槲皮素(quercetin,Que)是一种广泛存在于蔬菜、水果及药用植物中的黄酮醇类化合物,其名称源于拉丁语“quercetum”(意为橡树林),自1857年命名以来沿用至今[1]。槲皮素是一种不含连接糖基的苷元(aglycone),其形态为鲜亮的柠檬黄色针状结晶,该化合物完全不溶于冷水,在热水中溶解性极低,但易溶于乙醇及脂质溶剂[2]。槲皮素的化学名称是3,3',4',5,7-五羟基黄酮(或同义名3,3',4',5,7-五羟基-2-苯基-4H-色烯-4-酮),这意味着槲皮素在3、5、7、3'和4'位上连接了分别1个羟基(-OH)[3]。槲皮素的常见形式有槲皮素糖苷(quercetin glycoside)、槲皮素葡萄糖醛酸苷(quercetin glucuronide)、硫酸槲皮素(quercetin sulfate)和甲基化槲皮素(methylated quercetin)(图1)。当槲皮素苷元上的羟基(通常位于C-3位)被糖基(如葡萄糖、鼠李糖或芸香糖)取代时,即形成槲皮素糖苷。此类糖基修饰可显著改变槲皮素的理化性质,与苷元形式相比,糖苷形式的槲皮素水溶性显著提升,并影响其在生物体内的吸收效率与药效动力学特征[4]。研究发现,槲皮素作为一种重要的黄酮类化合物,具有降低血压[5]、降血脂[6]、降血糖[7]、抗氧化[8]、抗病毒[9]、抗癌[10]、抗炎[11]、抗微生物[12]、神经保护[13]和心脏保护[14]等多种生物活性。作为天然的饲料添加剂,槲皮素在反刍动物生产中也具有良好的应用前景。本文就槲皮素的提取方法、生物活性、对瘤胃发酵的调节作用及其在反刍动物生产中的应用进展进行综述,以期为槲皮素在反刍动物生产中的应用提供参考。
1 槲皮素的提取方法
表1 槲皮素的提取方法Table 1 Extraction methods of quercetin |
| 提取方法 Extraction methods | 原理与特点 Principles and characteristics | 关键参数 Key parameters | 适用性与局限性 Applicability and limitations | 参考文献 References |
|---|---|---|---|---|
| 超高压辅助胶束提取法 Ultrahigh pressure assisted micellar extraction method | 超高压(>100 MPa)破坏 细胞结构,表面活性剂(如 茶皂素)形成胶束增溶 槲皮素,高效环保 | 压力:157 MPa;茶皂素 浓度:8%;料液比:1∶11.5; 提取3次(保压5 min) | 得率84.35%,能耗最低 [0.171 (kW·h/kg)], 碳排放少;设备成本高, 适合工业化绿色生产 | [16] |
| 酶辅助提取法 Enzyme-assisted extraction method | 纤维素酶和果胶酶水解 细胞壁多糖,释放结合态 槲皮素,条件温和 | 复合酶:纤维素酶∶ 果胶酶=3∶1;pH: 4.5~5.0;温度:45~ 50 ℃;时间:2~4 h | 槲皮素转移率>80%,适合 果皮和残渣(葡萄籽、苹果渣); 酶成本高,需优化酶解-超声 协同工艺 | [17] |
| 超声波辅助提取法 Ultrasonic-assisted extraction method | 空化效应破坏细胞壁, 加速溶剂渗透, 缩短提取时间 | 共晶溶剂:胆碱-乳酸 体系;频率:40 kHz; 功率:350 W;时间: 30~60 min | 热敏感原料(鲜桑叶) 首选,节能30%;扩大生产 需解决噪声和均 匀性问题 | [18] |
