Chinese Journal of Animal Nutrition >

2026 , Vol. 38 >Issue 1: 767 - 779

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2026.059

RESEARCH PAPER

A Study on Technological Conditions of Bacteria-Enzyme Synergetic Fermentation of Canola Meal

  • HUANG Jian , 1, 2 ,
  • WANG Ying 3 ,
  • HUANG Keyun 1, 2 ,
  • YANG Hongling 1, 2, 4 ,
  • CAI Guohe 1, 2 ,
  • LU Kangle 1, 2, 4 ,
  • SUN Yunzhang , 1, 2, 4, **
Expand
  • 1 State Key Laboratory of Mariculture Breeding, Fisheries College of Jimei University, Xiamen 361021, China
  • 2 Xiamen Key Laboratory of Feed Testing and Safety Evaluation, Fisheries College of Jimei University, Xiamen 361021, China
  • 3 College of Ocean and Earth Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, China
  • 4 Key Laboratory of Healthy Mariculture for the East China Sea, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Fisheries College of Jimei University, Xiamen 361021, China
** professor, E-mail:

*Contributed equally

Received date: 2025-05-30

  Online published: 2026-01-13

Fold

Abstract

The purpose of this experiment was to study the technological conditions of bacteria-enzyme synergetic fermentation of canola meal, and to develop a fermented canola meal for aquaculture application. The canola meal was fermented by complex bacterial of Bacillus pumilus SE5, Lactococcus lactis 17 and Saccharomyces cerevisiae Sa, the contents of fermentation products such as phytic acid, tannin and glucosinolate were synthesis score analysis by single-factor and orthogonal experiments, and optimized the technological conditions such as strain ratio, inoculation amount, solid-liquid ratio and fermentation time; on this basis, the synergistic fermentation experiments of cellulase, pectinase, phytase and protease was carried out to optimize the optimal addition of each enzyme. The results showed as follows: 1) the optimal ratio of fermentation strain of canola meal was Bacillus pumilus SE5∶Saccharomyces cerevisiae Sa∶Lactococcus lactis 17=1∶2∶2; the best fermentation conditions were the inoculation amount of 10%, the fermentation time of 60 h, the solid-liquid ratio of 1∶1.0; the optimal additions of cellulase, pectinase, phytase and protease were 40, 20, 9 and 150 U/g, respectively. 2) Under the best fermentation conditions, the contents of crude protein, acid-gliadin and amino acids in canola meal after fermentation were 50.25%, 13.64% and 35.86%, respectively, which increased by 18.79%, 156.39% and 20.66% compared with that before fermentation, respectively; the contents of phytic acid, tannin and glucosinolate were 2.64%, 1.11% and 17.05 μmol/g, respectively, which decreased by 68.08%, 40.38% and 33.76% than that before fermentation, respectively. In conclusion, the bacteria-enzyme synergetic fermentation can effectively improve the nutritional value of canola meal.

Key words： canola meal; bacteria-enzyme synergetic; fermentation technological conditions; nutritional value

Cite this article

HUANG Jian , WANG Ying , HUANG Keyun , YANG Hongling , CAI Guohe , LU Kangle , SUN Yunzhang . A Study on Technological Conditions of Bacteria-Enzyme Synergetic Fermentation of Canola Meal[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2026 , 38(1) : 767 -779 . DOI: 10.12418/CJAN2026.059

