资源的高效利用。
本试验采用EM复合菌与纤维素酶协同发酵海藻残渣制备发酵海藻饲料,可有效提高海藻资源的生物利用率。该技术通过纤维素酶的定向降解作用,能够高效破坏海藻细胞壁中的纤维结构,为微生物发酵创造有利条件;同时,在酶与微生物的协同作用下,发酵底物中蛋白质、活性肽及游离氨基酸等营养成分的含量显著增加。此外,EM复合菌在发酵体系中发挥生物调控功能,通过竞争抑制、代谢产物拮抗等机制优化微生物群落结构,有效抑制有害微生物的增殖,确保发酵过程的安全性和稳定性[19]。
EM复合菌的生长繁殖以及纤维素酶的活性在发酵过程中受多种因素影响。本研究采用单因素试验结合响应面试验,以粗纤维、粗蛋白质含量为核心评价指标,分别探究了物料含水量、EM复合菌添加量、纤维素酶添加量、发酵温度、发酵时间对发酵工艺的影响。
在发酵过程中,当物料含水量较低时,海藻残渣粉容易形成团状,颗粒感较强,不利于纤维素酶的降解和EM复合菌的生长繁殖,导致粗纤维含量较高、粗蛋白质含量较低。随着物料含水量的升高,海藻残渣粉变得黏稠,反应体系具有流通性,能够充分满足纤维素酶和EM复合菌的作用条件。当物料含水量进一步升高到70%时,体系呈半液体状态,含水量较高不利于空气流通,开始抑制菌体繁殖,使发酵不完全,导致粗纤维含量较高、粗蛋白质含量较低[20]。因此,在物料含水量适宜的情况下,物料之间保持多孔性有利于水及空气在物料内部的流通。
当EM复合菌添加量不足时,菌体生长速度较慢,发酵周期较长,无法达到最佳发酵效果,当添加量继续增加,发酵效果提升,当添加量超过一定量时,由于菌体繁殖较快且产生一些不利于自身生长的代谢废物,同时部分菌体自溶,导致发酵效果变差[21]。因此,只有在菌量合适的情况下,才能有效缩短发酵周期,提高发酵饲料产物中的蛋白质含量。
饲料中存在大量天然纤维素,添加纤维素酶能够将其有效降解成可发酵的糖类,同时还破解细胞壁,释放包裹在其中的淀粉、蛋白质等物质,从而提高粗蛋白质含量,提高饲料的营养价值。由单因素试验结果可知,当纤维素酶添加量较少时,纤维素无法充分被降解,因而体系中的粗纤维含量会随着纤维素酶添加量的增加不断下降,粗蛋白质含量会不断上升。然而,当纤维素酶添加量超过一定量时,纤维素酶充分附着在纤维素上,增加酶的用量无法继续降解纤维素而改善发酵效果,反而体系的pH会因纤维素酶添加量的增加而下降,不利于EM复合菌的正常生长和代谢,从而使发酵效果变差[22]。
当温度高于35 ℃时,EM复合菌生长受到抑制,纤维素酶变性失活,导致发酵效果变差[23]。温度较低时,不适宜EM复合菌的发酵,也未达到酶的最适温度,选择适合EM复合菌生长和纤维素酶作用的最佳发酵温度,才能保证二者充分发挥作用,从而提高纤维素的降解率,增加体系内粗蛋白质含量。
随着发酵时间的推移,菌体会随着发酵时间的延长大量繁殖,纤维素酶也会迅速结合底物加速纤维素的分解;但当持续发酵超过一定时间后,发酵体系中的适合菌体作用的底物逐渐减少致使菌体生长速度下降,且部分菌体产生自溶,菌体产生的代谢产物也会抑制其生长,与此同时,纤维素酶已经完全与其对应的底物结合,纤维素的降解也逐渐趋于平缓甚至呈现下降趋势,从而使发酵和降解效果逐渐变差[24]。
单因素试验结果表明,各种因素对发酵底物粗纤维、粗蛋白质含量的影响所呈现的趋势一致,随着体系含水量的增加、菌与酶添加量的增加、发酵温度的升高、发酵时间的延长,发酵底物的粗纤维含量先下降后上升、粗蛋白质含量先上升后下降。
本试验采用响应面法优化了EM复合菌与纤维素酶协同发酵海藻残渣制备发酵海藻饲料的工艺条件,建立了以粗纤维和粗蛋白质含量为核心指标的高效发酵工艺模型。测定结果显示,最佳工艺条件制备的发酵海藻饲料的粗纤维含量降至14.28%,较发酵前降低了48.32%,粗蛋白质含量提升至16.17%,较发酵前提高了84.17%;影响发酵海藻饲料中粗纤维含量的各因素顺序为EM复合菌添加量>发酵时间>发酵温度>纤维素酶添加量;影响发酵海藻饲料中粗蛋白质含量的各因素顺序为发酵温度>EM复合菌添加量>纤维素酶添加量>发酵时间。相关研究佐证了菌酶协同发酵技术的普适性与高效性。Chen等[25]利用菌酶协同发酵小麦秸制备高蛋白质、低纤维的生物饲料,其真蛋白质含量达到9.35%,比未发酵原料提高了4倍。Long等[26]利用贝莱斯芽孢杆菌和纤维素酶协同发酵玉米胚芽粕制备动物饲料,发酵后产品的粗蛋白质和三氯乙酸可溶性蛋白质含量均显著增加,且纤维素的降解率从5.02%提升至50.74%,该研究结果与本试验结果相似。徐畅等[27]研究了多种菌发酵生产玉米蛋白粉饲料,发现影响饲料中可溶性蛋白质含量的因素顺序为发酵温度>含水量>物料比>发酵时间,其中发酵温度对可溶性蛋白质含量的影响最显著,这是由于适宜的发酵温度有利于复合菌快速生长繁殖,从而加速降解多糖类物质,提高蛋白质含量;而发酵时间对饲料中蛋白质的影响效果相对较弱,当发酵进程达到一定时期,微生物代谢活动趋于稳定。该研究结论与本试验中制备发酵海藻饲料的工艺参数的影响规律具有一致性,进一步验证了发酵温度为菌酶协同发酵效果的关键影响因子,为优化发酵饲料工艺提供参考。