| 亚临界水提取法 Subcritical water extraction method | 高温(120~200 ℃)高压水替 代有机溶剂,极性可调, 溶解槲皮素苷元 | 温度:150 ℃;压力: 10 MPa;时间:20 min; 料液比:1∶15 | 绿色,无溶剂残留,得率比 乙醇法高40%;高温可能降 解游离槲皮素,需 严格控制参数 | [19] |
| 碱提酸沉法 Alkali extraction and acid precipitation method | 碱性溶解黄酮苷,酸化沉淀 槲皮素;高效但强酸强 碱易破坏结构 | 硼酸保护(0.4%);pH 8~9(碱溶),pH 2~3 (酸沉);芦丁酸解(2% H2SO4,80 ℃,90 min) | 槐米原料最佳(得率 12%~18%),成本低; 杂质多,需二次纯化 (树脂吸附) | [20] |
| 超临界CO2萃取法 Supercritical fluid extraction using CO2 method | 超临界CO2为溶剂,选择 性溶解槲皮素;需乙醇 夹带剂增强极性 | 压力:25~40 MPa; 温度:50~60 ℃;夹带剂: 10%乙醇;时间:60~120 min | 纯度>95%,无溶剂残留; 设备昂贵,适合医药和 化妆品级高纯产品 (紫锥菊提取) | [21] |
| 微波辅助提取法 Microwave-assisted extraction method | 微波辐射使水分汽化 破裂细胞,快速 释放槲皮素 | 功率:300~600 W; 溶剂:70%乙醇; 时间:5~10 min;脉冲模式, 防止局部过热 | 效率最高(分钟级), 适合实验室快速处理; 放大时控温难, 需防降解 | [22] |
2 槲皮素的生物活性
2.1 抗炎
炎症作为机体应对病原体、细胞损伤及化学刺激的复杂防御性生物反应,其核心在于协调多种细胞与介质启动保护性修复过程[23],但过度或失控的炎症反应将导致有害组织损伤。黄酮类化合物凭借调控炎症相关细胞反应及介质合成的能力[24],展现出强效且持久的抗炎特性[25]。代表性黄酮类化合物槲皮素通过多靶点机制发挥广谱抗炎作用,在先天免疫系统中,其显著抑制脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)生成及肺A549上皮细胞白细胞介素-8(IL-8)释放[26],并直接抑制环氧合酶(COX)与脂氧合酶(LOX)活性[27]。针对神经炎症,槲皮素可下调LPS诱导的神经胶质细胞中TNF-α和白细胞介素-1α(IL-1α)mRNA的表达水平,进而抑制小胶质细胞活化诱导的神经元凋亡[28]。分子机制上,槲皮素通过抑制Src/Syk介导的磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)酪氨酸磷酸化,阻断Toll样受体4(TLR4)/髓样分化因子88(MyD88)/PI3K复合物形成,从而遏制LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症级联反应[29]。在过敏反应领域,槲皮素抑制FcεRI介导的人脐带血肥大细胞(hCBMC)中组胺、类胰蛋白酶及促炎细胞因子的释放,该效应与钙内流抑制及蛋白激酶C(PKC)磷酸化调控相关[30]。对于血管内皮保护,槲皮素通过下调过氧化氢(H2O2)刺激的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)和CD80的表达,减轻氧化应激损伤[31]。在适应性免疫调控中,槲皮素显著诱导外周血单核细胞(PBMC)中Th1型干扰素-γ(IFN-γ)表达与分泌,同时抑制Th2型白细胞介素-4(IL-4)产生,流式细胞术证实其提升IFN-γ+细胞比例并降低IL-4+细胞频率,实现Th1/Th2免疫平衡重塑[32]。此外,在组织修复模型中,槲皮素可提升受LPS攻击的肺成纤维细胞的细胞活力、抑制凋亡并降低TNF-α与白细胞介素-6(IL-6)的水平,有效缓解炎症损伤[26]。综上可知,槲皮素通过协同干预TLR4信号转导、炎症酶活性、免疫细胞极化及介质释放等多通路,确立了其作为多靶点抗炎剂的药理学基础。
