反刍动物瘤胃内的微生物在植物纤维的发酵过程中扮演着至关重要的作用。短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)是此过程的关键产物,主要包括乙酸、丙酸和丁酸。一方面,SCFAs参与机体代谢过程,能够满足约70%的能量需求[1]。同时,SCFAs作为众多代谢过程的底物,在乳制品及肉类生产中起着不可或缺的作用。例如,乙酸盐是合成乳脂的必要底物,而丙酸盐参与葡萄糖的生成,葡萄糖又是乳糖合成的必需原料。丙酸盐也是反刍动物肝脏糖异生的主要底物[2]。另一方面,SCFAs通过特定的转运蛋白以及G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs),在免疫系统调节中发挥抗炎作用,进而对肠道健康及生产性能产生积极影响。然而,SCFAs过量积累也会对机体产生负面影响。例如,在采用高精料饲喂模式时,极易诱发亚急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis,SARA)等疾病[3]。因此,如何优化机体内SCFAs的生成过程,充分发挥其在提升健康、生产性能以及免疫调节等方面的积极作用,仍是当前研究的重点[4]。本文将阐述SCFAs在反刍动物体内的作用机制,并简要介绍与SCFAs代谢相关疾病的防控策略,以期为该领域的研究与实践提供理论支撑和参考依据。
1 SCFAs在反刍动物体内的代谢
瘤胃上皮细胞与结肠细胞对SCFAs代谢极强,从瘤胃肠腔进入血液的丙酸中约75%在此代谢,丁酸则高达95%。因丁酸代谢率与代谢优先级均占优势,故成为此处核心代谢物。研究表明,即便乙酸盐浓度高于丁酸盐,上皮细胞仍会优先摄取丁酸盐作为能量来源,故其代谢高度依赖SCFAs,而对糖类或脂类供能的依赖性较低。SCFAs主要通过单羧酸转运蛋白1(monocarboxylate transporter 1,MCT1)和钠-单羧酸转运蛋白1(sodium-coupled monocarboxylate transporter 1,SMCT1)介导的主动运输进入瘤胃上皮细胞和结肠细胞,该过程需消耗能量,以确保细胞在低浓度环境下高效摄取SCFAs。吸收后的SCFAs进入线粒体,经柠檬酸循环或β氧化为细胞供能,其中丁酸的β氧化效率显著高于乙酸和丙酸;部分SCFAs通过被动扩散或与碳酸氢盐(HC ${O}_{3}^{-}$ )交换的方式氧化生成二氧化碳(CO2),以ATP形式释放能量[5]。未被结肠细胞代谢的SCFAs经基底外侧膜进入肝脏门静脉循环,其中丙酸盐作为糖异生底物,通过三羧酸循环转化为葡萄糖,以维持机体血糖稳态;大部分乙酸盐被用于胆固醇、脂肪酸及谷氨酸、谷氨酰胺的生物合成,仅有少量进入体循环[6]。Morrison等[7]的研究进一步证实了SCFAs的组织特异性代谢偏好:上皮优先利用丁酸盐,肝脏优先利用丙酸盐,外周组织则以乙酸盐为主要能源。此外,高精料饲粮通过促进瘤胃丙酸生成,降低乙酸/丙酸比值,驱动瘤胃发酵向丙酸优势型转变。这种代谢模式的重塑不仅会影响能量分配效率,还可通过SCFAs的信号传导功能调控全身代谢稳态[8]。
2 SCFAs的跨细胞转运机制
在机体内,SCFAs存在2种主要的转运机制,分别为H+共转运与Na+偶联转运机制。其中,依赖H+实现转运的蛋白主要包括MCT1和单羧酸转运蛋白4(monocarboxylate transporter 4,MCT4);而依靠Na+偶联的转运蛋白则有SMCT1和钠-单羧酸转运蛋白2(sodium-coupled monocarboxylate transporter 2,SMCT2)。
2.1 H+共转运机制
