Chinese Journal of Animal Nutrition >

2025 , Vol. 37 >Issue 11: 7984 - 7996

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.649

RESEARCH PAPER

Isolation and Identification, Probiotics Evaluation and Safety Evaluation of Canine-Derived Cholesterol-Reducing Lactobacillus plantarum

  • WU Yi ,
  • ZHAO Mengdi ,
  • ZHANG Yuanyuan ,
  • WANG Yixin ,
  • ZHANG Xiaorui ,
  • ZHANG Yue ,
  • LIANG Shuang ,
  • LI Xinkang ,
  • LI Guangyu , *
Expand
  • College of Animal Science and Technology, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China
*professor, E-mail:

Received date: 2025-04-13

  Online published: 2025-11-14

Fold

Abstract

The objective of this study was to isolate and identify canine-derived canine-derived Lactobacillus plantarum (CLP) with good cholesterol-reducing ability, and to explore their probiotics and safety. The strains were isolated, purified and identified from the feces of Beagle dogs, and the Lactobacillus plantarum was screened out for the determination of bile salt dissociation ability and cholesterol removal rate in vitro, and the canine-derived Lactobacillus plantarum 51 (CLP51) with the best cholesterol-reducing ability in vitro was selected. The probiotics and safety of the CLP51 were explored by biochemical identification, the growth curve, acid production curve, free radical scavenging ability, tolerance, hydrophobicity, self-cohesion, antibacterial property, antibiotics sensitivity and safety were measured. In mice safety test, 48 Kunming white mice were randomly divided into 4 groups (12 mice per group), and they were given 0.2 mL of normal saline (CON group), 1×109 (L group), 1×1010 (M group) and 1×1011 CFU/mL (H group) bacterial solution every day for 28 days. The results showed as follows: 1) the 4 strains of Lactobacillus plantarum were screened out with bile salt dissociation ability, CLP51 had the best performance, and the cholesterol removal rate was 24.34% at 24 h. 2) CLP51 entered the growth stability period after 15 h, and the pH of the bacterial solution was stable at about 3.9 after 18 h. 3) The free radical scavenging rate of CLP51 was higher, the number of viable bacteria was 1.35×108 CFU/mL after 60 ℃ treatment, the survival rate was more than 90% in the environment of pH=3 and different concentrations of bile salts, the survival rates in artificial gastric juice, intestinal juice and gastrointestinal fluid were 41.63%, 100.21% and 46.19%, respectively, and showed high hydrophobic and good self-coagulation, γ-hemolytic, bacterial suspension and cell-free supernatant could inhibit the growth and proliferation of pathogenic bacteria. 4) CLP51 had no significant effects on body weight, average daily gain, average daily feed intake and organ indexes of mice (P>0.05), and the serum glutathione peroxidase activity in H group was significantly higher than that in CON group, L group and M group (P<0.05). In summary, CLP51 has good cholesterol-reducing ability in vitro, probiotics and safety, and can be used as a candidate for canine-derived probiotics.

Key words： canine; probiotics; Lactobacillus plantarum; cholesterol; prebiotics

Cite this article

WU Yi , ZHAO Mengdi , ZHANG Yuanyuan , WANG Yixin , ZHANG Xiaorui , ZHANG Yue , LIANG Shuang , LI Xinkang , LI Guangyu . Isolation and Identification, Probiotics Evaluation and Safety Evaluation of Canine-Derived Cholesterol-Reducing Lactobacillus plantarum[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2025 , 37(11) : 7984 -7996 . DOI: 10.12418/CJAN2025.649