2.2 抗氧化
槲皮素作为黄酮类化合物,其抗氧化活性通过分子清除、酶系统激活及信号通路调控3级防御体系协同实现[33]。分子机制上,独特的邻苯三酚结构(3',4'-二羟基)赋予了槲皮素强电子供体能力,可直接清除超氧阴离子自由基( ${O}_{2}^{-}$ ·)、羟自由基(·OH)及脂质过氧自由基(LOO·),并通过螯合过渡金属离子(Fe2+/Cu2+)阻断芬顿反应[34],显著抑制脂质过氧化终产物丙二醛(MDA)的生成。在抗氧化防御系统中,槲皮素激活谷胱甘肽还原酶(GR)并增强谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的催化效率,促进氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原再生为还原型谷胱甘肽(GSH),同时协同上调超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性,并抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)与丁酰胆碱酯酶(BChE)的活性,以阻断胆碱能氧化应激[35]。在信号网络调控维度,槲皮素的核心作用呈双向调节范式,一方面,通过修饰Kelch样ECH关联蛋白1(Keap1)半胱氨酸残基促进核因子E2相关因子2(Nrf2)核转位,诱导醌氧化还原酶1(NQO1)、血红素加氧酶-1(HO-1)等Ⅱ相解毒酶表达,并激活磷酸戊糖途径,提升还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)再生能力[36];另一方面,通过抑制核因子-κB(NF-κB)信号轴降低促炎因子释放[37],阻断p38丝裂原活化蛋白激酶/诱导型一氧化氮合酶(p38 MAPK/iNOS)通路,减少活性氮生成,同时调节c-Jun N末端激酶/半胱天冬酶-3(JNK/Caspase-3)级联反应,抑制氧化应激性凋亡[38]。这种从分子清除到酶系统激活再到信号通路的整合机制,使槲皮素在抑制动脉粥样硬化氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)形成、缓解神经退行性疾病β-淀粉样蛋白毒性及改善代谢综合征胰岛素抵抗等病理过程中展现出的显著防治潜力,奠定了其作为天然抗氧化剂在营养干预及药物开发中的核心地位。
2.3 抗菌
槲皮素对多种细菌菌株具有抗菌作用,尤其是影响消化、呼吸、泌尿和皮肤系统的细菌菌株[39]。槲皮素的抗菌能力受溶解度及羟基修饰(如磷酸化、硫酸化)调控,通常革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌、甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌、肠球菌等)对槲皮素的敏感性高于革兰氏阴性菌(如大肠杆菌、铜绿假单胞菌等)[40]。槲皮素最低抑菌浓度(MIC)范围跨度较大(20 μg/mL至8 mg/mL)[41],但部分结构修饰衍生物可显著增强其对革兰氏阴性菌的活性。Pal等[42]研究表明,槲皮素的抗菌机制是通过破坏细胞膜和细胞壁完整性,增加膜通透性导致电解质泄漏、细胞质渗漏及超微结构异常如细胞壁裂解和空化,抑制核酸合成使靶向DNA旋转酶GyrB亚基抑制ATP酶活性及DNA超螺旋功能。槲皮素经铁复合物介导的DNA嵌入裂解[34]及单链DNA结合蛋白(SSB)结合阻断DNA复制[43],在亚抑菌浓度(sub-MIC)下干扰细菌群体感应系统,显著抑制生物膜形成,其机制涉及抑制细菌黏附、运动能力及胞外基质分泌,并下调关键毒力因子的活性及相关基因的表达[44]。另外,槲皮素与美罗培南等抗生素联用能产生协同效应,可显著降低其MIC并增强抗菌效率。