SCFAs穿越肠道上皮抵达固有层时依赖于特定转运蛋白的协助。研究表明,瘤胃与肠道的单羧酸转运蛋白(monocarboxylate transporters,MCTs)在SCFAs和乳酸的转运过程中起着关键的作用,由此推测肠道上皮表达的SCFAs转运蛋白是其发挥生理效应的关键因素[9-10]。但若转运蛋白异常表达或功能缺陷,就会削弱SCFAs对机体的积极作用,甚至可能诱发溃疡性结肠炎、结肠癌等严重疾病。其中,SCFAs对组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)的抑制作用较为典型。丁酸能够有效抑制HDAC的活性,进而促进组蛋白乙酰化,同时降低组蛋白上的正电荷[11-12]。正电荷的减少会弱化组蛋白与带负电荷DNA的结合作用,促使DNA/染色质结构变得疏松,从而有利于转录因子的结合[13]。从这个角度而言,丁酸对HDAC的抑制作用可以促进基因转录。然而,HDAC抑制剂对特定基因表达的调控主要取决于启动子和染色质的状态,既可能表现为抑制作用,也可能表现为促进作用[14]。例如,抑制HDAC3就能够调节与神经疾病、关节炎、心血管疾病、呼吸道疾病、过敏性疾病以及肾脏疾病相关的炎症分子机制,进而发挥治疗作用[15]。此外,丙酸也是HDAC的抑制剂,其抑制效果与丁酸类似[16-17]。一项利用同位素示踪技术的研究表明,菊粉衍生的SCFAs自身可直接为组蛋白乙酰化提供碳源,进而促进乙酰化进程[18]。
与H+共转运相关的蛋白主要有溶质载体家族16成员1(SLC16A1,即MCT1)和溶质载体家族16成员3(SLC16A3,即MCT4)2种。Kirat等[19-20]证实,MCT1在犊牛和成年绵羊的瘤胃和肠道的顶端膜与基底侧膜上均有表达,是唯一能借助H+梯度转运SCFAs的蛋白,故其SCFAs转运主要依赖于MCT1。另外,MCT1在瘤胃上皮细胞中的表达受昼夜节律的影响,这种与H+协同转运至极性膜另一侧的方式称为“SCFA-/H+共转运”。在基底侧膜上,除MCT1外,还存在MCT4,主要参与基底侧膜的SCFAs转运。Kirat等[21]研究证实,在反刍动物消化道中,MCT4的表达顺序为前胃>大肠>皱胃≥小肠。由于MCTs表达的变化能够反映结肠上皮细胞对丁酸利用率的改变,通过检测MCTs表达水平,可为明确反刍动物疾病的发病机制提供依据。因此,通过调控MCTs的表达改善SCFAs的转运,进而发挥抑制HDAC、调节炎症因子等作用,从而为炎症疾病的治疗提供辅助支持。此外,另一种单羧酸转运蛋白2(monocarboxylate transporter 2,MCT2)在牛瘤胃上皮细胞表面也有表达,但MCT2转运SCFAs的速率低于MCT1[22]。
2.2 Na+偶联转运机制
SMCT1属于溶质载体家族5(SLC5),并被归类为溶质载体家族5成员8(SLC5A8)。它是一种高亲和力、高容量特性的SCFA-/HC ${O}_{3}^{-}$ 逆向转运蛋白[23]。已有研究表明,大鼠和人类肠道对SCFAs的吸收是由SMCT1介导的。而且,SLC5A8在大鼠、人类和牛体内具有高度的蛋白质同源性。基于此,推测该转运蛋白在牛瘤胃内同样发挥作用。有试验结果表明,SMCT1在前胃中的表达水平较高,其中在瘤胃中的表达水平最高;在大肠中的表达水平介于前胃和小肠之间;而在腹腔和小肠中的表达水平则相对较低[24]。此外,SLC5A8对SCFAs具有很强的敏感性,在由SLC5A8介导的SCFAs转运过程中,其米氏常数(Km)处于较低的微摩尔级别范围(50~100 μmol/L)。然而,消化道管腔内的SCFAs浓度比该Km至少高出3个数量级。SLC5A8的SCFAs转运过程虽然始终处于饱和状态,但其转运效率显著低于MCT1。因此,SLC5A8基因的缺失通常不会对机体产生显著影响[10]。除了SMCT1外,电中性转运蛋白SMCT2(SLC5A12)也参与SCFAs的转运,主要在小肠近端表达,在盲肠和结肠中不表达,并且其对底物的亲和力也较低[10]。