当前宠物在人类生活中的地位越来越重要,人们对宠物的照顾也更加精细,开始更多地聚焦于宠物的饮食及身体健康。一项针对犬的调查研究发现,有29%~34%的犬被归类为肥胖,有5%~8%的犬甚至被诊断为超重,但宠物肥胖问题并未得到宠物主人的重视[1]。超重的犬寿命会缩短,生活质量也会受到影响,骨关节炎、糖尿病、心血管疾病(CVD)和各种肿瘤的发病率也会上升[2]。临床通常使用他汀类药物降低血液中胆固醇含量,但长期使用会对肝脏等器官造成损伤[3-4]。研究发现,普通动物粪便中胆固醇含量比无菌动物多,食用乳酸菌或碳酸盐的婴儿血清中胆固醇含量有所减少,由此推测肠道微生物会对胆固醇的吸收产生一定影响[5]。部分植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),如植物乳杆菌ATCC10012具有胆盐水解酶(bile salt hydrolase,BSH)活性,具有高胆盐水解酶活性的益生菌已被证明能够提高菌株在肠道的胆汁耐受性,具有降低胆固醇、促进心血管健康的作用[6-7]。研究表明,植物乳杆菌可以调节高脂饮食饲喂小鼠的肠道微生物群,导致乙酸和丁酸含量增加,从而调节脂质代谢,并减少肝脏脂质积累[8]。因此,植物乳杆菌可能被用于降低胆固醇、改善肥胖。在犬和猫饮食中使用益生菌可以改善肠道微生物群平衡、调节炎症、增强免疫功能,并防止肠道病原体引起的感染[9]。
因其安全又有益的特性,益生菌在食品等众多行业得到了广泛的研究与应用。益生菌的特性与宿主特异性相关,研究认为从宿主本地微生物群中可以分离出最适的益生菌菌株,因为宿主源的菌株相比其他菌株黏附性更强,在胃肠道内的存活率更高[9-10]。且与他汀类药物长期使用可能导致血清转氨酶活性升高、肝脏中毒等相比,益生菌更加安全且副作用更少[11-12]。目前,宠物益生菌市场广泛,但效果良莠不齐,且宿主源益生菌的使用较少,并不能满足宠物市场的需求。因此,本研究旨在分离具有降胆固醇作用的犬源益生菌,对其进行益生性评价和安全性评价,为宠物宿主源降胆固醇益生菌制剂的制备提供参考和科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物伦理声明

动物试验由青岛农业大学试验动物伦理委员会批准(批准号:DKY20240907)。

1.2 犬源植物乳杆菌(canine-derived Lactobacillus plantarum,CLP)的分离鉴定

样本来自青岛市即墨畜牧实验场的1只成年健康雄性比格犬和2只成年健康雌性比格犬。使用无菌拭子采集直肠粪便后,置于含无菌生理盐水的无菌试管中,低温冷藏运输至实验室,即刻进行梯度稀释涂布,于37 ℃倒置培养24 h。多次分离纯化后获得纯培养物。对纯化菌株进行革兰氏染色和显微镜检,选取革兰氏染色阳性杆菌提取细菌DNA,使用细菌通用引物27F和1492R对所获菌株保守序列进行PCR扩增,扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行纯度检测后,回收凝胶送往北京擎科生物科技有限公司进行16S rRNA测序,测序结果在NCBI网站上进行同源性比对后构建进化树。

1.3 菌株筛选

1.3.1 一级筛选:胆盐解离能力

参考姜金池[13]的方法加以改进,将浓度为0.3%的脱氧牛磺胆酸钠、0.2%的巯基乙酸钠、0.37 g/L的氯化钙和1.5%的琼脂加入到MRS液体培养基中,高温灭菌后倒入平板中,凝固后将无菌圆形滤纸片置于培养基表面,再取经过调节后600 nm处吸光度值相同的菌液10 μL滴在纸片上,37 ℃培养72 h,观察滤纸片周围是否有白色沉淀圈,若有沉淀圈则证明该菌株具有胆盐解离能力。

1.3.2 二级筛选:体外降胆固醇能力

高胆固醇液体培养基(胆固醇含量为0.2 mg/mL)的配制:使用无水乙醇与胆固醇制备10 mg/mL的胆固醇溶液6 mL,再加入0.6 g牛胆盐、0.3 g蔗糖脂肪酸酯和6 mL吐温-80,混匀后加入288 mL MRS肉汤中,121 ℃高压蒸汽灭菌15 min,灭菌后摇匀。
参考孙晓琛等[14]的方法绘制标准曲线,按5%(V/V)接种量将活化好的菌株接种于高胆固醇液体培养基中,37 ℃分别培养0、4、8、12、16、24 h,取1 mL培养液,9 391×g离心10 min后取上清液,采用邻苯二甲醛(P816032-5g,上海麦克林生化科技股份有限公司)法测定上清液中胆固醇含量,并按照以下公式计算胆固醇去除率:
胆固醇去除率(%)=[(A0-A1)/A0]×100。
式中:A0为0 h时上清液中胆固醇含量(mg/mL);A1为培养4、8、12、16、24 h后上清液中胆固醇含量(mg/mL)。

