Chinese Journal of Animal Nutrition >

2025 , Vol. 37 >Issue 12: 8785 - 8800

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2025.715

RESEARCH PAPER

Isolation and Identification, in Vitro Probiotic Properties and Safety Evaluation of Bacillus from Kunming Dogs

  • CHEN Guo , 1 ,
  • WU Qianyu 1 ,
  • LIU Chen 1 ,
  • LI Jiqin 1 ,
  • CHEN Shiyu 1 ,
  • LIN Qiuye 2 ,
  • MAO Aiguo 3 ,
  • LI Jie 3 ,
  • XU Le , 1, 4, ** ,
  • CAO Zhenhui , 1, 4, **
Expand
  • 1 College of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China
  • 2 College of Ethnic Medicine, Yunnan Minzu University, Kunming 650504, China
  • 3 Kunming Police Dog Base, Ministry of Public Security, Kunming 650204, China
  • 4 Yunnan Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science, Kunming 650201, China
** XU Le, lecturer, E-mail: ;
CAO Zhenhui, professor, E-mail:

* Contributed equally

Received date: 2025-05-16

  Online published: 2025-12-13

Fold

Abstract

This study aimed to screen and identify high-quality Bacillus strains derived from Kunming dogs to provide microbial resources and a theoretical foundation for the development of novel probiotic formulations for canines. Fresh fecal samples from the Langqing and Caohuang canine strains at the Kunming Police Dog Base of the Ministry of Public Security were collected, and bacterial strains were isolated and purified using TSB and TSA medium. Their simulated gastrointestinal tolerance, antibiotic susceptibility, antibacterial activity, intestinal adhesion capacity, and anti-inflammatory potential were evaluated to comprehensively assess their probiotic properties. Bacillus strains with favorable probiotic properties were identified by 16S rDNA sequencing, and the safety of the strain was evaluated through an acute oral toxicity test in mice. Twelve 6-week-old SPF-grade Kunming mice were selected, randomly divided into a control group and an experimental group according to the principle of half male and half female with similar body weights, 6 mice per group, housed in single cages. Mice in the control group were gavaged with 200 μL of normal saline daily, while those in the experimental group were gavaged with 200 μL of the screened strain E2 bacterial solution (2×108 CFU/mL) once a day for 7 consecutive days to evaluate the safety of the strain. The results showed that a total of 23 Bacillus strains were isolated from the fresh feces of Kunming dogs. Through comprehensive evaluation of their simulated gastrointestinal tolerance, antibiotic susceptibility, and antibacterial activity, five strains (A3, B7, B10, E2 and E5) with probiotic potential were selected for evaluation of intestinal adhesion capacity and anti-inflammatory effects. Among them, strains B10 and E2 exhibited strong adhesion to HT-29 cells, and strain E2 significantly suppressed the expression of interleukin-8 (IL-8) gene in LPS-induced HT-29 cells (P<0.01). Phylogenetic analysis based on 16S rDNA sequences identified strain E2 as Bacillus velezensis. The strain E2 was selected for an acute oral toxicity test in mice. The results indicated that, compared with the control group, gavage of strain E2 had no significant negative effects on the average daily weight gain or average daily feed intake of the mice (P>0.05). Necropsy showed no pathological changes in mouse organs, no significant differences in organ indexes (P>0.05). Furthermore, the mucosal structures of the jejunum and ileum remained intact. In conclusion, Bacillus velezensis E2 demonstrates excellent probiotic properties and safety, providing a foundation for developing specialized microecological preparations for police dogs.

Key words： Kunming dog; Bacillus; isolation and identification; probiotic properties; safety

Cite this article

CHEN Guo , WU Qianyu , LIU Chen , LI Jiqin , CHEN Shiyu , LIN Qiuye , MAO Aiguo , LI Jie , XU Le , CAO Zhenhui . Isolation and Identification, in Vitro Probiotic Properties and Safety Evaluation of Bacillus from Kunming Dogs[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2025 , 37(12) : 8785 -8800 . DOI: 10.12418/CJAN2025.715

益生菌作为一类安全、绿色的微生物制剂,在促进宿主生长和健康方面发挥着重要作用,被认为是提高动物生产性能的优良饲料添加剂之一[1]。常用益生菌包括芽孢杆菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、酵母菌属、肠球菌属以及片球菌属等[2]。芽孢杆菌是指能形成芽孢的一类革兰氏阳性菌,在多种极端环境中均具有较强的耐受能力[3]。同时,芽孢杆菌可分泌大量消化酶促进机体生长,产生多种抑菌活性物质抑制病原体繁殖,从而增强动物的免疫调节能力,还可改善肠道菌群结构,促进肠道健康[4-5]。
昆明犬是我国公安部昆明警犬基地自主培育的国产工作犬,具有嗅觉灵敏、易于训练、适应性强以及扑咬凶猛等警用性能[6],在护卫搜捕、消防搜救及反恐等任务中发挥重要作用[7],被广泛用于刑事侦查、治安防范、缉毒、消防救援以及检验检疫等工作领域[8]。研究发现,将1‰和2‰纳豆芽孢杆菌分别添加于拉布拉多仔犬饲粮中,均可降低犬肠道大肠杆菌数量,并增加乳酸菌数量[9];在边境牧羊犬饲粮中添加1×1010 CFU/g枯草芽孢杆菌C-3102可提升机体免疫功能且无毒副作用[10]。犬用微生态制剂的有益作用主要体现在防治腹泻、提高仔犬生长性能、增强机体免疫能力以及抗氧化能力等方面[11]。研究发现,益生菌对上皮细胞的黏附具有宿主特异性,相较于外源益生菌,犬源益生菌更易定植于犬肠道并表达其生物活性,进而有效促进肠道健康,增强免疫稳态调节[12]。基于此,本研究从昆明犬粪便中分离芽孢杆菌并进行益生特性及安全性研究,以期为促进昆明犬肠道健康、提升警用性能专用微生态制剂的研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌种与细胞系