近年来,随着我国水产养殖业的快速发展,对饲料的需求也大量增加,鱼粉作为水产动物饲料重要的大宗动物蛋白质原料,存在供应短缺和价格高企等问题,因此,寻找鱼粉的替代蛋白质原料成为水产饲料配方领域的关注热点[1]。菜籽粕是我国丰富的植物蛋白质资源之一,具有蛋白质含量高、价格低廉、加工方便等优点[2]。双低菜籽粕是双低油菜籽制油后的副产品,其粗蛋白质、粗脂肪和粗纤维等常规营养成分含量与普通菜籽粕无显著差异,氨基酸组成齐全,蛋白质品质优良,且富含矿物质及微量元素,但存在植酸、单宁和硫苷等抗营养因子的困扰[3]。研究表明,双低菜籽粕作为优质植物蛋白质源可替代饲料中部分鱼粉,但由于存在氨基酸不平衡和抗营养因子等问题,限制了其在水产饲料中的使用[4-5]。水产饲料中因高比例添加双低菜籽粕会影响饲料外观和适口性,限制蛋白质、脂肪等营养物质消化和吸收,破坏肠道微生物平衡,对水生动物生长性能产生不利影响[6-8]。此外,双低菜籽粕还会干扰水生动物生理代谢过程,妨害水生动物甲状腺功能,并造成肝脏、肾脏等器官肿大、受损等[9-10]。
应用发酵技术可降低植物蛋白质原料中的抗营养因子含量,提高蛋白质、小肽含量,改善其营养价值[11]。酶解技术通过应用纤维素酶、果胶酶、蛋白酶和植酸酶等,将蛋白质、糖类等大分子物质进一步分解为小肽、还原糖等小分子物质,提高植物蛋白质原料的消化率和吸收率[12]。菌酶协同发酵技术是发酵技术和酶解技术的有效结合,能发挥“1+1>2”的效果,将菌酶协同发酵技术应用于双低菜籽粕的改性研究,可更有效促进发酵产物中植酸、单宁和硫苷等抗营养因子的降解,并提高其酸溶蛋白、小肽、还原糖等小分子物质含量,极大地改善双低菜籽粕的营养价值[13]。因此,本试验旨在优化菌酶协同发酵双低菜籽粕的工艺条件,评估双低菜籽粕发酵前后的营养价值,以期获得一种优质的水产用发酵蛋白质原料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌种和培养基

本试验发酵用菌种为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SE5、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)17和酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)Sa[14],均为实验室前期筛选并保藏的优良菌种。2216E培养基用于短小芽孢杆菌SE5的活化和传代培养,MRS培养基用于乳酸乳球菌17的活化和传代培养,YPD培养基用于酿酒酵母菌Sa的活化和传代培养,以上3种培养基均购于青岛海博生物技术有限公司,配制与使用方法参考产品说明。

1.1.2 主要原料与试剂

双低菜籽粕由厦门银翔油脂有限公司提供,蛋白酶(100 000 U/g)和纤维素酶(200 000 U/g)由山东隆科特酶制剂有限公司提供,果胶酶(20 000 U/g)和植酸酶(50 000 U/g)由武汉新华扬生物股份有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 发酵种子液制备

取保藏菌液200 μL接种至50 mL液体培养基中,短小芽孢杆菌SE5接种于灭菌2216E液体培养基,乳酸乳球菌17接种于灭菌MRS肉汤培养基,酿酒酵母菌Sa接种于灭菌YPD液体培养基,30 ℃、150 r/min活化24 h。活化菌液以5%接种量传代2次,取第2次传代的对数生长中期菌液作为发酵种子液,其中短小芽孢杆菌SE5、乳酸乳球菌17和酿酒酵母菌Sa浓度分别为1.21×107、4.5×105和1.4×107 CFU/g。

1.2.2 菌株比例优化试验

在250 mL锥形瓶中加入20 g双低菜籽粕(过40目筛)和0.2 g葡萄糖,以10%的菌液接种量并加入灭菌生理盐水混匀后一起加入锥形瓶中,使得基质含水量为50%(液料比为1∶1)。搅拌均匀,8层纱布封瓶口,24 h后牛皮纸封口,30 ℃培养箱中恒温发酵48 h。菌株比例试验设计见表1。每个试验做3个重复,发酵样品65 ℃烘干并粉碎,常温保存,测定发酵产物的硫苷、单宁和植酸含量,并对其降解率进行综合评分分析。
表1 菌株比例试验设计

Table 1 Experimental design of strain ratios

试验编号
Experimental No.		 短小芽孢杆菌SE5
Bacillus pumilus SE5		 酿酒酵母菌Sa
Saccharomyces cerevisiae Sa		 乳酸乳球菌17
Lactococcus lactis 17
1 1 2 2
2 2 1 2
3 2 2 1
4 1 1 2
5 1 2 1
6 2 1 1
7 1 1 1