1.4 生长及益生特性测定

1.4.1 生理生化特性鉴定

选取具有胆盐解离能力、体外降胆固醇能力最优的植物乳杆菌,取活化好的菌液使用HBI乳酸菌生化鉴定条(HBIG11,青岛海博生物科技有限公司)进行生理生化特性鉴定。

1.4.2 生长性能和产酸性能测定

取活化好的菌液以5%(V/V)的接种量接种于MRS培养基中,37 ℃恒温培养。分别于0、2、4、6、9、12、15、18、24、30、36 h取样测定培养液600 nm处吸光度值和pH。以时间为横坐标,以培养液的600 nm处吸光度值和pH为纵坐标,分别绘制其产酸曲线和生长曲线。

1.4.3 自由基清除率测定

使用超氧阴离子、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基检测试剂盒(苏州格锐思生物科技有限公司)进行测定,按照说明书操作。

1.4.4 耐高温能力测定

取活化好的菌液分别置于50和60 ℃的温度中水浴处理3 min,冷却后取100 μL菌液梯度稀释后平板涂布计算活菌数,试验重复3次,并按照以下公式计算存活率:
存活率(%)=(A3/A2)×100。
式中:A2为处理前存活细菌的数量(CFU/mL);A3为处理后存活细菌的数量(CFU/mL)。

1.4.5 胃肠道定植能力测定

1.4.5.1 耐酸能力测定

取活化好的菌液于4 ℃、9 391×g离心5 min,使用无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH=7.0)洗涤3次,然后分别在pH为2、3、4的MRS液体培养基中重新悬浮。37 ℃培养0和3 h后取100 μL菌液梯度稀释后平板涂布,37 ℃培养24 h,通过活菌落计数来评估分离菌株对酸的耐受性,试验重复3次。存活率计算公式同1.4.4。

1.4.5.2 耐胆盐能力和人工胃肠液耐受性测定

参考张媛媛等[15]的方法进行测定。取活化好的菌液于4 ℃、9 391×g离心10 min,弃去上清液后用无菌PBS洗涤3次,重新悬浮在受试培养基中。于37 ℃孵育后,采用10倍梯度稀释法将稀释的培养物涂布于MRS琼脂平板上,37 ℃孵育24 h,通过活菌落计数来评估菌株对胆盐和人工胃肠液的耐受性,试验重复3次。存活率计算公式同1.4.4。

1.4.5.3 表面疏水性测定

取活化好的菌液于4 ℃、9 391×g离心10 min,用无菌PBS洗涤3次后,调节菌液630 nm处吸光度值为0.25±0.05,备用。以1∶1的比例将调整好的菌液分别加入到二甲苯、氯仿和二甲苯∶氯仿=1∶1的混合液中,涡旋振荡3 min,37 ℃孵育4 h。吸取水相测量630 nm处吸光度值计算疏水率,试验重复3次。疏水率计算公式如下:
疏水率(%)=(1-A5/A4)×100。
式中:A4为孵育之前菌液的630 nm处吸光度值;A5为孵育之后菌液的630 nm处吸光度值。

1.4.5.4 自凝聚力测定

取活化好的菌液于4 ℃、9 391×g离心10 min,用无菌PBS(pH=7.0)洗涤3次后重悬,测量630 nm处吸光度值,然后涡旋振荡10 s,置于37 ℃孵育8、16和24 h,小心吸取上部测量630 nm处吸光度值,计算自凝聚率,试验重复3次。自凝聚率计算公式如下:
自凝聚率(%)=(1-A7/A6)×100。
式中:A6为孵育之前菌液的630 nm处吸光度值;A7为孵育之后菌液的630 nm处吸光度值。

1.4.5.5 抑菌活性测定

菌株的抑菌活性参考张媛媛等[15]的方法采用牛津杯琼脂扩散法进行测定。供试菌株为大肠杆菌(ATCC25922)、沙门氏菌(ATCC14028)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)和单核细胞增生李斯特菌(ATCC19115)。

1.4.5.6 抗生素敏感性测定

菌株的抗生素敏感性参考张媛媛等[15]的方法采用纸片扩散法进行测定。选择30种抗生素,以直径6 mm的纸片作为抗生素载体进行测试。取活化好的菌液于4 ℃、9 391×g离心10 min,用无菌PBS洗涤3次后重悬,取100 μL菌悬液涂布于MRS琼脂平板上后将抗生素纸片贴于平板表面,于37 ℃恒温培养24 h,观察是否有抑菌圈,并用游标卡尺测量抑菌圈直径。试验重复3次。

1.5 安全性评价

1.5.1 溶血试验

取活化好的菌液在胰酪胨大豆羊血琼脂(TSSB)(HBPM0251,青岛海博生物科技有限公司)上划线,37 ℃培养48 h,观察血琼脂平板是否存在溶血迹象。使用金黄色葡萄球菌(ATCC25923)作为阳性对照。