福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)CMCC(B)51572、大肠杆菌(Escherichia coli) CMCC44825和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 49521均为本课题组保藏菌种。肠上皮细胞HT-29人IECs(编号:KCB200508YJ)由中国科学院昆明动物研究所赠与。

1.1.2 主要试剂与仪器

主要试剂:TSA培养基、TSB培养基和LB培养基购自广东环凯生物科技有限公司,生化管购自杭州滨和微生物试剂有限公司,革兰氏染液(目录号:D008-1-2)购自南京建成生物工程研究所,芽孢染色试剂盒(目录号:G1132)购自北京索莱宝科技有限公司,总RNA提取试剂盒(目录号:DP419)、DNA提取试剂盒(目录号:DP302)、反转录试剂盒(目录号:KR116)以及荧光定量试剂盒(目录号:FP205)购自天根生化科技有限公司。
主要仪器:pH计(PHSJ-5T)购自雷磁-上海仪电科学仪器股份有限公司,荧光定量PCR仪(CFX Connect)购自美国BIO-RAD公司,低温高速冷冻离心机(ST-16R)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司,涡旋混合器(MX-S)购自美国SciLogex公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集

样品采自公安部昆明警犬基地狼青品系9667号犬和9654号犬;草黄品系2140号犬、7830号犬以及1958号犬的新鲜粪便,将粪便样品装入含30%无菌甘油的离心管中,-80 ℃保存备用。

1.2.2 菌株的分离纯化

在无菌条件下取1 g粪便至9 mL生理盐水中混合均匀,85 ℃水浴加热15 min后,取1 mL水浴后悬液用生理盐水进行10倍梯度稀释(10-5~10-8),并按1%的比例添加到TSB液体培养基中,37 ℃、150 r/min振荡培养16 h,将培养液梯度稀释后涂布于TSA平板上,37 ℃培养24 h,挑取形态不同的单菌落于TSB液体培养基中培养,重复以上操作3次,获得纯化菌株并保存备用。

1.2.3 革兰氏染色、芽孢染色及生理生化鉴定

挑取单菌落于载玻片上,进行革兰氏染色和芽孢染色,在光学显微镜下观察菌株的颜色和形态。将活化后的菌株接种于TSA平板,37 ℃培养24 h后,挑取单菌落分别接种于V-P试验管、明胶液化管、7%氯化钠耐受管、硝酸盐还原管、淀粉水解管、丙酸盐利用管、D-木糖发酵管、L-阿拉伯糖发酵管和D-甘露醇发酵管等9种生化鉴定管中。密封后的鉴定条置于37 ℃培养18~24 h后取出放置于白色比色卡上,通过比色法判读各项生化反应结果,并记录反应特征,结果与《伯杰氏细菌手册》[13]和《常见细菌系统鉴定手册》[14]进行比对。

1.2.4 菌株的益生特性研究

1.2.4.1 模拟胃液、肠液耐受试验

分别参照蒋佳璇等[15]和龙仲敏[16]的方法进行模拟胃液、肠液耐受试验。将芽孢杆菌接种至模拟胃液(pH=2.0)和模拟肠液(pH=8.0)中,37 ℃振荡培养0和3 h,取1 mL菌悬液逐级稀释,进行平板计数,计算存活率,计算公式如下:
存活率(%)=(3 h活菌数/0 h活菌数)×100。
模拟胃液配制:将0.3 g胃蛋白酶溶于100 mL 0.2%生理盐水,用1 mol/L HCl调节pH至2.0,经0.22 μm滤膜过滤除菌后4 ℃保存。
模拟肠液配制:将0.1 g胰蛋白酶、1.8 g胆盐、1.1 g NaHCO3和0.2 g NaCl溶于100 mL无菌水,用1 mol/L NaOH调节pH至8.0,经0.22 μm滤膜过滤除菌后4 ℃保存。

1.2.4.2 抗生素敏感性试验

采用微量肉汤稀释法检测芽孢杆菌对常用抗生素的最低抑菌浓度(MIC),MIC检测方法参照临床和实验室标准协会(CLSI)发布的抗生素敏感性检测执行标准[17],判断标准见表1。
表1 试验用抗生素的种类及药敏试验结果判断标准

Table 1 Types of antibiotics used in tests and interpretation criteria for antimicrobial susceptibility testing results

