驴奶作为一种高营养价值乳品,因富含乳清蛋白、多不饱和脂肪酸及溶菌酶等活性成分,越来越受到消费者的青睐[1]。乳腺是哺乳动物特有的泌乳器官,其功能核心在于乳腺上皮细胞。作为乳腺组织中实现泌乳功能的核心功能单元,乳腺上皮细胞不仅主导乳源性蛋白、乳脂类物质及乳糖的生物代谢过程,同时在腺体发育动态调控及免疫稳态维持等方面也具有重要调控功能。近年来,乳腺上皮细胞的体外分离培养已成为研究哺乳动物泌乳机制、乳腺疾病模型构建及功能性乳制品开发的重要基础[2-4]。目前,针对奶牛、小鼠等模式动物的乳腺上皮细胞研究已较为成熟,然而对于驴这一特色畜种的乳腺上皮细胞研究仍处于起步阶段,其分离培养体系的建立与鉴定亟待探索。驴乳的独特成分与其乳腺上皮细胞代谢特性密切相关,但因缺乏稳定的体外培养模型,相关分子机制研究受限。相较于反刍动物,驴的乳腺组织结构、泌乳周期与泌乳特点等存在显著差异[5-6],这不仅增加了乳腺上皮细胞体外培养的难度,而且其增殖调控机制尚未明确,需要系统优化培养基成分及培养条件。因此,本试验拟建立驴乳腺上皮细胞的高效分离与培养体系,以期为解析驴的泌乳机制、探究乳腺炎致病机理及调控乳功能性成分合成奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 驴乳腺组织采集
本试验已获得内蒙古农业大学实验动物福利与伦理委员会的许可(批准号:NND2021050)。选用内蒙古呼和浩特市内蒙古草原御驴科技牧业有限公司养殖基地的5岁泌乳中期成年母驴,无菌采集乳腺组织样本,将乳腺组织上的血液和乳汁用生理盐水清洗干净,再放入含有青-链霉素(双抗)的生理盐水(每500 mL含3 mL双抗)中,置于4 ℃冰袋保温的泡沫箱中迅速带回实验室进行后续处理。
1.1.2 主要试剂
胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)溶液、0.25%胰蛋白酶消化液、双抗、磷酸盐缓冲溶液(PBS)和杜氏磷酸盐缓冲溶液(DPBS)购自美国Gibco公司;胶原酶Ⅳ、两性霉素B、表皮生长因子(EGF)、氢化可的松、二甲基亚砜(DMSO)、琼脂糖购自美国Sigma公司;胎牛血清(FBS)购自上海逍鹏公司;Hifair®Ⅱ第1链cDNA合成预混试剂、Hieff® SYBR Green实时荧光定量预混试剂购自上海翌圣生物公司;CCK-8购自上海碧云天生物技术有限公司;6×Loading buffer、DL500 DNA Marker、RNAiso Plus购自宝日医生物技术(北京)有限公司;DMEM基础培养基购自百迪生物科技公司;兔抗细胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK18)、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗体购自美国Proteintech公司;山羊血清、4%多聚甲醛、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和Triton-X 100购自中国北京索莱宝科技有限公司。
1.1.3 主要仪器
生物安全柜(ACB-6A,ESCO,新加坡)、CO2培养箱(Forma-311,Thermo,美国)、离心机(2-16PK,Sigma,美国)、高压灭菌锅(SX-500,TOMY,日本)、凝胶成像系统(Tanon Gis-1000,上海)、倒置显微镜(Leica,德国)、移液枪(Eppendorf,德国)、迷你离心机(D1008,SCILOGEX,美国)、全自动酶标仪(Spark,TECEN,瑞士)、荧光定量PCR仪(LightCycler 480 Ⅱ,Roche,美国)、凝胶电泳仪(Bio-Rad,美国)、超低温冰箱(Forma-8600,Thermo,美国)、荧光倒置显微镜(DS-Ri2,Nikon,日本)。
1.1.4 溶液的配制
完全培养基:取100 mL DMEM基础培养基,依次加入10 mL FBS、2 mL双抗、0.5 mL ITS溶液,随后加入EGF(终浓度10 ng/mL)、两性霉素B(终浓度2.5 μg/mL)和氢化可的松(终浓度1 μg/mL),充分混匀后4 ℃保存。