1.2.3 单因素试验和正交试验

固定最佳菌株比例参数,进行料液比、发酵时间和接种量等单因素试验(表2),选择较优因素和水平进行正交试验(表3),明确最佳发酵条件。每个试验做3个重复,发酵样品65 ℃烘干并粉碎,常温保存,测定发酵产物的硫苷、单宁和植酸含量,并对其降解率进行综合评分分析。
表2 单因素试验设计

Table 2 Single-factor experimental design

因素
Factors		 水平Levels
1 2 3 4 5
料液比Solid-liquid ratio 1∶0.6 1∶0.8 1∶1.0 1∶1.2 1∶1.4
发酵时间Fermentation time/h 36 48 60 72 84
接种量Inoculum amount/% 6 8 10 12 14
表3 正交表

Table 3 Orthogonal table

组别
Groups		 料液比
Solid-liquid ratio		 发酵时间
Fermentation time		 接种量
Inoculum amount
1 1 1 1
2 1 2 3
3 1 3 2
4 2 1 3
5 2 2 2
6 2 3 1
7 3 1 2
8 3 2 1
9 3 3 3

1.2.4 4种酶的适宜添加量试验

固定优化后的发酵条件进行4种酶的适宜添加量试验。蛋白酶添加试验以发酵产物中酸溶蛋白含量为评价指标,设置添加量分别为50、100、150、200和250 U/g;纤维素酶和果胶酶添加试验以发酵产物中植酸、硫苷、单宁的降解率和酸溶蛋白含量作为评价指标,并进行综合评分,设置添加量分别为10、20、30、40和50 U/g;植酸酶添加试验以发酵产物中植酸降解率作为评价指标,设置添加量分别为3、6、9、12和15 U/g。每个试验重复进行3次,发酵样品65 ℃烘干并粉碎,常温保存以待后续检测。

1.2.5 发酵前后营养价值比较研究

在最佳发酵条件下,测定发酵产物粗蛋白质、酸溶蛋白、粗脂肪、氨基酸(17种氨基酸总量)等常规营养成分,以及硫苷、单宁和植酸等抗营养因子含量,与未发酵双低菜籽粕进行比较。每个试验重复进行3次,发酵样品65 ℃烘干并粉碎,常温保存以待后续检测。

1.3 测定指标和方法

粗蛋白质含量根据GB/T 6432—2018的方法测定;粗脂肪含量根据GB/T 6433—2006的方法测定;氨基酸含量根据GB/T 18246—2019的方法,采用氨基酸自动分析仪测定;硫苷含量采用氯化钯法[15]测定;单宁含量根据GB/T 27985—2011的方法测定;植酸含量采用三氯化铁比色法[16]测定;酸溶蛋白含量参考余勃等[17]的方法测定,取1 g经烘干粉碎后的发酵产物,加入10 mL 15%的三氯乙酸溶液,振荡提取30 min,3 540×g离心10 min,吸取上清液备用,上清液蛋白质含量测定方法为双缩脲法。

1.4 数据统计与分析

使用Excel 2021对数据进行初步处理、综合评分计算和极差分析,综合评分采用Critic法。使用SPSSAU进行正交试验设计,SPSS 22.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA),Duncan氏法进行多重比较,采用GraphPad Prism进行图表绘制。数据结果以“平均值±标准误”表示,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 菌株比例优化

由表4可知,短小芽孢杆菌SE5∶酿酒酵母菌Sa∶乳酸乳球菌17的比例为1∶2∶2时,发酵菜籽粕产物中植酸、单宁和硫苷降解率均为最高,且综合评分最高。因此,确定1∶2∶2为适宜菌株比例并进行后续试验。
表4 不同菌株比例对抗营养因子的降解效果

Table 4 Degradation effects of different strain ratios on anti-nutritional factors