除了上述转运蛋白外,在瘤胃中也发现了下调腺瘤(down-regulated in adenoma,DRA,即SLC26A3)、假定阴离子转运蛋白1(putative anion transporter 1,PAT1,即SLC26A6)和阴离子交换蛋白2(anion exchanger 2,AE2,即SLC4A2)等转运蛋白。其中,DRA通过HC ${O}_{3}^{-}$ 交换机制实现物质转运,并与MCT1协同调节HC ${O}_{3}^{-}$ 的跨膜转运,在维持瘤胃pH稳态中发挥关键作用。PAT1的功能与DRA相似。AE2则通过与其他转运蛋白协同作用,维持细胞内外的电中性环境,进而维持瘤胃pH[22]。从瘤胃pH调节机制的角度而言,这些阴离子转运蛋白通过优化离子转运过程,间接提高了SCFA-的吸收率,在维持瘤胃内环境稳态中发挥不可或缺的作用。
3 SCFAs对瘤胃物理屏障的调控作用
3.1 对瘤胃上皮细胞的调控
反刍动物瘤胃主要通过形成以下3种屏障,对机体发挥保护作用[8]。其一,微生物屏障:由瘤胃内寄生的微生物组成。通过与外来病原体竞争养分、分泌抗病原体的物质或降低病原体的毒性,以此间接保护宿主[25-26]。其二,物理屏障:由上皮细胞间的紧密连接组成,发挥物理性保护作用。此屏障受细胞间黏连性分子含量、细胞增殖与凋亡的平衡状态、上皮通透性以及上皮屏障结构的完整性等多种因素的影响[27]。研究表明,SCFAs以及由SCFAs导致的低pH环境均会对瘤胃上皮细胞产生影响,进而可能促进细胞增殖或加剧细胞衰老和脱落[28]。研究证实,补充易发酵碳水化合物或外源补充丁酸盐可提高瘤胃内丁酸盐浓度,促进上皮细胞增殖,同时增加瘤胃的大小和内表面积。另外,丁酸还可增加瘤胃乳头的宽度以及基底层厚度。上述瘤胃物理特性的增强,均有助于瘤胃上皮对营养物质的吸收以及对代谢分子的适应[29]。其三,免疫屏障:主要由肠道相关免疫细胞及其分泌的细胞因子共同组成。
3.2 对瘤胃上皮紧密连接蛋白的调控
紧密连接蛋白在构建瘤胃上皮物理屏障中发挥关键的细胞间相互作用[30]。其主要由整合跨膜蛋白密封蛋白(claudins)和闭合蛋白(occludin),以及连接蛋白闭锁小带蛋白(zonula occludin,ZO)-1、ZO-2和ZO-3组成。其中occludin对于紧密连接屏障功能的维持至关重要,这些紧密连接蛋白协同形成细胞质斑块的支架结构[31]。紧密连接蛋白含量减少会引发肠道通透性增加、跨上皮电阻(transepithelial electrical resistance,TER)值降低,该指标是通过测定电流经上皮细胞层的电阻评估细胞间连接紧密程度,TER值越低表明细胞层紧密连接受损、瘤胃屏障功能越弱。SCFAs对紧密连接蛋白表达的调控机制复杂:SCFAs浓度适度升高且伴随瘤胃pH下降时,通过激活紧密连接、间隙连接及p53信号通路促进紧密连接蛋白表达与组装;而乙酸浓度持续升高、pH进一步降低时,上述通路被抑制,导致紧密连接蛋白表达下调及肠道屏障功能损伤[8]。此外,紧密连接蛋白表达还受应激活化蛋白激酶(Jun N-terminal kinase,JNK)、细胞外调节蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases/mitogen-activated protein kinase,ERK/MAPK)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)等信号通路的协同调控。