抗菌药物
Antibacterial agents		 最低抑菌浓度MIC/(μg/mL)
敏感Susceptible (S) 中度敏感Intermediate (I) 耐药Resistance (R)
青霉素G Penicillin G ≤0.12 - ≥0.25
氨苄西林Ampicillin ≤0.25 - ≥0.5
亚胺培南Imipenem ≤4 8 ≥16
美罗培南Meropenem ≤4 8 ≥16
万古霉素Vancomycin ≤4 - -
阿米卡星Amikacin ≤16 32 ≥64
庆大霉素Gentamicin ≤4 8 ≥16
红霉素Erythromycin ≤0.5 1~4 ≥8
克林霉素Clindamycin ≤0.5 1~2 ≥4
四环素Tetracycline ≤4 8 ≥16
环丙沙星Ciprofloxacin ≤1 2 ≥4
左氧氟沙星Levofloxacin ≤2 4 ≥8
甲氧苄啶Trimethoprim ≤2~38 - ≥4~76
氯霉素Chloramphenicol ≤8 16 ≥32
利福平Rifampicin ≤1 2 ≥4

“-”表示无对应最低抑菌浓度数值或范围。

The “-” indicates the absence of a corresponding minimum inhibitory concentration value or range.

1.2.4.3 对主要肠道致病菌的抑制试验

采用牛津杯打孔扩散法[18],研究菌株的无菌上清液对大肠杆菌CMCC44825、福氏志贺氏菌CMCC(B)51572和金黄色葡萄球菌ATCC 49521的抑制作用,并设置无菌TSB培养基作为阴性对照。所有平板置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h后,使用游标卡尺测量抑菌圈直径,试验独立重复3次。

1.2.4.4 肠上皮细胞黏附试验

参照Fonseca等[19]的试验方法对具有良好胃肠道耐受性、抗生素敏感性以及抑致病菌能力的菌株进行HT-29细胞黏附试验。将试验菌株活化后以1%比例接种于TSB液体培养基中,置于37 ℃、150 r/min摇床中培养8 h后,4 ℃、3 737×g离心10 min收集菌体,用RPMI-1640培养基重悬菌体并调整浓度至2×108 CFU/孔,接种至铺贴HT-29细胞(1×106个细胞/孔)的6孔板中,于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育1 h;弃去培养液后,用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次以去除未黏附菌体,每孔加入1 mL含0.1% Triton X-100的PBS溶液裂解30 min,取裂解液进行10倍梯度稀释后涂布TSA平板,37 ℃培养24 h后通过平板计数法计算黏附的细菌数。试验独立重复3次。黏附指数计算公式如下:
黏附指数=黏附的细菌数/细胞数。

1.2.4.5 菌株对脂多糖(LPS)诱导的HT-29细胞白细胞介素-8(IL-8)基因相对表达量的影响

将HT-29细胞按1.5×106个/孔接种到6孔细胞培养板中,加入2 mL RPMI-1640完全培养基,5% CO2培养箱中37 ℃培养48 h。对照组(CON组)中加入2 mL RPMI-1640培养基继续培养5 h;炎症模型组(LPS组)加入2 mL RPMI-1640培养基培养2 h后,添加10 μL(10 μg/mL) LPS诱导3 h;芽孢杆菌组加入2 mL含有108 CFU/mL芽孢杆菌的RPMI-1640培养基共培养2 h后,添加10 μL (10 μg/mL) LPS诱导3 h。培养结束后,提取细胞总RNA,合成cDNA后以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测IL-8基因相对表达量。qRT-PCR引物序列如表2所示,反应体系为20 μL,包括10 μL 2×SuperReal PreMix Plus,10 μmol/L正向和反向引物各0.6 μL,2.0 μL cDNA,6.8 μL RNase-Free ddH2O。反应体系反应条件:95 ℃预变性30 s,95 ℃变性5 s,60 ℃变性30 s,循环40次。反应程序结束后采用 2-△△Ct法进行相对定量分析。
表2 实时荧光定量PCR引物序列

Table 2 Primer sequence of qRT-PCR

基因Genes 引物序列Primer sequence (5'—3')
β-肌动蛋白β-actin F:TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC
R:ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG
白细胞介素-8 IL-8 F:GAATGGGTTTGCTAGAATGTGATA
R:CAGACTAGGGTTGCCAGATTTAAC

1.2.5 菌株的16S rDNA序列测序及菌株鉴定

采用16S rDNA分子生物学[20]鉴定方法,用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA,使用通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR扩增,将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检验[21],对成功扩增产物进行测序。获得目标菌株16S rDNA序列后,使用NCBI的BLAST工具对比分析菌株种属关系,利用MEGA12.0的邻接法构建16S rDNA基因系统发育树确定菌株种属。