3×双抗DPBS:每500 mL DPBS中含3 mL双抗。
1×双抗DPBS:每500 mL DPBS中含1 mL双抗。
细胞冻存液:5%DMSO+45%DMEM基础培养基+50%FBS,现用现配。
1.2 试验方法
1.2.1 驴乳腺上皮细胞的原代培养
在无菌条件下去除驴乳腺组织外的筋膜、脂肪及纤维结缔组织,将处理后的组织块放入3×双抗DPBS中;在超净台进行3步清洗(先用3×双抗DPBS漂洗3次,再以75%乙醇浸泡30 s进行表面消毒,最后用1×双抗DPBS漂洗3次);用无菌剪取组织样本中腺泡丰富的部位并转移至5 mL无酶管,机械剪碎至糊状;加入等体积的胶原酶Ⅳ(1 mg/mL)后,37 ℃消化1 h(间隔15 min混匀1次);经80目尼龙滤网过滤后,滤液以222×g离心3 min收集沉淀;所得沉淀经DPBS重悬清洗2次后离心;用完全培养基重悬细胞,接种至透气T25细胞培养瓶,于37 ℃、5% CO2培养箱培养,每48 h更换1次培养基,待贴壁细胞汇合度达80%~90%时,进行传代与纯化操作。
1.2.2 驴乳腺上皮细胞的传代和纯化
乳腺上皮细胞原代培养过程中常伴随成纤维细胞污染,基于两者对胰蛋白酶耐受性差异进行选择性分离。当培养的驴乳腺上皮细胞汇合度达到80%~90%时传代。首先移除原培养基,随后用DPBS轻缓冲洗细胞2~3次;向培养瓶内加入1 mL预温至37 ℃的0.25%的胰蛋白酶溶液,将培养瓶移至37 ℃培养箱中进行消化处理,消化时间控制在30~60 s;细胞消化过程需在显微镜下实时监控,鉴于成纤维细胞对胰蛋白酶更为敏感,当其形态开始变圆并部分脱离瓶壁时(此时驴乳腺上皮细胞仍保持贴壁状态),加入2 mL完全培养基终止消化;弃消化液,用DPBS漂洗细胞2次;用1 mL 0.25%胰蛋白酶进行二次消化,消化时间控制在5 min左右;待80%细胞脱落后加入2 mL完全培养基终止消化;采用移液器轻柔吹打细胞团块直至形成单细胞悬液,转移至新的15 mL离心管进行离心处理;222×g离心3 min后弃上清,所得细胞沉淀经DPBS清洗1次后离心;用完全培养基重悬细胞,计数后以1.5×105 个/mL的密度接种至新的透气T25细胞培养瓶,于37 ℃、5% CO2培养箱培养。如此连续纯化2~3次,可有效清除90%以上的成纤维细胞,最终实现驴乳腺上皮细胞纯度>95%。
1.2.3 驴乳腺上皮细胞的冻存和复苏
传代1~2次后对细胞进行冻存。当细胞汇合度达到80%~90%时,首先弃去原培养基,采用37 ℃预温的DPBS清洗,随后加入1 mL的0.25%胰蛋白酶消化液,置于CO2培养箱中37 ℃孵育;通过倒置显微镜动态观察,当细胞间隙显著增大且边缘回缩时,立即按1∶1体积比加入完全培养基终止酶解反应;采用无菌移液器沿培养面多角度轻柔吹打,获得单细胞悬液后转移至15 mL离心管,222×g离心3 min;弃上清,用1 mL细胞冻存液重悬后转移到2 mL冻存管中,使用程序降温盒逐步降温后转入液氮长期保存。
细胞复苏前,需将恒温水浴锅的温度调节至37 ℃并保持稳定状态;将装有驴乳腺上皮细胞的冻存管从液氮中迅速取出后,立即置于37 ℃水浴锅中轻柔振荡,直至细胞冻存液完全溶解(一般耗时1~2 min);使用移液器将细胞悬液移至15 mL离心管内,沿管壁缓缓加入3 mL完全培养基,轻柔吹打使细胞分散,随后将离心管置于离心机,以222×g离心3min;弃上清,用完全培养基重悬,接种至透气T25细胞培养瓶,于37 ℃、5% CO2培养箱培养。
1.2.4 驴乳腺上皮细胞生长曲线的绘制
将驴乳腺上皮细胞悬液(4×104个/mL)按1 mL/孔接种至10块24孔板;37 ℃、5% CO2培养箱恒温培养60 h;每隔6 h取出1块24孔板,每孔加100 μL CCK-8试剂,37 ℃孵育3 h后,采用酶标仪测定450 nm处吸光度(OD450 nm)值,并根据OD450 nm值绘制生长曲线。
1.2.5 驴乳腺上皮细胞中特异性基因的检测