菌株比例
Strain ratio		 硫苷降解率
Glucosinolate degradation
rate/%		 单宁降解率
Tannin degradation
rate/%		 植酸降解率
Phytic acid degradation
rate/%		 综合评分
Synthesis score
1∶2∶2 29.81±0.31a 21.95±0.27a 24.87±0.23ab 99.69
2∶1∶2 18.78±0.39c 18.44±0.82b 21.62±0.31c 79.81
2∶2∶1 20.32±0.66c 17.37±0.61b 24.26±0.21ab 82.02
1∶1∶2 15.73±0.60d 16.93±0.81b 22.33±0.21bc 75.17
1∶2∶1 18.91±0.92c 9.22±0.45d 23.31±0.19b 62.62
2∶1∶1 25.10±0.93b 10.21±0.22d 25.12±0.25a 71.76
1∶1∶1 24.03±0.41b 12.97±0.78c 24.00±0.14ab 75.31

同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。表5至表7和表10至表12同。

In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as Table 5 to Table 7 and Table 10 to Table 12.

2.2 料液比优化

由表5可知,随着料液比的降低,发酵产物中植酸、单宁和硫苷降解率呈先升高后降低趋势,植酸降解率在料液比为1∶1.0时最高,单宁和硫苷降解率在料液比为1∶0.8时最高,综合评分在料液比为1∶0.8时最高。因此,选择料液比为1∶0.6、1∶0.8和1∶1.0进行后续正交试验。
表5 不同料液比对抗营养因子的降解效果

Table 5 Degradation effects of different solid-liquid ratios on anti-nutritional factors

料液比
Solid-liquid
ratio		 硫苷降解率
Glucosinolate degradation
rate/%		 单宁降解率
Tannin
degradation rate/%		 植酸降解率
Phytic acid
degradation rate/%		 综合评分
Synthesis score
1∶0.6 26.37±0.43c 19.81±1.71c 22.48±0.59b 82.30
1∶0.8 33.39±0.90a 27.28±0.73a 23.38±0.59ab 97.18
1∶1.0 29.81±0.31b 21.95±0.27b 24.87±0.41a 91.50
1∶1.2 26.08±0.83bc 19.63±0.68c 20.89±0.90bc 78.91
1∶1.4 19.96±1.08c 17.50±1.00d 20.34±0.42c 71.52

2.3 发酵时间优化

由表6可知,随着发酵时间的增加,发酵产物的植酸降解率呈升高趋势,单宁和硫苷降解率在发酵60 h后趋于稳定,综合评分逐渐增大并趋于稳定。因此,选取发酵时间为48、60和72 h进行后续正交试验。
表6 不同发酵时间对抗营养因子的降解效果

Table 6 Degradation effects of different fermentation time on anti-nutritional factors

发酵时间
Fermentation
time/h		 硫苷降解率
Glucosinolate degradation
rate/%		 单宁降解率
Tannin degradation
rate/%		 植酸降解率
Phytic acid degradation
rate/%		 综合评分
Synthesis score
36 20.60±0.95c 14.66±0.83d 15.83±0.61d 54.38
48 29.81±0.31b 21.95±0.27c 24.87±0.41c 82.09
60 38.78±0.64a 24.86±0.85a 27.01±0.66b 94.52
72 40.09±1.11a 21.59±0.63b 31.57±0.58a 94.08

2.4 接种量优化

由表7可知,不同接种量对抗营养因子的降解效果影响不一。随着接种量的增加,单宁和硫苷的降解率呈升高趋势,植酸降解率呈先升高后降低趋势,综合评分呈先升高后降低趋势,接种量为12%时综合评分最高。因此,选择接种量为10%、12%和14%进行后续正交试验。
表7 不同接种量对抗营养因子的降解效果

Table 7 Degradation effects of different inoculation amounts on anti-nutritional factors

接种量
Inoculation
amounts/%		 硫苷降解率
Glucosinolate degradation
rate/%		 单宁降解率
Tannin degradation
rate/%		 植酸降解率
Phytic acid degradation
rate/%		 综合评分
Synthesis score
6 19.22±0.67c 17.76±0.67d 16.74±0.77d 61.73
8 24.52±0.94b 20.07±0.64c 21.55±0.52c 75.83
10 29.81±0.31ab 21.95±0.27b 24.87±0.41b 87.18
12 31.84±1.41a 23.41±1.17ab 30.22±0.64a 98.52
14 32.41±1.33a 24.25±0.54a 25.32±0.45b 92.70