槲皮素不仅具有抗细菌活性,还具有较强的抗真菌活性。研究表明,槲皮素对烟曲霉(MIC:16~64 μmol/L)及黑曲霉具有显著的抗真菌潜力[45]。值得注意的是,槲皮素能有效增敏传统抗真菌药物以克服耐药性感染。Oliveira等[39]报道,槲皮素单用对白色念珠菌和新型隐球菌的抑制活性较弱,但其与两性霉素B联用时可显著增强后者对新型隐球菌的杀伤效力,并可能通过抗氧化机制减轻两性霉素B的毒副作用。Gao等[46]研究表明,槲皮素单用对氟康唑耐药白色念珠菌几乎无杀灭作用,而槲皮素与氟康唑联用则可显著提升细胞死亡率。此外,槲皮素对念珠菌属(包括白色念珠菌)及酿酒酵母[47]亦表现出可量化的抗真菌活性。这些发现凸显了槲皮素作为抗真菌增效剂的临床应用价值。
2.4 抗病毒
槲皮素的抗病毒活性涵盖多个病毒科属。在黄病毒科(Flaviviridae)中,槲皮素通过下调热休克蛋白70(HSP70)及非结构蛋白5A(NS5A)表达,干扰内部核糖体进入位点(IRES)介导的病毒翻译,同时抑制NS3蛋白酶活性[48],并阻断病毒复制依赖的活性氧(ROS)和活性氮(RNS)生成与脂质代谢紊乱。分子对接研究进一步揭示槲皮素通过镁离子配位及残基相互作用靶向抑制非结构蛋白5B(NS5B)RNA聚合酶,且与非结构蛋白2(NS2)蛋白酶呈现高亲和力结合[49]。针对疱疹病毒科(Herpesviridae),槲皮素在亚微摩尔浓度(4.8 μmol/L)下可显著抑制人巨细胞病毒(HCMV)和水痘-带状疱疹病毒(VZV)的裂解基因表达及复制进程,其机制涉及阻断单纯疱疹病毒(HSV)糖蛋白D(gD)与感染细胞蛋白0(ICP0)的合成,从而干扰病毒侵入与早期复制[50],该过程与抑制Toll样受体3(TLR3)介导的NF-κB/干扰素调节因子3(IRF3)炎症通路密切相关,并能拮抗EB病毒(EBV)驱动的B细胞永生化,下调信号转导及转录激活蛋白3(STAT3)信号传导及ROS累积。在正黏病毒科(Orthomyxoviridae)研究中,槲皮素衍生物通过占据病毒RNA聚合酶PB2亚基帽结合域及神经氨酸酶(NA)活性位点,有效抑制流感病毒早期阶段的复制,并降低TNF-α等促炎因子的表达[51]。对于冠状病毒科(Coronaviridae),槲皮素可高效抑制3CL主蛋白酶和木瓜样蛋白酶(PLpro),干扰刺突蛋白(S蛋白)-血管紧张素转换酶2(ACE2)受体界面结合,并与宿主弗林蛋白酶形成稳定复合物[52]。此外,槲皮素对肝炎病毒科(Hepadnaviridae)的乙型肝炎病毒(HBV)表现出显著的抑制效力,可降低乙型肝炎表面抗原和e抗原分泌,并通过氢键网络靶向HBV聚合酶及核心蛋白[53]。在逆转录病毒科(Retroviridae)中,槲皮素通过抑制1型艾滋病病毒(HIV-1)整合酶[半数抑制浓度(IC50)=11.0 μmol/L]与拓扑异构酶Ⅱ活性(IC50=19.4 μmol/L),并激活NF-κB核易位以重启潜伏病毒表达[54],展现抗病毒潜力。对小RNA病毒科(Picornaviridae)的肠道病毒71型(EV71)及柯萨奇病毒(CVB4),槲皮素通过阻断3C蛋白酶功能(IC50=39.63 μg/mL)及抑制病毒内吞作用[55],在感染早期阶段发挥效应,并显著降低体内病毒载量与炎症反应。
综上可知,槲皮素通过干预病毒侵入、复制关键酶功能及调节宿主免疫应答,凸显其作为多机制抗病毒剂的重大应用价值。
3 槲皮素对反刍动物瘤胃发酵的影响
3.1 对瘤胃发酵参数的影响