1.5.2 小鼠安全性试验

为了进行体内安全性评价,将健康、体重接近的昆明系小白鼠48只随机分为4组,每组12只,每组公母各1/2。对照组(CON组)小鼠每日灌服0.2 mL无菌生理盐水,其他3组的小鼠分别每日灌服0.2 mL 1×109(L组)、1×1010(M组)和1×1011(H组)CFU/mL的菌液。每3 d记录1次采食量,每7 d称量1次体重,计算平均日增重(ADG)和平均日采食量(ADFI),并记录小鼠的健康状况。持续28 d后,将小鼠禁食12 h后用1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉。于眼眶静脉丛采血,将血液于4 ℃、2 015×g离心10 min收集血清,测定血清生化指标。将小鼠脱颈处死后,解剖观察其内脏情况,将肝脏、肾脏等器官称重并计算器官指数,计算公式如下:
器官指数(%)=(器官重量/体重)×100。

1.6 统计分析

使用MEGA 11进行进化树构建,使用Excel 2021进行数据记录,使用Graphpad Prism 10.1.2创建结果图,使用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)并通过Duncan氏法进行组间多重比较,试验结果以“平均值±标准差”表示,P<0.05为差异显著,P>0.05为差异不显著。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌分离鉴定结果

经形态学观察、显微镜检,结合16S rRNA测序比对,鉴定出4株植物乳杆菌,分别命名为CLP16、CLP51、CLP115和CLP121,4株植物乳杆菌的系统进化树如图1所示。
图1 4株植物乳杆菌的系统进化树

CLP16:犬源植物乳杆菌16 canine-derived Lactobacillus plantarum 16;CLP51:犬源植物乳杆菌51 canine-derived Lactobacillus plantarum 51;CLP115:犬源植物乳杆菌115 canine-derived Lactobacillus plantarum 115;CLP121:犬源植物乳杆菌121 canine-derived Lactobacillus plantarum 121;Lactobacillus plantarum Sourdough K12:植物乳杆菌酸面团K12;Lactobacillus plantarum 3579:植物乳杆菌3579;Lactobacillus plantarum 5594:植物乳杆菌5594;Lactobacillus garii Fl11369:加里乳杆菌Fl11369。

Fig.1 Phylogenetic tree of 4 strains of Lactobacillus plantarum

2.2 菌株筛选结果

对4株植物乳杆菌进行胆盐解离能力和体外降胆固醇能力测定,结果如图2和表1所示。CLP16、CLP51、CLP115、CLP121周围都有沉淀圈产生,表明4株植物乳杆菌均具有胆盐解离能力。CLP51在4 h时胆固醇去除率显著高于CLP16、CLP115、CLP121(P<0.05)。因此,最终选择胆固醇去除率最优的CLP51进行后续益生特性研究。
图2 4株植物乳杆菌的胆盐解离能力

CLP16:犬源植物乳杆菌16 canine-derived Lactobacillus plantarum 16;CLP51:犬源植物乳杆菌51 canine-derived Lactobacillus plantarum 51;CLP115:犬源植物乳杆菌115 canine-derived Lactobacillus plantarum 115;CLP121:犬源植物乳杆菌121 canine-derived Lactobacillus plantarum 121。

Fig.2 Bile salt dissociation ability of 4 strains of Lactobacillus plantarum

表1 4株植物乳杆菌的胆固醇去除率

Table 1 Cholesterol removal rates of 4 strains of Lactobacillus plantarum%

项目
Items		 菌株Strains P值
P-value
CLP16 CLP51 CLP115 CLP121
4 h 9.70±4.12b 17.94±3.04a 10.34±1.36b 3.01±0.65c <0.001
8 h 20.99±4.87 25.50±8.38 19.42±1.90 19.71±3.82 0.375
12 h 21.57±2.93 23.99±4.05 20.54±1.11 15.53±8.26 0.148
16 h 19.06±3.90 23.09±7.25 22.58±3.21 21.80±3.96 0.658
24 h 18.16±6.94 24.34±5.77 18.06±4.77 14.56±1.85 0.113

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。表5、表8、表9同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as Table 5, Table 8 and Table 9.