1.2.6 小鼠急性经口毒性试验

动物试验由云南农业大学生命科学伦理委员会审批批准,批准编号为202409015。
参照《食品安全国家标准急性经口毒性试验》(GB 15193.3—2014)[22]标准,选取12只6周龄SPF级昆明小鼠,按照雌雄各半、体重接近的原则随机分为对照组和试验组,每组6只,单笼饲养。对照组小鼠每日灌胃200 μL生理盐水,试验组小鼠每日灌胃200 μL菌株E2菌液(2×108 CFU/mL),每日定时灌胃1次,连续灌胃7 d。灌胃期间观察小鼠行为变化,记录每日体重及采食量,计算平均日采食量、平均日增重以及料重比。第7天灌胃结束后,小鼠禁食禁水过夜,第8天称重并解剖,采集肝脏、肾脏、胸腺及脾脏,计算脏器指数。同时取空肠、回肠、肝脏和肾脏组织,经苏木精-伊红(HE)染色后观察组织形态,并测量肠绒毛高度、隐窝深度,计算绒毛高度/隐窝深度比值。
相关计算公式如下:
平均日采食量=试验期内饲粮消耗量/(试验天数×试验动物数量);
平均日增重=(终末体重-初始体重)/试验天数;
料重比=平均日采食量/平均日增重;
脏器指数=脏器重量/小鼠体质量。

1.3 数据统计与分析

采用SPSS 27.0软件对试验数据进行分析,使用t检验比较2组数据差异性,多组数据间差异性采用单因素方差分析(one-way ANOVA),并基于Duncan氏法进行多重比较。试验数据均以平均值±标准差表示,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离和鉴定

2.1.1 菌株的分离

从昆明犬粪便中共分离纯化获得23株菌株,其中9667号犬粪便样品中分离得到4株、 2140号犬粪便样品中分离得到11株、7830号犬粪便样品中分离得到3株、1958号犬粪便样品中分离得到5株。多数菌落呈不规则圆形,乳白色,较黏稠。分离出的菌株编号如表3所示。
表3 昆明犬粪便分离出的菌株编号

Table 3 Strain numbers of bacteria isolated from Kunming dog feces

犬编号Dog number 菌株编号Strain number
9667 A1、A2、A3、A4
2140 B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B10、B11、B12
7830 D1、D2、D4
1958 E1、E2、E3、E4、E5

2.1.2 菌株的革兰氏染色、芽孢染色及生理生化鉴定

如表4所示,23株菌革兰氏染色和芽孢染色均为阳性,且对V-P试验、硝酸盐还原、淀粉水解、明胶液化、柠檬酸盐、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇和7%氯化钠生长耐受试验表现为阳性,对厌氧生长和丙酸盐利用表现为阴性,表明筛选分离得到的23株菌生理生化特征符合芽孢杆菌的特征。
表4 菌株的生理生化试验结果

Table 4 Physiological and biochemical test results of strains

菌株
Strains		 革兰氏
染色
Gram
staining		 芽孢
染色
Spore
staining		 厌氧
生长
Anaerobic
growth		 V-P
试验
V-P
test		 硝酸盐
还原
Nitrate
reduction		 淀粉
水解
Starch
hydrolysis		 明胶
液化
Gelatin
liquefa-
ction		 丙酸盐
利用
Propionate
utilization		 柠檬
酸盐
Citrate		 D-木糖
D-
xylose		 L-阿
拉伯糖
L-
arabinose		 D-甘
露醇
D-
mannitol		 7%氯化钠
生长耐受
试验
7% NaCl
tolerance
test
A1 + + - + + + + - + + + + +
A2 + + - + + + + - + + + + +
A3 + + - + + + + - + + + + +
A4 + + - + + + + - + + + + +
B1 + + - + + + + - + + + + +
B2 + + - + + + + - + + + + +
B3 + + - + + + + - + + + + +
B4 + + - + + + + - + + + + +
B5 + + - + + + + - + + + + +
B6 + + - + + + + - + + + + +
B7 + + - + + + + - + + + + +
B8 + + - + + + + - + + + + +
B10 + + - + + + + - + + + + +
B11 + + - + + + + - + + + + +
B12 + + - + + + + - + + + + +
D1 + + - + + + + - + + + + +
D2 + + - + + + + - + + + + +
D4 + + - + + + + - + + + + +
E1 + + - + + + + - + + + + +
E2 + + - + + + + - + + + + +
E3 + + - + + + + - + + + + +
E4 + + - + + + + - + + + + +
E5 + + - + + + + - + + + + +

“+”表示阳性反应,“-”表示阴性反应。

“+” indicates a positive reaction, “-” indicates a negative reaction.

2.2 芽孢杆菌的益生特性研究

2.2.1 模拟胃液耐受试验

将分离得到的23株菌进行模拟人工胃液耐受试验,结果如表5所示,与0 h相比,模拟胃液中处理3 h后,12株芽孢杆菌存活率均高于84%(84.70%~99.01%),其余11株芽孢杆菌存活率均低于84%(48.66%~83.21%)。活菌数的存活率大于84%,表示其对模拟胃液的耐受性较好;活菌数的存活率小于84%,表示其对模拟胃液的耐受性较差。选取活菌数存活率大于84%的菌株进行下一步试验。
表5 菌株模拟胃液耐受试验