反刍动物瘤胃发酵过程中,饲粮可发酵成分经微生物分解生成挥发性脂肪酸(VFA)并合成微生物蛋白(MCP)[56],二者分别满足宿主约80%的能量需求与65%~85%的蛋白质需求,构成反刍动物营养代谢的核心基础。然而,高碳水化合物饲粮的快速发酵会诱导瘤胃pH降低,影响发酵动力学及微生物群落平衡,而添加类黄酮、多酚等植物提取物可通过缓冲效应提升瘤胃pH,有效预防酸中毒,尤其对采食易发酵碳水化合物饲粮的反刍动物具有显著保护作用。Xiao等[57]研究表明,在体外瘤胃发酵中,槲皮素显著降低了总产气量和甲烷产量,同时提高了氨态氮(NH3-N)和MCP浓度,并抑制了瘤胃内产甲烷短杆菌的丰度。Oskoueian等[58]通过体外发酵试验发现,底物中槲皮素添加量为4.5%(质量比)时,产气量增加,甲烷产量和原虫数量减少。Cui等[59]报道,在中国荷斯坦奶牛饲粮中添加3.0 mg/kg的芦丁(槲皮素的糖苷前体)时,瘤胃pH降低,NH3-N浓度显著下降,同时伴随原虫数量减少及MCP合成能力提升,总挥发性脂肪酸(TVFA)产量增加,结合血清中尿素氮(UN)水平降低、溶菌酶活性增强,共同证实其通过抑制无效氮循环、促进碳水化合物发酵及强化MCP合成能力,实现瘤胃发酵效率与宿主免疫功能的协同提升。综上所述,槲皮素作为天然饲料添加剂,通过调节瘤胃pH、重塑微生物群落及优化发酵模式,显著提升氮的利用率、驱动甲烷减排,并同步增加丙酸比例与MCP合成。
3.2 对瘤胃微生物的影响
反刍动物瘤胃内的微生物群落通过生物降解与发酵作用,将宿主摄入的饲粮转化为可吸收的营养物质,从而满足宿主动物的核心营养需求。这种微生物与宿主之间形成的协同共生机制,本质上构成一种代谢互惠关系,共同维系反刍系统的生理稳态[60]。瘤胃微生物对槲皮素具有高效降解能力,其代谢过程迅速且产物明确。Berger等[61]通过体外培养试验证实,槲皮素在瘤胃环境中仅需5 h即可被降解90%,主要生成2种特征性代谢产物3,4-二羟基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetic acid)和4-甲基邻苯二酚(4-methylcatechol),其短暂作用机制涉及降解产物的间接调控,如酚酸对特定微生物的抑制或氢代谢干扰。研究表明,槲皮素对变异链球菌、血链球菌、嗜酸乳杆菌和远缘链球菌有抑制效应,暗示其可能通过改变瘤胃微生物群落结构调控瘤胃发酵[62]。值得注意的是,不同微生物类群对槲皮素的代谢途径存在显著差异。例如,梭菌属(Clostridium)细菌可通过裂解碳环结构直接解构槲皮素分子骨架,而其他菌群可能依赖还原或水解等替代途径实现转化。Xiao等[57]研究表明,添加1.5%的槲皮素可显著提高瘤胃中丙酸浓度,促进琥珀酸菌的增殖,同时降低未分类立克次氏体目(norank_f_norank_o_Rickettsiales)及短小杆菌属(Curtobacterium)的相对丰度。由此可见,瘤胃微生物群落结构的改变与代谢功能密切相关,槲皮素或通过抑制非必要代谢途径优化发酵方向,并选择性调控瘤胃微生物群落。
4 槲皮素在反刍动物生产中的应用
4.1 提高生产性能
槲皮素在奶牛饲粮中的应用,展现出了提升产奶性能与改善乳品质的显著潜力。Gohlke等[63]研究发现,在泌乳期奶牛的基础饲粮中添加18 mg/kg槲皮素,可提高泌乳中期奶牛的乳蛋白含量,但对乳脂、乳糖含量无显著影响。这表明槲皮素可能通过调控代谢途径,有效提升了奶牛外周循环血液中的胰岛素水平。研究报道,通过静脉灌注方式提高胰岛素水平,能够直接促进奶牛乳腺组织对氨基酸的摄取与利用效率,从而显著驱动乳蛋白合成[64]。袁天翔[65]报道,饲粮中添加槲皮素不仅能有效增强奶牛机体的免疫功能从而提高其整体抗病能力,还能在提升基础产奶量的同时优化多项乳成分指标,具体表现为乳脂率、乳蛋白率和乳糖率的同步提高。此外,槲皮素还显示出改善氮代谢效率的积极作用,能有效降低牛奶中指示蛋白质利用率的尿素氮含量,并增强奶牛对饲粮中关键营养物质的消化吸收率。由此可知,在奶牛饲粮中添加适量槲皮素,可有效协同提升产奶量、改善乳品质,并增强奶牛整体健康水平。