2.3 生长及益生特性结果

2.3.1 生理生化特性

如表2所示,CLP51可利用葡萄糖等单糖,蔗糖、麦芽糖、乳糖等双糖,具有运动性,尿素试验呈阳性。
表2 CLP51生理生化特性

Table 2 Physiological and biochemical characteristics of CLP51

项目Items 结果Results 项目Items 结果Results
葡萄糖Glucose + 菊糖Inulin +
乳糖Lactose + 棉子糖Raffinose -
纤维二糖Cellobiose + 硫化氢试验Hydrogen sulfide test +
麦芽糖Galactose + 山梨醇Sorbitol +
蔗糖Salicin + 七叶苷Aesculin +
甘露醇Mannitol + 运动性Motility +
水杨苷Salicin + 吲哚试验Indole test -
触酶试验Catalase test - 氧化酶试验Oxidase test -
硝酸盐还原试验Nitrate reduction test - 明胶液化试验Gelatin liquidized test -
果糖Fructose + 尿素试验Urease test +
甘露糖Mannose + 枸橼酸盐试验Citrate test -

+:阳性反应 positive reaction;-:阴性反应 negative reaction。

2.3.2 生长及产酸能力

如图3所示,生长曲线表明,CLP51在0~3 h处于生长迟缓期,3~15 h处于生长对数期,15 h后进入生长稳定期。产酸曲线表明,pH在3 h内缓慢下降,3 h后下降速率加快,18 h后趋于平缓,稳定在3.9左右。
图3 CLP51生长曲线及产酸曲线

Fig.3 Growth curve and acid production curve of CLP51

2.3.3 自由基清除能力

如表3所示,CLP51对ABTS、DPPH自由基的清除率显著高于对超氧阴离子自由基的清除率(P<0.05)。
表3 CLP51的自由基清除率

Table 3 Free radical scavenging rates of CLP51%

项目Items 自由基清除率Free radical scavenging rate
2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐ABTS 85.43±8.20a
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼DPPH 94.03±1.91a
超氧阴离子Superoxide anion 67.83±6.04b
P值P-value 0.005

同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。表4、表6同。

In the same column values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as Table 4 and Table 6.

2.3.4 CLP51的耐受性

如表4所示,与正常培养条件37 ℃相比,CLP51经过60 ℃高温处理后其存活率为82.29%,即活菌数仍可以达到1.35×108 CFU/mL,具有较好的耐高温能力。
表4 CLP51的耐受性

Table 4 Tolerance of CLP51%

项目Items 存活率Survival rate P值P-value
50 ℃,3 min 102.02±1.32a
<0.001
60 ℃,3 min 82.29±0.60b
pH=2 0c


<0.001
pH=3 99.30±0.28b
pH=4 105.81±3.26a
0.1%胆盐0.1% bile salt 102.77±5.32a


0.019
0.3%胆盐0.3% bile salt 93.99±0.52b
0.5%胆盐0.5% bile salt 93.30±1.34b
人工胃液Artificial gastric juice 41.63±1.53b

<0.001
人工肠液Artificial intestinal juice 100.21±1.29a
人工胃肠液Artificial gastrointestinal fluid 46.19±7.18b
CLP51接种于pH=4的PBS 3 h后,存活率为105.81%,显著高于pH=2和pH=3时(P<0.05)。CLP51接种于pH=3的PBS 3 h后,存活率为99.30%,显著高于pH=2时(P<0.05)。
CLP51在0.1%、0.3%和0.5%胆盐中的存活率分别为102.77%、93.99%和93.30%,在0.1%胆盐中的存活率显著高于0.3%和0.5%胆盐中(P<0.05)。
CLP51在人工胃液、肠液和胃肠液中的存活率分别为41.63%、100.21%和46.19%,即活菌数分别为1.69×106、2.60×1010和5.31×106 CFU/mL,在人工肠液中的存活率显著高于人工胃液和胃肠液中(P<0.05)。

2.3.5 CLP51的表面疏水率和自凝聚率

如表5所示,CLP51在二甲苯∶氯仿=1∶1的混合液中表面疏水率显著高于在二甲苯和氯仿中(P<0.05),在二甲苯、氯仿中的表面疏水率无显著差异(P>0.05),均属于高度疏水。
表5 CLP51表面疏水率和自凝聚率结果

Table 5 Surface hydrophobicity rate and self-coagulation rate of CLP51%

项目
Item		 表面疏水率Surface hydrophobicity rate 自凝聚率Self aggregation rate
二甲苯
Xylene		 氯仿
Chloroform		 二甲苯∶氯仿=1∶1
Xylene∶
chloroform=
1∶1		 P值
P-value		 8 h 16 h 24 h P值
P-value
犬源植物乳杆菌51
CLP51		 65.06±1.98b 62.08±3.77b 79.84±1.39a <0.001 81.57±3.94b 94.63±1.15a 95.53±0.35a 0.001
CLP51在16和24 h的自凝聚率显著高于在8 h(P<0.05),在8、16和24 h的自凝聚率分别为81.57%、94.63%和95.53%,说明CLP51具有良好的自凝聚性。