Table 5 Simulated gastric juice tolerance test of strains

菌株
Strains		 活菌数Viable count/[lg(CFU/mL)] 存活率
Survival rate/%
0 h 3 h
A1 7.77±0.03 4.56±0.07 58.69
A2 7.26±0.08 5.16±0.10 71.07
A3 7.67±0.04 6.55±0.03 85.40
A4 7.45±0.04 6.31±0.04 84.70
B1 7.75±0.06 5.10±0.02 65.81
B2 6.98±0.05 6.02±0.03 86.25
B3 7.40±0.10 4.00±0.00 54.05
B4 6.85±0.15 5.70±0.06 83.21
B5 5.62±0.05 5.26±0.18 93.59
B6 5.70±0.02 4.63±0.06 81.23
B7 6.15±0.17 5.41±0.08 87.97
B8 6.06±0.04 5.83±0.05 96.20
B10 5.05±0.10 5.00±0.04 99.01
B11 7.41±0.04 5.67±0.03 76.52
B12 6.41±0.13 5.71±0.03 89.08
D1 6.35±0.04 5.82±0.01 91.65
D2 8.31±0.07 6.10±0.04 73.41
D4 7.96±0.04 5.67±0.03 71.23
E1 6.12±0.03 5.88±0.02 96.08
E2 8.02±0.04 7.06±0.03 88.03
E3 7.69±0.05 6.02±0.03 78.28
E4 8.22±0.01 4.00±0.00 48.66
E5 7.22±0.01 6.12±0.11 84.76

2.2.2 模拟肠液耐受试验

选取具有较好耐胃酸能力的菌株进行模拟人工肠液耐受试验,结果如表6所示,与0 h相比,模拟肠液中处理3 h后,仅有1株芽孢杆菌存活率低于84%(51.25%),其余11株芽孢杆菌存活率均高于84%(84.52%~98.29%)。活菌数的存活率大于84%,表示其对模拟肠液的耐受性较好;活菌数的存活率小于84%,表示其对模拟肠液的耐受性较差。选取活菌数存活率大于84%的菌株进行下一步试验。
表6 菌株模拟肠液耐受试验

Table 6 Simulated intestinal juice tolerance test of strains

菌株
Strains		 活菌数Viable count/[lg(CFU/mL)] 存活率
Survival rates/%
0 h 3 h
A3 6.41±0.03 6.02±0.05 93.92
A4 5.25±0.07 4.46±0.15 84.95
B2 5.49±0.05 4.99±0.09 90.89
B5 5.26±0.18 5.00±0.14 95.06
B7 6.24±0.07 5.33±0.06 85.42
B8 5.04±0.12 4.26±0.24 84.52
B10 5.37±0.15 4.87±0.15 90.69
B12 8.00±0.00 4.10±0.17 51.25
D1 5.77±0.04 5.27±0.05 91.33
E1 5.85±0.04 5.75±0.02 98.29
E2 6.04±0.06 5.90±0.03 97.68
E5 5.27±0.05 5.05±0.13 95.83

2.2.3 抗生素敏感性试验

试验结果如表7所示,具有较好胃肠液耐受性的11株菌均对青霉素G、氨苄西林、亚胺培南、美罗培南、万古霉素、阿米卡星、庆大霉素、红霉素、克林霉素、四环素、环丙沙星、左氧氟沙星和利福平敏感;菌株B2对氯霉素耐药,其余10株菌均对氯霉素敏感;菌株A3、B7和B10对甲氧苄啶敏感,其余8株菌均对甲氧苄啶耐药。
表7 菌株抗生素敏感性试验

Table 7 Antibiotic sensitivity test of strains

抗菌药物
Antibacterial agents		 菌株Strains
A3 A4 B2 B5 B7 B8 B10 D1 E1 E2 E5
青霉素G Penicillin G S S S S S S S S S S S
氨苄西林Ampicillin S S S S S S S S S S S
亚胺培南Imipenem S S S S S S S S S S S
美罗培南Meropenem S S S S S S S S S S S
万古霉素Vancomycin S S S S S S S S S S S
阿米卡星Amikacin S S S S S S S S S S S
庆大霉素Gentamicin S S S S S S S S S S S
红霉素Erythromycin S S S S S S S S S S S
克林霉素Clindamycin S S S S S S S S S S S
四环素Tetracycline S S S S S S S S S S S
环丙沙星Ciprofloxacin S S S S S S S S S S S
左氧氟沙星Levofloxacin S S S S S S S S S S S
甲氧苄啶Trimethoprim S R R R S R S R R R R
氯霉素Chloramphenicol S S R S S S S S S S S
利福平Rifampicin S S S S S S S S S S S

“S”表示敏感,“R”代表耐药。

“S” means sensitive, “R” means resistant.

2.2.4 对肠道主要致病菌的抑制作用

用11株芽孢杆菌无菌上清液研究对大肠杆菌、福氏志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用。根据抑制圈直径大小结果显示,11株菌对3种指示菌均有抑制作用。抑菌性试验结果如表8所示,菌株E2对3种指示菌的抑制效果如图1所示。
表8 菌株对3种指示菌的抑菌性能

Table 8 Antimicrobial activity of strain against three indicator strains mm

菌株
Strains		 大肠杆菌
Escherichia coli		 福氏志贺氏菌
Shigella flexneri		 金黄色葡萄球菌
Staphylococcus aureus
A3 19.97±1.19 24.07±0.90 26.90±0.53
A4 12.90±1.40 13.47±0.65 14.03±0.98
B2 21.37±0.35 22.00±1.70 25.03±0.29
B5 13.70±1.04 17.20±1.70 18.27±0.25
B7 19.17±0.68 22.77±2.20 26.23±0.47
B8 13.09±0.87 15.23±0.40 11.27±0.06
B10 22.83±0.64 26.00±1.30 22.87±1.42
D1 14.64±0.56 14.80±1.40 13.54±0.38
E1 15.73±0.97 15.60±0.70 14.50±0.70
E2 18.50±1.47 18.33±0.80 17.84±0.73
E5 22.93±1.59 26.40±1.10 25.47±0.99
图1 菌株对3种指示菌的抑制效果(以菌株E2为例)