2.5 正交试验

2.5.1 正交试验结果和极差分析

正交试验可以对多因素和多个因素水平进行考察,通过对数据进行极差分析和方差分析,可以验证结论的可靠性。极差可反映各因素影响综合评分的优先因素。由表8可知,比较综合评分的极差可知,料液比(A)>发酵时间(B)>接种量(C),因此料液比和发酵时间是主要影响因素,比较各因素对应的k值,可知kA3>kA2>kA1,kB3>kB2>kB1,kC1>kC2>kC3,得到各因素最优水平为A3、B3和C1,即复合菌发酵的最优工艺条件为料液比为1∶1.0,发酵时间为72 h,接种量为10%。
表8 正交试验结果和极差分析

Table 8 Results and range analysis of orthogonal experiment

项目
Items		 料液比
Solid-
liquid
ratio(A)		 发酵时间
Fermentation
time(B)/
h		 接种量
Inoculum
amount(C)/
%		 硫苷降解率
Glucosinolate
degradation
rate/%		 单宁降解率
Tannin
degradation
rate/%		 植酸降解率
Phytic acid
degradation
rate/%		 综合评分
Synthesis
score
试验编号Experimental No.
1 1(1∶0.6) 1(48 h) 1(10%) 38.91 21.13 24.46 81.05
2 1 2(60 h) 3(14%) 41.56 18.47 29.53 82.26
3 1 3(72 h) 2(12%) 38.71 22.13 31.99 87.31
4 2(1∶0.8) 1 3 37.69 18.89 30.22 80.21
5 2 2 2 41.48 19.72 35.85 88.23
6 2 3 1 37.93 22.97 34.32 89.50
7 3(1∶1.0) 1 2 37.53 23.15 30.65 87.11
8 3 2 1 37.81 27.09 29.36 92.77
9 3 3 3 35.29 26.26 30.17 89.90
k1 83.54 82.79 87.77
k2 85.98 87.75 87.55
k3 89.92 88.90 84.12
极差R 6.38 6.12 3.65
优先因素Factors of priority A>B>C
最优方案Best practices A3B3C1

2.5.2 正交试验方差分析

由表9可知,各因素P值均小于0.05,表明各因素对综合评分具有显著性影响。F值反映各因素不同处理水平对综合评分影响的差异性,发酵时间的F值最大,接种量的F值最小,表明发酵时间对综合评分影响最大。根据极差分析和方差分析结果可知,发酵条件为A3B3C1时,其综合评分最高,综合考虑实际生产可行性和经济效益,选择发酵时间为60 h,料液比为1∶1.0,接种量为10%,作为优化后的复合菌发酵工艺条件。
表9 正交试验方差分析

Table 9 Analysis of variance of orthogonal experiment

项目
Items		 自由度
Degree of
freedom		 离差平方和
Sum of squares of
dispersion		 因素均方
Factor mean square		 F值
F-value		 P值
P-value
料液比Solid-liquid ratio 2 190.360 95.180 50.373 <0.001
发酵时间Fermentation time/h 2 198.371 99.186 52.493 <0.001
接种量Inoculum amount/% 2 72.500 36.250 19.185 <0.001
误差Error 20 37.790 1.889

2.6 4种酶的适宜添加量发酵试验结果

2.6.1 纤维素酶、果胶酶适宜添加量发酵试验结果

由表10可知,随着纤维素酶添加量的增加,酸溶蛋白含量呈先升高后降低趋势,硫苷降解率呈降低趋势,纤维素酶添加量为40 U/g时综合评分最高;随着果胶酶添加量的增加,植酸和单宁降解率呈升高趋势,硫苷降解率呈降低趋势,酸溶蛋白含量呈先升高后降低趋势,果胶酶添加量为20 U/g时综合评分最高。
表10 纤维素酶、果胶酶适宜添加量发酵试验结果

Table 10 Fermentation experiment results of optimal addition of cellulase and pectinase