表1 引物序列Table 1 Primer sequences |
| 基因名称 Gene names | 引物序列 Primer sequences (5'—3') | 产物长度 Product length/bp |
|---|---|---|
| 细胞角蛋白18 CK18 | F:ACCAACTCTGGGTTGACTGT R:CCTCCCTCAGGTTGTTCTC | 295 |
| 磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH | F:GATGCCCCAATGTTTGTGA R:AAGCAGGGATGATGTTCTGG | 250 |
1.2.6 驴乳腺上皮细胞的免疫荧光鉴定
将处于对数生长期的细胞按照4×104个/mL的密度接种到已预先放置细胞爬片的24孔板中。待细胞汇合度达60%~70%时,吸除培养基,PBS漂洗1遍,在4%多聚甲醛(4 ℃)中固定30 min;PBS漂洗3次(5 min/次);取出爬片,吸净边缘水分,置于培养皿支架上,在防水膜上滴加50 μL封闭液(配方:0.5% Trition X-100与PBS等体积混合,添加10%山羊血清),将爬片细胞面朝下覆盖封闭液,室温孵育2 h;弃封闭液,滴加50 μL一抗工作液(一抗∶PBS=1∶100),将爬片转移至湿盒中,4 ℃条件下孵育12~16 h;次日复温后,避光滴加二抗工作液(二抗∶PBS=1∶500),室温孵育2 h;PBS漂洗3次(5 min/次),DAPI染核5 min,再用PBS漂洗3次(5 min/次);完成封片处理后,通过荧光显微成像系统获取图像和数据。
2 结果与分析
2.1 驴乳腺上皮细胞的形态学特征
在原代细胞培养过程中,接种41 h后可见部分细胞贴壁并呈放射状生长,形成孤立的岛屿状细胞集落,此时细胞形态不规则(图1-a);接种64 h后细胞集落逐渐扩大并相互融合,形态转变为典型的上皮样多角形,呈现铺路石样排列(图1-b);接种85 h后细胞铺满培养瓶底,形成单层、紧密镶嵌的铺路石样结构,细胞形态饱满(图1-c)。当细胞汇合度达80%时进行传代,未纯化的F1代驴乳腺上皮细胞中可见成纤维细胞混杂生长(图1-d),通过简单纯化处理后,可获得纯度较高的细胞,细胞形态以多角形或卵圆形为主,少数呈短梭形,细胞间连接紧密且边界清晰,胞质较为丰富(图1-e)。细胞冻存60 d后复苏,其形态与冻存前无明显区别(图1-f)。
图1 驴乳腺上皮细胞的形态学特征a:接种41 h后的岛屿状细胞集落;b:接种64 h后细胞集落扩大、融合;c:接种85 h后细胞逐渐铺满培养瓶;d:未纯化的F1代驴乳腺上皮细胞中混杂着成纤维细胞;e:纯化后的驴乳腺上皮细胞以多角形为主,偶见短梭形;f:冻存后复苏的驴乳腺上皮细胞。 Fig.1 Morphological characteristics of donkey mammary epithelial cells (100×) a: island-like cell colonies at 41 h-post inoculation; b: cell colonies had expanded and fused at 64 h post- inoculation; c: the cells progressively covered the culture flask at 85 h post-inoculation; d: unpurified F1-generation donkey mammary epithelial cells were co-cultured with fibroblast cells; e: the purified donkey mammary epithelial cells mainly polygonal with rare spindle forms; f: thawed donkey mammary epithelial cells after cryopreservation. |
2.2 驴乳腺上皮细胞的生长曲线