Fig.1 Inhibitory effect of strain against three indicator strains (taking strain E2 as an example)

2.2.5 肠上皮细胞黏附试验

根据模拟胃肠液耐受试验、抗生素敏感性测试以及肠道主要致病菌抑制试验结果,筛选出益生潜力较好的菌株A3、B7、B10、E2和E5进行肠上皮细胞黏附试验。试验结果如图2所示,菌株B10和E2对HT-29细胞的黏附指数显著高于菌株B7、E5和A3(P<0.05)。
图2 不同菌株对HT-29细胞的黏附性

数据柱标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Fig.2 Adhesion of different strains to HT-29 cells

Value bars labeled with different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).

2.2.6 菌株对LPS诱导HT-29细胞IL-8基因相对表达量的影响

由图3可知,与CON组相比,LPS组HT-29细胞IL-8基因相对表达量极显著增加(P<0.01)。与LPS组相比,菌株A3、B7和B10组IL-8基因相对表达量极显著增加(P<0.01);菌株E5组IL-8基因相对表达量显著增加(P<0.05)。值得注意的是,与LPS组相比,菌株E2组HT-29细胞IL-8基因相对表达量极显著降低(P<0.01)。结果表明,菌株E2与HT-29细胞共培养可降低LPS诱导的IL-8基因相对表达量,具有免疫调节潜力。
图3 菌株对LPS诱导的肠上皮细胞IL-8基因相对表达量的影响

数据柱标注“*”表示差异显著(P<0.05),“**”表示差异极显著(P<0.01)。

Fig.3 Effects of strain on relative expression level ofIL-8 gene in LPS-induced intestinal epithelial cells

Value bars marked with “*” indicate significant difference (P<0.05), and “**” indicate extremely significant difference (P<0.01).

2.2.7 菌株的16S rDNA序列测序及菌株鉴定

将优势菌株E2的16S rDNA序列与GenBank中的序列进行BLAST比对,发现其与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)模式菌株FZB42(登录号为:NR075005.2)相似性达99.74%。系统发育树结果如图4所示,菌株E2与贝莱斯芽孢杆菌FZB42同属一个遗传分枝。结合菌株的形态特征和生理生化试验最终确定菌株E2为贝莱斯芽孢杆菌。
图4 菌株E2基于16S rDNA序列的系统发育树

Bacillus velezensis:贝莱斯芽孢杆菌;Bacillus subtilis:枯草芽孢杆菌;Bacillus licheniformis:地衣芽孢杆菌;Bacillus pumilus:短小芽孢杆菌;Bacillus proteolyticus:解蛋白芽孢杆菌;Paenibacillus polymyxa:多黏类芽孢杆菌。

Fig.4 Phylogenetic tree of strain E2 based on sequences of 16S rDNA

2.2.8 小鼠急性经口毒性试验

2.2.8.1 小鼠生长性能

综合考虑23株菌株在体外环境中的益生特性,本试验选取性能较好的菌株E2进行小鼠体内安全性试验。灌胃贝莱斯芽孢杆菌E2对小鼠生长性能的影响如表9所示,与对照组相比,灌胃菌株E2后小鼠终末体重、平均日采食量以及平均日增重均有上升趋势,料重比有下降趋势,但均未造成显著差异(P>0.05)。
表9 灌胃贝莱斯芽孢杆菌E2对小鼠生长性能的影响

Table 9 Effects of gavage with Bacillus velezensis E2 on growth performance in mice

项目
Items		 对照组
Control group		 试验组
Experimental group		 P值
P-value
初始体重Initial body weight/ g 25.29±0.44 25.43±0.39 0.553
终末体重Final body weight/g 30.42±0.64 30.99±0.46 0.107
平均日采食量Average daily feed intake/g 5.06±0.46 5.10±0.25 0.843
平均日增重Average daily gain/g 0.73±0.10 0.79±0.09 0.277
料重比Feed/gain ratio 6.93±0.42 6.46±0.58 0.142

2.2.8.2 小鼠脏器指数

对小鼠进行剖检后发现对照组和试验组小鼠均未出现腹腔积水和出血症状,组织脏器均未见眼观可见的病理变化。由表10可知,与对照组相比,灌胃菌株E2后小鼠胸腺指数、肝脏指数、肾脏指数以及脾脏指数呈升高趋势,但均无显著差异(P>0.05)。
表10 灌胃贝莱斯芽孢杆菌E2对小鼠脏器指数的影响

Table 10 Effects of gavage with Bacillus velezensis E2 on organ indexes in mice mg/g

项目
Items		 对照组
Control group		 试验组
Experimental group		 P值
P-value
胸腺指数Thymus index 2.67±0.11 2.72±0.15 0.600
肝脏指数Liver index 51.03±1.11 50.83±1.27 0.781
肾脏指数Kidney index 13.48±0.77 13.64±0.56 0.689
脾脏指数Spleen index 3.93±0.19 4.00±0.19 0.576