项目
Items		 硫苷降解率
Glucosinolate
degradation rate/%		 单宁降解率
Tannin degradation
rate/%		 植酸降解率
Phytic acid
degradation rate/%		 酸溶蛋白含量
Acid-gliadin
content/%		 综合评分
Synthesis score
纤维素酶添加量Cellulase addition/(U/g)
10 34.26±0.36a 23.88±0.37b 25.19±0.50ab 8.40±0.34c 92.28
20 33.89±0.14ab 21.10±0.25c 24.62±0.79ab 9.27±0.25b 90.81
30 33.07±0.40b 24.85±0.34b 25.87±0.65a 9.49±0.16ab 95.15
40 32.15±0.74c 27.91±0.53a 24.04±0.69b 9.93±0.19a 96.60
50 32.06±0.38c 27.43±1.24a 24.12±0.89b 9.16±0.43b 94.44
果胶酶添加量Pectinase addition/(U/g)
10 36.72±0.61a 19.98±1.09b 26.86±0.34d 9.27±0.19c 92.13
20 36.48±0.57a 21.62±0.61a 29.55±0.34c 9.82±0.33b 97.20
30 33.85±0.65b 18.68±0.37c 30.71±0.99b 9.60±0.25ab 92.59
40 33.04±1.00b 13.76±0.71e 31.49±0.56b 10.31±0.28a 89.06
50 34.25±1.50b 16.18±0.49d 32.54±0.20a 9.44±0.09ab 91.37

2.6.2 植酸酶、蛋白酶适宜添加量发酵试验结果

由表11可知,随着植酸酶添加量的增加,植酸降解率呈先升高后降低趋势,植酸酶添加量为9 U/g时植酸降解率最高,达62.53%。
表11 植酸酶适宜添加量发酵试验结果

Table 11 Fermentation experiment results of optimal addition of phytase %

植酸酶添加量
Phytase
addition/(U/g)		 植酸降解率
phytic acid
degradation rate
3 52.91±0.80c
6 58.07±1.20b
9 62.54±0.91a
12 60.41±0.78ab
15 55.97±0.83b
由表12可知,随着蛋白酶添加量的增加,酸溶蛋白含量呈先升高后趋于稳定趋势,蛋白酶添加量为150 U/g时酸溶蛋白含量最高,达12.82%。
表12 蛋白酶适宜添加量发酵试验结果

Table 12 Fermentation experiment results of optimal additions of protease %

蛋白酶添加量
Protease
addition/(U/g)		 酸溶蛋白含量
Acid-gliadin
content
50 10.58±0.57b
100 11.56±0.34b
150 12.82±0.25a
200 12.71±0.09a
250 12.38±0.41a

2.7 双低菜籽粕发酵前后营养价值比较

由表13可知,与发酵前相比,发酵后双低菜籽粕营养价值得到有效提升,粗蛋白质含量为50.25%,提升了18.79%;酸溶蛋白含量为13.64%,提升了156.39%;粗脂肪含量为2.80%,提升了11.55%;氨基酸含量为35.86%,提升了30.75%;硫苷含量为17.05 μmol/g,降低了40.38%;单宁含量为1.11%,降低了33.76%;植酸含量为2.64%,降低了68.08%。
表13 双低菜籽粕发酵前后营养价值比较

Table 13 Comparison of nutritional value before and after fermentation of canola meal

项目
Items		 发酵前
Before fermentation		 发酵后
After fermentation		 变化率
Change rate/%
营养成分Nutrients/%
粗蛋白质Crude protein 42.30±0.20 50.25±0.27 +18.79
酸溶蛋白Acid-soluble protein 5.32±0.08 13.64±0.09 +156.39
粗脂肪Crude fat 2.51±0.02 2.80±0.02 +11.55
氨基酸Amino acids 29.72 35.86 +30.75
抗营养因子Anti-nutritional factors
硫苷Glucosinolate/(μmol/g) 22.98±0.32 17.05±0.49 -40.38
单宁Tannin/% 1.35±0.03 1.11±0.01 -33.76
植酸Phytic acid/% 6.69±0.66 2.64±0.16 -68.08