且同一通路对不同紧密连接蛋白亚型存在显著影响,使SCFAs能精准调控紧密连接蛋白表达。研究证实,高精料饲粮中添加1%丁酸钠可显著提高瘤胃上皮claudin-1、claudin-4、occludin及ZO-1蛋白的表达[32],而补充丁酸钠还能提高瘤胃上皮总抗氧化能力、增强谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性,进一步证实SCFAs对瘤胃上皮屏障的修复作用[29]。综上可知,SCFAs可作为瘤胃上皮生长的刺激剂与功能调节的抗氧化剂,其作用在幼年反刍动物及妊娠期奶山羊中均有体现[33-35]。
4 SCFAs对机体免疫细胞和免疫受体的作用
4.1 对免疫细胞的作用
在正常生理条件下,SCFAs通过减少免疫细胞(如巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞)的募集与迁移,或抑制T细胞和B细胞的分化,对免疫系统和炎症反应起到调节作用。该作用已应用于动脉粥样硬化、败血症等炎症性疾病的研究中[36]。
4.1.1 调节性T细胞(Treg细胞)和效应T细胞(Teff细胞)
SCFAs主要对Treg细胞和Teff细胞产生影响。Treg细胞具备抑制免疫效应细胞活性、预防组织损伤、遏制炎症反应以及免疫耐受等多种功能[39-40]。与之形成鲜明对比的是,Teff细胞通常会加剧体内的炎症反应,二者作用相反。有研究表明,Treg细胞通过限制效应CD4+ T细胞(Teff细胞)的增殖来调节肠道稳态并控制炎症。在Treg细胞和Teff细胞共培养体系中添加SCFAs后,Treg细胞的抑制能力显著增强,有效避免了过度的炎症反应[41]。SCFAs能够发挥上述作用,归因于大部分SCFAs(尤其是丁酸)可通过抑制HDAC活性促进Treg细胞分化,进而防止反刍动物因过度免疫反应对机体造成损伤,甚至有望预防由此引发的癌症等严重疾病[37,42-43]。然而,目前关于SCFAs对HDAC的抑制机制仍存在争议:SCFAs究竟是通过细胞表面的游离脂肪酸受体2(free fatty acid receptor 2,FFAR2)和游离脂肪酸受体3(free fatty acid receptor 3,FFAR3)发挥作用,还是借助转运蛋白直接进入细胞发挥作用,亦或是2种途径协同发挥作用,至今尚无定论。
4.1.2 SCFAs对辅助性T细胞1(T helper cell type 1,Th1)和辅助性T细胞17(T helper cell type 17,Th17)的选择作用
4.2 对免疫受体的作用
脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)或肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)与各自受体结合后,激活MAPK以及核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路,进而影响基因表达。这一过程主要会对炎症细胞因子、趋化因子以及黏附分子,例如细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)等产生影响,而这些因子在心血管疾病的发展进程中扮演着关键角色。SCFAs能够作用于GPCRs,即游离脂肪酸受体(free fatty acid receptors,FFARs),并以剂量依赖性方式激活,从而达到治疗相关疾病的效果,FFAR3还能减少肺部炎症介质IL-4、IL-5以及IL-17A的分泌[46]。SCFAs的主要受体是FFAR2(GPR43)、FFAR3(GPR41)以及GPR109A,它们能够调节多种细胞功能[47-48]。