2.2.8.3 病理组织切片观察

如图5所示,试验组灌胃菌株E2小鼠的空肠和回肠黏膜结构完整,绒毛形态与隐窝深度分布均与对照组一致,未观察到炎症细胞浸润、上皮水肿或黏膜糜烂等病理改变。利用CaseViewer软件测量绒毛高度和隐窝深度,由表11可知,与对照组相比,试验组小鼠的空肠、回肠绒毛高度、隐窝深度以及绒毛高度/隐窝深度比值均无显著变化(P>0.05)。由图6可知,灌胃菌株E2小鼠肝小叶结构界限分明,形态完整;肝细胞呈规则排列,细胞间连接紧密,细胞结构完整,排列有序,细胞边界清晰可见,未观察到任何充血或其他异常病理现象。因此,灌胃菌株E2未对小鼠肝脏、肾脏组织造成显著炎症或结构性损伤。
图5 小鼠空肠、回肠组织结构变化

A:对照组空肠组织切片;B:试验组空肠组织切片;C:对照组回肠组织切片;D:试验组回肠组织切片。

Fig.5 Morphological changes in jejunum and ileum of mice

A: jejunum tissue section in control group; B: jejunum tissue section in experimental group; C: ileum tissue section in control group; D: ileum tissue section in experimental group.

表11 灌胃贝莱斯芽孢杆菌E2对小鼠肠道形态结构的影响

Table 11 Effects of gavage with Bacillus velezensis E2 on intestinal morphological structure of mice

组织
Tissue		 项目
Items		 对照组
Control group		 试验组
Experimental group		 P值
P-value
空肠Jejunum 绒毛高度Villous height/μm 416.17±8.66 428.13±9.25 0.177
隐窝深度Crypt depth/μm 122.33±6.70 113.57±9.53 0.263
绒毛高度/隐窝深度V/C 3.40±0.26 3.77±0.24 0.139
回肠Ileum 绒毛高度Villous height/μm 297.50±9.60 303.87±6.73 0.400
隐窝深度Crypt depth/μm 134.77±9.24 126.80±11.32 0.399
绒毛高度/隐窝深度V/C 2.21±0.10 2.40±0.18 0.171
图6 小鼠肝脏、肾脏组织结构变化

A:对照组肝脏组织切片;B:试验组肝脏组织切片;C:对照组肾脏组织切片;D:试验组肾脏组织切片。

Fig.6 Morphological changes in liver and kidney tissues of mice

A: liver tissue section in control group; B: liver tissue section in experimental group; C: kidney tissue section in control group; D: kidney tissue section in experimental group.