3 讨论

3.1 菌株比例对双低菜籽粕发酵效果的影响

复合菌发酵技术可充分发挥多种微生物的协同作用,通过氧化、还原、甲基化等功能和代谢酶,将纤维素、半纤维素、蛋白质等大分子物质转化为木聚糖、有机酸、小肽类物质和氨基酸等小分子物质,同时分解或转化抗营养因子,提升发酵产物品质和营养价值[18-20]。目前,利用复合菌发酵技术提高饲料原料营养价值研究已有诸多报道。陆娟娟等[21]将菜籽粕进行发酵处理,提高了发酵产物粗蛋白质、酸溶蛋白含量及蛋白质溶解度,降低了抗营养因子(如异硫氰酸酯)含量。汪钰等[22]研究发现,发酵菜籽粕中内源毒素含量显著降低,粗蛋白质和酸溶蛋白含量有效提高。类似的,何小丽等[23]研究发现,生物发酵技术可有效降低菜籽粕中的抗营养因子含量,并提高营养价值。发酵是微生物与发酵基质以及微生物彼此之间的复杂相互作用,根据发酵目的不同,需优化菌株比例,确定最佳菌株接种比例。研究发现,地衣芽孢杆菌∶M1菌株∶芬氏纤维微菌的比例为1∶2∶2时,获得的发酵效果最好[24]。乳酸菌∶枯草芽孢杆菌∶地衣芽孢杆菌的比例为1∶1∶4时,发酵产物酸溶蛋白含量最高[25]。类似的,王欢等[26]认为枯草芽孢杆菌∶乳酸杆菌∶酿酒酵母的比例为2∶2∶1时,取得的发酵效果最好。本试验中,当短小芽孢杆菌SE5∶酿酒酵母菌Sa∶乳酸乳球菌17的比例为1∶2∶2时,植酸、单宁和硫苷降解效果最佳,且综合评分最高,提示此时的菌株比例更好的促进了微生物与发酵基质和微生物彼此之间的复杂相互作用。

3.2 发酵参数对双低菜籽粕发酵效果的影响

发酵过程中,影响发酵效果的参数包括料液比、接种量、发酵时间等,适宜发酵参数可促进微生物的生长和增殖,提高发酵基质降解效果[27-28]。微生物的增殖活动需利用自由水,适宜料液比可维持正常细胞结构和功能。耿彦超等[29]研究发现,当料液比为1∶1时,发酵效果最佳,此时发酵产物的总酸、酸溶蛋白含量可达4.12%、4.02%,乳酸菌活菌数可达2.46×108 CFU/g。料液比过高,不利于氧气流通和散热,影响菌种增殖速度和发酵效果。Liu等[30]研究发现,料液比为1∶1.25时,发酵产物小肽含量最高,可达217.66 mg/g,而继续提高料液比对增加小肽含量无显著影响。适宜接种量可缩短发酵周期,提高发酵基质降解程度和发酵效果,接种量过高会使菌体繁殖高峰提早到达,并快速衰亡,导致发酵不彻底;接种量过低则需延长发酵时间以求达到预期效果。本试验中,适宜菌液接种量为10%,与赖佳薇[31]在固态发酵柑橘皮渣中的参数相同。发酵时间因发酵目的和发酵工艺等不同存在较大差异,且发酵时间的控制至关重要,发酵时间过长会增加发酵产物染菌风险并散发刺激性气味,也不利于降低生产成本。王桦康等[32]研究表明,发酵时间为3 d时,发酵菜籽粕中缩合单宁降解率显著高于其他发酵时间。另一研究发现,发酵产物酸溶蛋白含量随发酵时间延长而增加,且在发酵时间为72 h时达到最佳发酵效果,继续延长发酵时间并不会显著提高酸溶蛋白含量[33]。本试验中,单因素试验和正交试验结果表明,最佳发酵工艺条件的接种量为10%,料液比为1∶1.0,发酵时间为60 h。其原因可能为该种发酵条件为菌株提供了适宜的水分和氧气条件,促进了菌株的生长、繁殖活动,从而提高了降解双低菜籽粕中抗营养因子的能力。