FFAR2和FFAR3在细胞水平上的表达存在差异。FFAR2主要在免疫细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞)表面表达;FFAR3则主要在胰腺、脾脏、脂肪组织以及肠分泌细胞中表达[46]。尽管有研究表明,FFAR3在免疫细胞也有表达,但其表达水平相对较低[49]。此外,碳链长度对FFAR2和FFAR3的激活效果也存在差异。研究表明,激活FFAR2的最佳SCFAs碳链长度为2~3个碳原子,即乙酸和丙酸;而激活FFAR3的最佳碳链长度则为3~5个碳原子,即丙酸、丁酸和戊酸;在此基础上,研究还发现SCFAs对FFAR2的激活顺序为乙酸盐≈丙酸盐>丁酸盐;对FFAR3的激活顺序则为丙酸盐≈丁酸盐>乙酸盐[50]。FFAR2和FFAR3是通过激活不同的G蛋白来发挥作用。其中受影响的蛋白包括:Gαq/11,它可激活磷脂酶C(PLC)通路,促使细胞内钙离子(Ca2+)释放;Gαi/o,它能够抑制腺苷酸环化酶(AC)的活性,减少环磷酸腺苷(cAMP)的水平,从而调控免疫反应。FFAR3主要通过Gαi/o信号通路发挥作用,即减少cAMP的生成,增加Ca2+浓度。这种Ca2+动员能够对代谢和神经信号传导产生影响。此外,FFAR2还参与了由β-arrestins2介导的信号通路,通过抑制NF-κB通路来发挥抗炎作用。例如,促炎细胞因子IL-6和IL-1β的表达会因FFAR2的激活而下调;而在敲除β-arrestin2后,这2种细胞因子的表达则会恢复。目前尚未发现FFAR3参与类似于FFAR2的由β-arrestins2介导的作用现象[51]。
GPR109A也是与SCFAs相关的GPCRs[52]。在针对C57BL/6小鼠开展的试验中,研究发现丁酸能够激活GPR109A,促进结肠巨噬细胞和树突状细胞发挥抗炎作用,也可以诱导Treg细胞增殖以及分泌IL-10的T细胞分化,从而抑制结肠炎症,甚至遏制致癌过程[53]。不过,GPR109A对丁酸的亲和力较低,通常需要较高浓度(如毫摩尔级)的丁酸盐才能激活该受体。其作用机制可能是通过阻断NF-κB信号通路来发挥生物学效应。激活GPR109A还可以抑制TNF-α、IL-6、IL-1β的表达和分泌[54]。这些机制均是缓解动脉粥样硬化疾病恶化的关键途径[55]。然而,值得注意的是,在急性炎症反应状态下,这些受体可能会发挥相反的促炎作用[13]。上述研究成果为反刍动物肠道疾病的治疗提供了新方向,即通过调控SCFAs的水平,或利用其与FFAR2、FFAR3、GPR109A等受体的相互作用发挥抗炎等功效,从而实现治疗疾病。
5 SCFAs与消化道微生物群落之间的联系
5.1 消化道微生物群落在SCFAs生成中的作用
5.2 SCFAs对瘤胃微生物的影响
SCFAs对瘤胃微生物的影响具有两面性且方式多样:一方面,过量SCFAs会重构瘤胃壁微生物群,破坏微生物屏障与物理屏障,同时诱导瘤胃上皮过度表达炎性细胞因子,损伤免疫屏障[61];另一方面,适量SCFAs具有广谱抗菌特性,可强化宿主对病原体的防御。例如,乙酸钠能提高Candidatus Saccharimonas、克里斯滕森菌科R-7类群(Christensenellaceae_R-7_group)及丁酸弧菌属(Butyrivibrio)的相对丰度,且这些细菌与消化系统健康密切相关[29,62]。相较于乙酸和丙酸,丁酸对消化道菌群的影响更为显著,其不仅能富集Incertae sedis属微生物,促进瘤胃中厚壁菌门及产丁酸相关细菌的增殖,还能通过该菌属影响瘤胃氨吸收以强化瘤胃稳态,同时改变沙门氏菌群落结构,降低粪便中大肠杆菌数量,缓解其引发的疾病症状[29,58,63]。