2.3.6 CLP51的抑菌活性

如图4所示,CLP51的菌悬液和无细胞上清液能够有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌和单核细胞增生李斯特菌的生长增殖,而CLP51的菌体沉淀无抑菌作用。
图4 CLP51的抑菌活性

A:大肠杆菌;B:金黄色葡萄球菌;C:沙门氏菌;D:铜绿假单胞菌;E:单核细胞增生李斯特菌;a:菌悬液;b:无细胞上清液;c:菌体沉淀;d:MRS肉汤。

Fig.4 Antibacterial activity of CLP51

A: Escherichia coli; B: Staphylococcus aureus; C: Salmonella; D: Pseudomonas aeruginosa; E: Listeria monocytogenes; a: bacterial suspension; b: cell-free supernatant; c: bacterial precipitation; d: MRS broth.

如表6所示,CLP51的无细胞上清液的抑菌效果为:单核细胞增生李斯特菌>大肠杆菌>铜绿假单胞菌>沙门氏菌>金黄色葡萄球菌,CLP51的菌悬液的抑菌效果为:单核细胞增生李斯特菌>铜绿假单胞菌>大肠杆菌>沙门氏菌>金黄色葡萄球菌。
表6 CLP51的抑菌试验结果

Table 6 Antibacterial test results of CLP51mm

项目
Items		 抑菌圈直径Diameter of inhibition zone
无细胞上清液
Cell-free supernatant		 菌悬液
Bacterial suspension
大肠杆菌Escherichia coli 19.85±0.79b 20.79±1.78bc
金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus 14.88±0.72d 16.03±0.67d
沙门氏菌Salmonella 17.48±0.30c 17.78±0.21cd
铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 19.74±1.15b 21.78±2.72ab
单核细胞增生李斯特菌Listeria monocytogenes 23.14±0.76a 24.91±2.19a
P值P-value 0.001 <0.001

2.3.7 CLP51的抗生素敏感性

药敏片直径为6 mm,设抑菌圈(透明圈)直径大于7 mm的为具有抑菌性,小于等于7 mm视为无抑菌性。如表7所示,CLP51对克林霉素敏感性强,对氯霉素、亚胺培南、头孢唑林和氟苯尼考等中度敏感,对阿奇霉素、林可霉素、庆大霉素等低度敏感,对万古霉素、多黏菌素B等不敏感。
表7 CLP51抗生素敏感性

Table 7 Antibiotic sensitivity of CLP51

抗生素
Antibiotics		 浓度
Concentrations/
(μg/片)		 结果
Results		 抗生素
Antibiotics		 浓度
Concentrations/
(μg/片)		 结果
Results
青霉素PEN 10 - 阿米卡星AMK 30 +
苯唑西林OX 1 - 庆大霉素GEN 10 +
氨苄西林AMP 10 - 卡那霉素KAN 30 -
哌拉西林PIP 100 - 链霉素S 10 -
头孢氨苄CN 30 - 四环素TET 30 -
头孢唑林CZ 30 ++ 米诺环素MI 30 -
头孢呋辛CXM 30 - 红霉素E 15 ++
头孢他啶CAZ 30 - 阿奇霉素AZI 15 +
头孢曲松CRT 30 + 诺氟沙星NOR 10 -
头孢哌酮CPZ 75 + 环丙沙星CIP 5 -
林可霉素MY 2 + 克林霉素CC 2 +++
万古霉素VAN 30 - 左氧氟沙星LEV 5 +
多黏菌素B PB 300 - 亚胺培南IPM 10 ++
复方新诺明SXT 25 ++ 强力霉素DO 30 +
氯霉素C 30 ++ 氟苯尼考FFC 30 ++

透明圈直径(mm):+++代表23~30 mm;++代表15~22 mm;+代表7~14 mm;-代表没有抑菌圈。

Transparent circle diameter (mm): +++ indicated 23 to 30 mm; ++ indicated 15 to 22 mm; + indicated 7 to 14 mm; - indicated no antibacterial zone.