3.3 酶对双低菜籽粕发酵效果的影响

酶解技术中可用酶种类多,且作用不一。纤维素酶和果胶酶可破坏纤维结构,释放胞内营养物质[34-35];蛋白酶可分解大分子蛋白质,提高产物消化率或特定功能肽含量[36];植酸酶可消除植酸的抗营养作用,并释放可利用的有效磷等[37-38]。菌酶协同发酵需充分考虑发酵基质特性、酶的作用类型和适宜添加量等多种因素。本试验在总结双低菜籽粕特性和前人研究基础上,选择纤维素酶、果胶酶、植酸酶和蛋白酶进行探究,通过设置不同梯度添加量进行协同发酵试验,确定各酶适宜添加量分别为纤维素酶40 U/g,果胶酶20 U/g,蛋白酶150 U/g,植酸酶9 U/g。本试验中,蛋白酶适宜添加量与杨家帅等[39]利用中性蛋白酶酶解菜籽粕所得的125 U/g极为接近,这表明在类似的发酵底物和酶解环境下,蛋白酶的适宜剂量范围相对稳定。植酸酶适宜添加量为9 U/g,与崔细鹏等[40]的研究结果相符,再次印证了在相关发酵体系中植酸酶添加量的一致性,为该类发酵工艺中这2种酶的适宜添加量提供了参考。

3.4 菌酶协同发酵对双低菜籽粕营养价值的影响

菌酶协同发酵能够有效提高植物蛋白质原料降解程度,缩短发酵时间,同时有效降低抗营养因子含量,改善原料的品质和营养价值。本试验结果表明,在适宜菌酶协同发酵条件下,发酵产物的营养组分得到了明显改善:粗蛋白质含量提升了18.79%,酸溶蛋白含量提升了156.39%,氨基酸含量提升了30.75%。营养组分的改善得益于微生物在利用基质过程中消耗了部分有机物,引起粗蛋白质等含量的相对增加[41]。此外,微生物代谢活动和多种酶系将双低菜籽粕中大分子物质转化为小分子物质等,也进一步提高了发酵双低菜籽粕中酸溶蛋白和氨基酸含量[42]。本试验还对发酵产物中抗营养因子的降解情况进行了分析。结果显示,协同发酵降低了硫苷、单宁和植酸含量,其中植酸降解率最高,单宁降解率最低。这可能与微生物在生命活动中产生的相关酶系对不同抗营养因子的降解能力差异有关。研究发现,通过基因工程技术将植酸酶克隆基因转化到嗜酸乳杆菌中,重组菌液的植酸酶活性可提升至984 U/mL[43]。此外,曲霉等微生物生命活动也可产生植酸酶[44]。郝文英[45]研究发现,经分离试验得到的蜡状芽孢杆菌、约翰逊不动杆菌、海泥芽孢杆菌菌液中单宁酶活性分别为14.33、22.33和15 U/mL。此外,单宁酶生产能力在屎肠球菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母和曲霉等微生物中也有发现[46]。在硫苷的降解方面,部分研究结果表明,黏质沙雷氏菌[47]、芽孢杆菌[48]等微生物发酵可促进菜籽粕中硫苷的降解,鞘鞍醇杆菌(Sphingobacterium sp.)L3X14在菜籽粕发酵过程中表现出优异的硫苷降解能力,硫苷降解率可达72.12%[49]。

4 结论

①双低菜籽粕适宜发酵菌株比例为:短小芽孢杆菌SE5∶酿酒酵母菌Sa∶乳酸乳球菌17为1∶2∶2;最佳发酵工艺条件接种量为10%、发酵时间为60 h、料液比为1∶1.0;纤维素酶、果胶酶、植酸酶和蛋白酶的适宜添加量分别为40、20、9和150 U/g。
② 在最佳发酵工艺条件下,与发酵前相比,发酵后双低菜籽粕中粗蛋白质、酸溶蛋白、氨基酸和粗脂肪含量分别提升了50.25%、13.64%、35.86%和11.55%,植酸、单宁和硫苷含量分别降低了68.08%、33.76%和40.38%。
③ 菌酶协同发酵技术通过微生物代谢活动和酶系的协同作用,提升了双低菜籽粕的营养价值,同时有效降解了抗营养因子,为双低菜籽粕原料品质提升提供了一种高效生态处理方法。

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