4.2 改善肉品质
反刍动物肉品质受遗传与非遗传因素共同调控,内在因素涵盖品种、年龄、物种及性别,外在因素包括饲粮结构、气候条件和反刍行为等[66]。其中饲粮结构作为核心外在因素,通过改变胴体形态、理化特性及感官参数(如嫩度、色泽和脂肪酸分布)显著影响肉品特性[67]。肌肉颜色作为肉品质的核心评价指标,主要取决于肌红蛋白含量与化学状态、肌红蛋白亚型构成及肌肉微环境(pH波动与宰后成熟进程)[68]。饲粮中添加槲皮素可改善反刍动物的肉品质。Andrés等[69]在羔羊饲粮中添加0.2%的槲皮素能显著提升肌肉红度(a*)值,优化脂肪酸组成,并抑制脂质过氧化,从而延长货架期,该效应源于槲皮素对肉色稳定性与脂肪氧化的双重调控。值得注意的是,肉中脂肪酸的组成与含量不仅决定肉的感官特性,更与人类慢性疾病风险密切相关,饱和脂肪酸(SFA,如C16∶0)具有致动脉粥样化性,可促进低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)积累,增加心血管疾病风险;而单不饱和脂肪酸(MUFA)与多不饱和脂肪酸(PUFA,尤其ω-3系列PUFA)则通过调节脂代谢对心血管发挥保护作用[70]。因此,通过在饲粮中补充槲皮素优化反刍动物肉中的脂肪酸组成,对提升肉品健康属性具有双重价值。
4.3 其他方面
精液冷冻保存及其人工授精应用是长期保存优质反刍动物遗传物质的关键技术,但冷冻过程会不可逆损伤精子细胞并导致功能障碍。尽管精液冷冻技术已取得显著突破,冻融后精子活力仍平均下降约50%,此功能损失主要源于冻融严苛条件引发的冷冻损伤,其核心机制包括热休克(细胞内外冰晶形成)、细胞脱水及渗透压应激[71]。研究证实,精子冻融过程会触发ROS过量生成,适量ROS虽为精子获能、顶体反应与卵母细胞融合所必需,但冷冻中ROS过度积累将直接导致精子功能异常[72]。水牛精子因质膜中不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸比例接近1∶1(二者占比分别为47.8%和49.8%),且富含多不饱和脂肪酸,因而对脂质过氧化高度敏感,该脂质构成是决定精子活力、运动特性及膜完整性的关键因素。精浆内源性抗氧化物质虽能为精子提供部分保护,精液稀释却显著降低抗氧化效能,故在稀释剂中添加外源抗氧化剂具有必要性。目前多物种已应用维生素E、GSH等典型抗氧化剂,有效拮抗ROS对精子的氧化损伤[73]。El-Khawagah等[74]研究发现,在牛精液稀释剂中添加浓度为10 μmol/L的槲皮素时,可增强精子活力、速度参数和膜完整性,并防止酶流出,显著提高冻融精子的质量。Batool等[75]研究发现,在鹿的精液稀释剂中添加浓度为5 μmol/L的槲皮素可以提高精子的质膜和顶体完整性和活力,显著增加SOD、CAT、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性和总抗氧化能力(T-AOC),同时降低总氧化状态(TOS)和MDA含量,有效抑制ROS的产生,延长冷冻保存时间。
5 小结
槲皮素具有多重生物活性,包括抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒及延长冷冻精液保存期等核心功能;同时,其还能通过调节瘤胃微生物群落提升发酵效率,降低瘤胃酸中毒风险。然而,当前槲皮素应用面临着提取过程中热敏感成分易降解、瘤胃内代谢速率过快、饲粮中添加量缺乏标准等问题。因此,亟需建立槲皮素提取工艺规范、开发槲皮素瘤胃保护剂,并制定槲皮素物种特异性添加量标准,以提升其在反刍动物生产上的转化效率。