3.2 发酵海藻饲料的质量评价

经EM复合菌与纤维素酶协同发酵处理后,海藻残渣的营养价值显著提升,主要表现在粗纤维含量显著降低,粗蛋白质含量显著增加,而粗脂肪和粗灰分含量变化不显著。从作用机制上分析,海藻残渣发酵后粗蛋白质含量提升主要归因于两方面:其一,EM复合菌发酵过程中由于满足自身生长需要优先利用体系中糖类物质,导致干物质减少,从而提高了蛋白质的相对占比;其二,纤维素酶分解破坏纤维素的细胞壁结构,释放被包裹的蛋白质,直接增加了蛋白质含量[28]。相关研究佐证了发酵对饲料营养价值的改善作用。Miksusanti等[29]研究了不同含水量的发酵饲料的营养品质变化,50%含水量发酵的本地原料饲料表现出良好的营养品质,干物质、有机质、粗蛋白质、无氮浸出物和总酸含量显著增加,粗脂肪、粗纤维含量和酸度显著降低。刘郦等[30]采用复合菌发酵玉米芯制备发酵饲料,同样发现发酵饲料中粗蛋白质、酸溶蛋白质含量显著提高,酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维、脂肪含量均显著降低。这些研究结果与本试验中海藻残渣的发酵效果具有一致性,共同验证了发酵技术在改善饲料营养品质方面的有效性。
经EM复合菌与纤维素酶协同发酵处理后,发酵海藻饲料发微生物指标均符合《饲料卫生标准》。具体检测结果显示:发酵海藻饲料菌落总数低于2×106 CFU/g,霉菌数控制在2×104 CFU/g以下,且大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌均未检出,表明发酵过程有效抑制了有害微生物的增殖。此外,作为EM复合菌关键功能菌株的枯草芽孢杆菌,其检测数达到2.68×109 CFU/g,反映出有益微生物在发酵体系中保持较高活性。从作用机制来看,EM复合菌在发酵过程中通过营养竞争、代谢产物抑制等多种方式调控微生物群落结构:其一,快速增殖占据生态位,限制有害菌的生长空间;其二,分泌抗菌肽、有机酸等代谢产物,形成不利于病原菌生存的微环境,从而确保发酵体系的生物安全性与稳定性,为高品质发酵海藻饲料的制备提供了可靠保障;其三,发酵海藻饲料自身具备稳定微生物群落的作用,有助于缓冲细菌结构和功能的波动。相关研究佐证了发酵菌及发酵海藻饲料具备调控微生物群落结构的功能。Liu等[31]利用红藻龙须菜制备海藻饲料,研究水产养殖中沉积物的微生物群落稳定性,研究发现,与普通饲料相比,海藻饲料显著提高了细菌α多样性,增加微生物群落的稳定性,使生态系统更稳定、抗干扰能力更强。
经EM复合菌与纤维素酶协同发酵处理后,发酵海藻饲料获得了良好的感官品质,具体表现为具有明显的发酵酸香气,综合感官评分达到89分,属于优良等级。该结果与同类研究结论具有良好的一致性。Jiang等[32]研究了不同微生物对海参(刺参)发酵饲料的影响,结果发现酵母菌是发酵饲料的最佳菌种,发酵后的饲料具有酸性香气,感官评分在5分制评分体系中获得4分的较高评价;任鑫茹等[33]采用乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母等复合菌发酵玉米秸秆制备动物饲料,同样发现发酵产物具有清香、柔和的酸香味,质地柔软松散,质量综合评分为优级。这些研究从不同发酵底物和微生物体系角度,共同验证了微生物发酵技术在提升饲料感官品质方面的显著效果,进一步支持了本试验中优化的发酵海藻饲料生产工艺的有效性和可靠性。

4 结论

① EM复合菌与纤维素酶协同发酵制备发酵海藻饲料的最佳工艺条件为:EM复合菌添加量14%,纤维素酶添加量4%,发酵温度36 ℃,发酵时间7 d。
② 在最佳发酵工艺条件下进行发酵海藻饲料的生产,得到的产品的粗纤维含量为14.28%,粗蛋白质含量为16.17%。
③ 发酵海藻饲料呈褐色,带有典型碘味,具备浓郁的干草味和发酵后的酸香气,质地松散均匀,略带黏性,紧握成团,枯草芽孢杆菌活性适宜,各项微生物指标符合国家标准。

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