2.4 CLP51的安全性评价

2.4.1 溶血试验

如图5-A所示,阳性对照的金黄色葡萄球菌表现出β-溶血;如图5-B所示,CLP51表现为γ-溶血(无溶血环),可初步判断CLP51安全,无溶血性。
图5 金黄色葡萄球菌与CLP51溶血试验

Fig.5 Hemolysis test of Staphylococcus aureus and CLP51

2.4.2 小鼠安全性试验

2.4.2.1 CLP51对小鼠生长性能的影响

试验期间未有小鼠死亡,临床观察所有小鼠精神状况良好,摄食、饮水、粪便形态均正常。试验结束后剖检观察其内脏色泽、质地、体积等均未见病变,说明CLP51对小鼠临床应用无毒副作用。如图6所示,各组之间小鼠体重、平均日增重和平均日采食量均无显著差异(P>0.05)。
图6 CLP51对小鼠生长性能的影响

数据柱上标无字母表示差异不显著(P>0.05)。

Fig.6 Effects of CLP51 on growth performance of mice

Value column with no letter mean no significant difference (P>0.05).

2.4.2.2 CLP51对小鼠器官指数的影响

如表8所示,各组之间小鼠各器官指数均无显著差异(P>0.05)。
表8 CLP51对小鼠器官指数的影响

Table 8 Effects of CLP51 on organ indexes of mice %

项目
Items		 组别Groups P值
P-value
CON L M H
心脏Heart 0.59±0.08 0.59±0.11 0.61±0.07 0.63±0.15 0.889
肝脏Liver 4.84±0.42 4.88±0.80 4.32±0.73 4.55±0.58 0.216
脾脏Spleen 0.52±0.19 0.52±0.16 0.47±0.13 0.37±0.47 0.063
肾脏Kidney 1.39±0.06 1.25±0.16 1.30±0.16 1.38±0.23 0.192
胸腺Thymus 0.18±0.06 0.21±0.13 0.19±0.06 0.25±0.10 0.274

2.4.2.3 CLP51对小鼠血清生化指标的影响

如表9所示,H组的血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著高于CON组、L组和M组(P<0.05);各组之间其余血清生化指标无显著差异(P>0.05)。
表9 CLP51对小鼠血清生化指标的影响

Table 9 Effects of CLP51 on serum biochemical indexes of mice

项目
Items		 组别Groups P值
P-value
CON L M H
谷草转氨酶AST/(U/L) 30.58±10.20 34.09±11.37 31.22±7.52 33.52±5.41 0.881
谷丙转氨酶ALT/(U/L) 13.64±8.60 15.13±7.61 9.69±8.40 9.74±6.19 0.528
总抗氧化能力T-AOC/(μmol/mL) 0.62±0.10 0.67±0.09 0.66±0.16 0.61±0.11 0.470
超氧化物歧化酶SOD/(U/mL) 26.61±5.13 29.27±6.72 34.38±6.41 29.95±7.49 0.141
谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px/(U/mL) 291.69±32.22b 291.46±19.80b 294.42±7.55b 331.80±34.59a 0.036
肌酐CRE/(μmol/L) 59.54±6.79 69.47±5.91 62.98±11.01 56.11±8.66 0.066
尿素氮UN/(mmol/L) 8.85±1.24 8.81±1.04 7.97±1.09 8.28±1.57 0.243

3 讨论

3.1 CLP51的体外降胆固醇能力

本研究从成年健康比格犬粪便中分离出1株具有良好降胆固醇能力的CLP51,并进行益生特性和安全性评价,目的是为犬源降胆固醇益生菌的应用提供数据参考。具有胆盐水解酶活性的益生菌可以利用胆盐水解酶将结合胆盐的酰胺键断开,释放出游离的初级胆汁酸,初级胆汁酸不能被很好地吸收,易随粪便排出体外,降低了血液中胆固醇含量,因此是否具有胆盐解离能力已经成为一种初步验证菌株是否具有降胆固醇能力的方法[13]。本试验中,CLP51在具有胆盐解离能力的同时,8 h时胆固醇去除率已达25%,远高于具有良好降胆固醇能力的水貂源植物乳杆菌MDL1118,说明CLP51具有良好的降胆固醇能力[16]。