因许多微生物为pH依赖型,SCFAs可通过降低瘤胃pH为有益菌提供适宜生存环境并竞争性抑制有害细菌,如促进溶酶体产生以降解和杀死入侵细菌[8]。Wang等[64]研究表明,高谷物饲粮喂养使哺乳期荷斯坦奶牛瘤胃内SCFAs浓度增加,导致pH显著低于低谷物饲粮组,该低pH环境更利于瘤胃液中厌氧微生物(如Prevotella)和革兰氏阴性菌[如拟杆菌属(Bacteroides)]增殖,同时抑制革兰氏阳性菌[如甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)]和毛螺菌科ND3007类群(Lachnospiraceae_ND3007_group)生长。相关研究表明,SCFAs积累和pH降低可能促进寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)相对丰度增加及革兰氏阴性菌产生更多LPS从瘤胃转移至乳腺,这些生理变化是诱发奶牛乳腺炎的重要内源性因素,也解释了SARA为何会同时诱发奶牛乳腺炎症状[65]。
6 基于SCFAs的反刍动物饲养策略促进发育及疾病防控
犊牛出生时前胃尚未发育完全,因此通常不会投喂固体饲料[66]。此阶段犊牛所需的丁酸主要来源于牛乳——牛乳进入皱胃后,经脂肪酶的作用从乳脂中释放出丁酸[67-68]。出生3~4周后,随着前胃开始发育,犊牛逐渐具备主动采食并高效消化固体饲料的能力[69]。此时,若在固体饲料中低水平添加经保护处理的SCFAs,可有效促进断奶前犊牛胃肠道发育[33,70]。另有研究表明,对山羊快速输注丁酸盐可诱导瘤胃上皮增殖,而缓慢输注的效果则不明显[71]。除直接膳食补充外,通过营养调控促进反刍动物自身合成SCFAs,也是促进瘤胃上皮发育增厚的可行途径。例如,采食富含淀粉和碳水化合物的饲料可刺激瘤胃内丁酸的产生,促使瘤胃乳头增长,进而扩大营养吸收面积[72]。相较于其他SCFAs,丁酸在促进瘤胃发育方面的作用更为显著,如向生长阶段山羊的瘤胃直接注入丁酸,可提高其对SCFAs的吸收效率[73]。在实际应用中,丁酸多以丁酸甘油酯的形式补充,因其性质更稳定且便于生产。
在奶牛规模化养殖中,养殖户常通过提高精料配比、降低牧草比例以增加饲粮中非纤维性碳水化合物(non-fiber carbohydrates,NFCs)的含量,旨在提升产奶量或促进奶牛生长。此方法虽能提高瘤胃内SCFAs的浓度,但可能导致瘤胃pH骤降,进而引发SARA[74]。SARA是反刍动物常见的消化系统疾病,其典型特征为瘤胃pH持续处于5.2~5.6,并伴随间歇性腹泻、脱水、瘤胃蠕动减弱、蹄叶炎、肝脓肿及产奶量下降等症状。产犊前后,奶牛的饲粮营养结构会发生剧烈变化——产前以高纤维、低精料饲粮为主,产后则转为高精料、低纤维饲粮,若不能及时适应这种快速转变,极易诱发SARA。数据显示,荷兰地区奶牛SARA的患病率已超过10%;美国19%的初期泌乳奶牛和26%的中期泌乳奶牛受其影响,给畜牧业造成了巨大经济损失[75-76]。由此可见,SCFAs对机体并非绝对有益,其过量积累反而可能引发反刍动物消化系统疾病。
7 小结
综上所述,肠道微生物发酵膳食纤维产生的SCFAs在瘤胃代谢过程中发挥着双重作用:一方面,作为重要的能量底物,通过调控肠道上皮细胞的增殖、激活免疫系统、优化瘤胃微生态结构以及调节转运蛋白或受体,增强肠道屏障功能与整体健康;另一方面,瘤胃内过量积累SCFAs可能扰乱机体代谢平衡,诱发SARA等疾病。因此,维持瘤胃内SCFAs生成与消耗的动态平衡,是保障反刍动物健康生长、实现高效养殖的关键所在。
致谢:
感谢内蒙古师范大学生命科学与技术学院动物营养学课题组全体师生对本论文提出的宝贵意见。