如图2所示,驴乳腺上皮细胞的生长曲线呈现典型“S”型。在0~18 h的初始培养阶段,细胞处于生长迟滞期,增殖速率较低;随后进入18~42 h的指数生长期,细胞分裂明显加快;培养至42~60 h后达到生长平台期,增殖速率逐渐下降。这些结果表明在本试验培养条件下获得的驴乳腺上皮细胞具有理想的生长特性。
2.3 驴乳腺上皮细胞中特异性基因表达
如图3所示,特异性基因CK18在体外分离培养的细胞中特异性表达,表明其为驴乳腺上皮细胞。
2.4 驴乳腺上皮细胞的免疫荧光染色
3 讨论
驴乳腺上皮细胞的体外分离与培养是解析驴的泌乳调控机制、乳腺生理功能及乳成分生物合成途径的关键技术基础。在现有的乳腺上皮细胞分离技术中,组织块法与酶消化法各具优势[8],其中酶消化法因技术成熟、操作便捷而最为常用。该方法的原理是通过特定消化酶(如胶原酶、胰蛋白酶等)单用或联用对剪碎的乳腺组织进行温和解离,可高效分离出活性高、分散性良好的目标细胞。尽管酶消化法在细胞获取效率上具有显著优势,但其核心环节消化酶种类筛选、酶作用浓度优化及消化时长控制需精准调控。若酶活性过高或消化时间超限,易导致细胞膜完整性受损,显著降低细胞的存活率与功能状态。多位学者采用不同的酶消化方案均成功分离出了高活性的乳腺上皮细胞,例如,李晓斌等[7]利用0.1%胶原酶Ⅰ联合0.01%透明质酸酶对马乳腺组织进行5 h的消化;孙培皓等[9]利用0.05%胶原酶Ⅰ与0.05%透明质等配比混合对奶牛乳腺组织进行7~9 h的消化;郝颖等[10]利用0.5%胶原酶Ⅱ对奶牛乳腺组织进行1 h的消化。本研究基于驴乳腺组织特异性(如基质致密性、细胞黏附因子表达差异),在参考上述方法的基础上进行优化:选用1 mg/mL的胶原酶Ⅳ(其酶切位点更温和,可减少细胞膜损伤风险)替代传统胶原酶Ⅰ/Ⅱ对驴乳腺组织进行消化,消化时间为1 h,成功分离出驴乳腺上皮细胞。
本研究在细胞汇合度达到80%时,采用胰蛋白酶消化法进行细胞传代。参照曹家铭等[11]的差时消化法,利用成纤维细胞(1~2 min)和乳腺上皮细胞(5 min)对胰蛋白酶敏感性差异进行细胞分离,成功获得较高纯度的驴乳腺上皮细胞,该细胞12 h内贴壁率超过85%,18 h进入对数生长期。本研究发现,分离的驴乳腺上皮细胞的原代细胞在培养初期增殖速率通常较为缓慢,2~4 d可达到融合状态并适宜传代;传代后的细胞进入对数生长期,增殖速率显著提升,其增殖过程符合典型的细胞生长曲线特征,约48 h即可达到80%~90%的汇合度。
乳腺上皮细胞的鉴定主要涉及两大方面:一是通过形态学特征和生长特性(如生长曲线)进行初步判断;二是借助分子生物学手段(如基因检测和免疫荧光标记)进行特异性验证[7,12]。乳腺上皮细胞通常呈现多角形形态,常以岛屿状或铺路石状排列[13]。在本研究建立的培养体系中,分离获得的驴乳腺上皮细胞表现出典型的乳腺上皮细胞形态学特征,并呈现集落样生长模式;生长动力学分析显示,细胞增殖呈现典型的“S”型曲线,表明其保持了正常的细胞周期特征。这一生长特性与在奶牛乳腺上皮细胞[9]和绵羊乳腺上皮细胞[14]上的报道一致。形态学观察是鉴定乳腺上皮细胞的常用方法之一,但单纯依靠该方法评估细胞可靠性存在一定局限性,且无法检测细胞纯度[2],因此本研究对分离培养的驴乳腺上皮细胞进一步开展分子生物学验证。作为上皮细胞鉴定的重要分子标志物,中间纤维蛋白CK18在细胞骨架形成中发挥关键作用,已被广泛应用于多种哺乳动物乳腺上皮细胞的鉴定研究[15-16]。本研究通过琼脂糖凝胶电泳证实,分离培养的驴乳腺上皮细胞中可稳定表达上皮细胞特征性基因CK18。免疫荧光染色结果进一步显示,CK18蛋白在分离培养的驴乳腺上皮细胞中呈现阳性定位特征。综合上述鉴定结果,本研究成功建立了高纯度的驴乳腺上皮细胞分离培养方法,可为后续开展相关试验提供可靠的细胞来源。
4 结论
本研究采用酶消化法有效实现了驴乳腺上皮细胞的体外分离和培养。通过多角度包括细胞形态观察、生长动力学分析、特异性基因检测及免疫荧光染色等验证,证实了所获细胞的可靠性,可为后续驴乳成分调控机制探索和乳腺炎模型建立提供重要的细胞材料。