3 讨论

益生菌是一种当给予适当用量时,对宿主机体机制有一定促进作用且活的微生物[23]。本研究从昆明犬新鲜粪便样品中分离得到23株芽孢杆菌,候选菌株必须能够耐受低pH的胃液和高胆盐浓度的肠液,才能在宿主肠道中定植并发挥作用,故耐酸和耐胆盐能力通常被认为是潜在益生菌的一个必要评估标准[24]。张瑞等[25]从白羽王鸽肠道中分离筛选出的蜡样芽孢杆菌A5、枯草芽孢杆菌B1和LK及解淀粉芽孢杆菌M2在模拟胃肠环境中均表现出良好的耐受性;常家高等[26]从海兰褐蛋鸡盲肠内容物中分离得到的莫海威芽孢杆菌在人工模拟胃肠环境中具有较强的耐受能力。本试验研究结果与前人研究结果一致,共有11株芽孢杆菌对模拟胃肠环境表现出良好的耐受性。通过对菌株进行抗菌药物敏感性检测,判断益生菌对常用抗菌药物是否产生耐药性,可有效避免耐药基因传播以及耐药菌株的出现,也是候选菌株体外安全性评估的关键环节[27]。研究发现,肠道微生物可以通过肠道内耐药基因携带位点在质粒或转座子上介导的其他微生物水平转移来获得抗性基因,从而产生抗生素耐药性[28]。本研究从昆明犬新鲜粪便中分离芽孢杆菌进行抗生素敏感性检测,结果显示,11株芽孢杆菌均对青霉素G等13种常用抗生素敏感;菌株A3、B7和B10对甲氧苄啶敏感,其余8株菌均对其耐药;除菌株B2对氯霉素耐药外,其余均对其敏感。可初步判断昆明犬源芽孢杆菌具有较高安全性。
芽孢杆菌进入动物机体后可产生细菌素、抗菌肽以及脂肽类抗生素等多种生物活性抑菌物质[29],可抑制肠道致病菌生长,维持动物肠道微生态系统平衡[30]。刘莹等[31]从健康猪新鲜粪便中分离得到的13株芽孢杆菌上清液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌均具有抑制作用;陈曦等[32]使用5株解淀粉样芽孢杆菌上清液对鸡白痢沙门菌、肠炎沙门氏菌和大肠杆菌O157进行体外抑菌试验,结果显示,2株芽孢杆菌可抑制上述致病菌的生长。本研究发现,昆明犬粪便中分离得到的11株芽孢杆菌无菌上清液对大肠杆菌、福氏志贺氏菌和金黄色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用。该结果与前人研究结果相似。值得注意的是,筛选所得菌株对3株指示菌的抑制能力有所差异,这可能与菌株产生的抑菌物质种类和浓度不同有关,上述芽孢杆菌产生的抑菌代谢产物有待未来进一步研究。
益生菌需对肠道黏膜具有一定的黏附性能以在肠道定植并发挥益生作用[33]。研究表明,益生菌抑制有害菌的繁殖主要依靠竞争黏附位点,致病菌会结合肠道上皮细胞表面分子的结合体,而益生菌进入肠道后与肠道内致病菌竞争肠道上皮细胞黏附位点,形成微生物屏障,从而抵制有害菌的入侵,维护肠道微生态的平衡[34]。芽孢杆菌对肠上皮细胞的黏附是实现菌株在肠道内定植的基础,也是评价芽孢杆菌能否成为优势菌的关键。本研究综合模拟胃肠液耐受能力、抗生素敏感性以及肠道主要致病菌抑制能力,筛选出益生潜力较好的5株芽孢杆菌在HT-29细胞中进行肠上皮细胞黏附试验,结果表明,菌株B10和E2具有较强的黏附性,表明其在肠道定植的可能性较大,从而竞争性抑制病原菌的定植。
细胞系HT-29是研究肠道微生物、益生菌及代谢物免疫调节功能理想的体外模型[35]。LPS刺激会导致机体肠道黏膜损伤,包括肠道渗透性增高、组织形态改变等,进而导致生长性能降低[36],同时促炎细胞因子IL-8在LPS诱导的巨噬细胞中过表达,会导致各种炎症性疾病发生[37]。益生菌可通过抑制炎症因子分泌,提高抗炎因子表达,调节宿主的肠道黏膜免疫,以达到保护机体的目的[38]。研究发现,凝结芽孢杆菌MTCC 5856可显著抑制LPS诱导的HT-29细胞促炎因子IL-8的表达,调控免疫系统以拮抗LPS引起的炎性应答[39];灌胃SD大鼠贝莱斯芽孢杆菌M2 7 d后可降低血浆中IL-8含量,抑制大鼠的炎症反应[40]。本研究结果与前人研究结果一致,贝莱斯芽孢杆菌E2能显著抑制LPS诱导的HT-29细胞炎症基因IL-8的基因表达,对维持宿主肠道免疫稳态平衡具有积极意义。
基于16S rDNA构建的系统发育树表明,菌株E2为贝莱斯芽孢杆菌。贝莱斯芽孢杆菌作为一种新型芽孢杆菌,能够产生多种抗菌肽,具有良好的抑致病菌能力和丰富的胞外酶系,可改善动物肠道微生物区系稳态和黏膜免疫平衡[41]。益生菌的安全无致病性至关重要,在投入生产使用之前,需对菌株安全性进行准确评价[42]。研究发现,对小鼠连续7 d灌胃200 μL新疆细毛羊源巨大芽孢杆菌BM24(1×108 CFU/mL),小鼠健康状况良好,解剖脏器无明显病变,脏器指数均无显著变化[43];对小鼠连续7 d灌胃200 μL骆驼源龙舌兰芽孢杆菌LTF7(1×108 CFU/mL),小鼠未见异常症状和死亡,剖检腹腔脏器无明显眼观病理变化,具备良好的饲喂安全性[44]。本研究对小鼠连续7 d灌胃200 μL贝莱斯芽孢杆菌E2(2×108 CFU/mL),小鼠的终末体重、平均日采食量以及平均日增重有上升趋势,料重比有下降趋势,但均无显著差异;解剖脏器无明显病变,且脏器指数无显著差异,空肠、回肠黏膜结构完整且绒毛高度、隐窝深度以及绒毛高度/隐窝深度比值均无显著变化。与前人研究结果一致,表明贝莱斯芽孢杆菌E2具备较高的安全性。
综上所述,本研究从健康昆明犬粪便中筛选出的贝莱斯芽孢杆菌E2具有较强的抗生素敏感性、胃肠道耐受性、抑菌活性、肠道黏附能力、抗炎能力以及安全性,具有作为饲用益生菌的潜力,可进一步对该株芽孢杆菌进行全基因组测序分析,从分子水平评价其安全性,并开展昆明犬饲喂试验,检测饲喂贝莱斯芽孢杆菌E2条件下对警犬肠道健康以及警用性能的作用机制。

4 结论

本研究于健康昆明犬粪便中分离得到23株芽孢杆菌。其中,菌株A3、B7、B10、E2和E5具有优良模拟胃肠液耐受性、抗生素敏感性和肠道主要致病菌抑制能力;菌株B10和E2具有较强肠上皮细胞黏附能力;菌株E2能显著抑制LPS诱导的HT-29细胞炎症基因IL-8基因表达,具有免疫调节作用。基于菌株E2的16S rDNA序列构建系统发育树,将其鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。值得注意的是,灌胃菌株E2对小鼠无毒副作用。综上所述,贝莱斯芽孢杆菌E2具有优良的益生特性及安全性,具有作为警犬专用微生态制剂的潜力。

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