3.2 CLP51的益生特性和胃肠道耐受性

CLP51的生理生化特性与国标中大部分植物乳杆菌的生化特性相同,与其他植物乳杆菌不同的是,CLP51具有较强的产酸能力,如植物乳杆菌C10在16 h后菌液pH稳定在4.5左右,而CLP51在18 h后菌液pH稳定在3.9左右[17-19]。较强的产酸能力可以让CLP51更加耐受酸性环境,也能够抑制病原菌的生长。自由基是强力的氧化剂,会损害细胞及组织并导致衰老,益生菌的高自由基清除率一定程度上可以减少氧化损伤[21]。与具有良好抗氧化性能的菌株YLGB-1496相比,本研究中CLP51对几种自由基的清除率都较高,说明CLP51具有良好的抗氧化性能[20]。菌株对高温的耐受性决定了菌株在投入生产时是否具有加工优势,CLP51在60 ℃处理后活菌数仍能达到1.35×108 CFU/mL,表明其具有较好的耐高温性能[21]。
菌株对胃肠道的耐受性决定了其能否在胃肠道中定植并发挥作用[22]。本研究中,CLP51对胆盐具有很强的耐受性,可能与其具有胆盐解离能力有关。CLP51对酸性环境和人工胃肠液的耐受性也较好,有助于其在胃肠道中生存,其他关于植物乳杆菌的研究也得出了类似的结果[23-24]。黏膜表面良好的细菌定植是益生菌稳定和连续发挥有益作用的先决条件[25]。菌株的表面疏水性和自凝聚力可以反映其在胃肠道中的定植能力,自凝聚力和疏水性越高,定植能力越好[26]。菌株表面疏水率<20%为非疏水,20%~50%为中度疏水,>50%为高度疏水;菌株自凝聚率16%~35%为低自凝聚力,35%~50%为中自凝聚力,>50%为高自凝聚力[15]。本研究中,CLP51具有高表面疏水率和自凝聚率,说明CLP51具有良好的胃肠道定植能力。
益生菌产生的乳酸、苯乳酸、甲酸和3-羟基脂肪酸是重要的抑菌物质,通过阻断病原菌对肠道上皮细胞的侵染发挥抑菌作用,可以帮助宿主增强免疫力,减少感染[27-28]。本研究中,CLP51的菌液和无细胞上清液对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和单核细胞增生李斯特菌都具有抑菌特性,而菌体沉淀无抑菌特性,推测是CLP51的代谢产物具有抑菌能力。有研究表明,携带有抗生素抗性基因的乳酸菌在进入宿主体内后可能会有基因转移至其他细菌身上,从而产生耐药性[15]。因此,探究菌株对抗生素的敏感性对评估益生菌的安全性非常重要。本研究中,CLP51对克林霉素、氯霉素等抗生素敏感性强,对四环素、庆大霉素、环丙沙星等耐药,这与前人的研究结果[15,29]相似。

3.3 CLP51的安全性评价

菌株的体内外安全性评价可以部分反映菌株是否会对宿主产生危害。溶血试验可以验证菌株是否能导致溶血,具有溶血现象的菌株能够产生溶血素使红细胞溶解,在血平板上形成透明溶血环[18]。CLP51在血琼脂平板上无溶血现象,故可初步判断其安全,无溶血性。
动物的健康状况常用体重、采食量、器官指数和血清生化指标等进行评价。本研究中,小鼠无腹泻和死亡现象,小鼠体重、平均日增重和平均日采食量无显著差异,可初步说明动物健康状况良好,前人的研究中也得出了类似的结果[30]。器官指数通常用来衡量动物的免疫功能,动物染毒染病后,器官重量通常会发生改变,器官指数也会发生变化[31]。本试验中,小鼠的器官指数无显著差异,说明CLP51对小鼠无毒副作用,是安全的,这与前人对植物乳杆菌的研究结果[32-33]类似。动物的血清生化指标可以反映动物的新陈代谢和免疫水平,是评价动物健康情况的重要指标[31]。血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶是常用的肝功能评价指标,肌酐和尿素氮是评价肾脏功能常用的指标。本研究中,CLP51对小鼠的肝脏功能和肾脏功能无显著影响,与张文晓等[34]的研究结果类似。总抗氧化能力、超氧化物歧化酶和GSH-Px是评价抗氧化功能的指标[35-36]。本研究中,H组的血清GSH-Px活性显著高于CON组、L组和M组,与具有抗氧化功能的蜡样芽胞杆菌菌株BC13类似[37],因此推测高剂量CLP51可以提高动物机体抗氧化性能。

4 结论

CLP51具有优秀的体外降胆固醇能力,对多种环境耐受性良好,胃肠道定植能力强,具有良好的抗氧化能力和抑菌效果,对部分抗生素较为敏感,无溶血现象,对小鼠无毒副作用。由此可见,CLP51具有良好的益生特性、安全性和体外降胆固醇能力,可以作为犬源益生菌的候选菌株。

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