Effects of Chitosan on in Vitro Rumen Fermentation, Nutrient Degradation and Antioxidant Level of Dairy Cows Fed Low-Protein Diets

GUO Yongmei; WANG Jialu; DU Juan; SONG Yan; LI Jiarong; ZHANG Nan; ZHAO Yanli; GUO Xiaoyu; YAN Sumei

doi:10.12418/CJAN2026.114

2026 , Vol. 38 >Issue 2: 1447 - 1458

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2026.114

RESEARCH PAPER

Effects of Chitosan on in Vitro Rumen Fermentation, Nutrient Degradation and Antioxidant Level of Dairy Cows Fed Low-Protein Diets

GUO Yongmei ^,¹ ,
WANG Jialu ¹ ,
DU Juan ¹ ,
SONG Yan ¹ ,
LI Jiarong ¹ ,
ZHANG Nan ¹^,² ,
ZHAO Yanli ¹ ,
GUO Xiaoyu ¹ ,
YAN Sumei ^,¹^,^*

Expand

¹ Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science of Higher Education Institutions in Autonomous Region, College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China
² Inner Mongolia Shengmu High-Tech Animal Husbandry Co., Ltd., Hohhot 010000, China

^* professor, E-mail: yansmimau@163.com

Received date: 2025-07-23

Online published: 2026-02-12

Fold

Abstract

This study employed an in vitro three-step method to investigate the effects of chitosan (COS) supplementation in low-protein diets with additional rumen-protected amino acids on in vitro rumen fermentation, nutrient degradation and antioxidant level of early-lactation dairy cows. Using a single-factor completely randomized experimental design, a total of 7 groups were set up, with 6 replicates in each group. The dietary protein level in the control group (CON group) was 17.4%, and the dietary protein levels in the low-protein diets were 15.5% and 14.5%, respectively. Meanwhile, the 15.5% low-protein diet was supplemented with 0.85% rumen-protected lysine (RPLys)+0.11% rumen-protected methionine (RPMet) (P1 group), and the 14.5% low-protein diet was supplemented with 0.65% RPLys+0.13% RPMet (P2 group). Moreover, on the basis of the diets in P1 and P2 groups, 1 500 and 2 000 mg/kg COS were added, corresponding to P1C1 group and P1C2 group as well as P2C1 group and P2C2 group, respectively. The in vitro three-step simulation (rumen-abomasum-small intestine) involved 24 h ruminal degradation, followed by 1 h abomasal and 24 h intestinal incubation. The results showed as follows: 1) compared with CON group, the dry matter (DM) in vitro degradation rate in rumen in P1 group was significantly increased (P<0.05), while there were no significant differences in the in vitro degradation rates of other nutrients, in vitro rumen fermentation parameters, and antioxidant level in rumen fluid (P>0.05). 2) Compared with CON group, the in vitro degradation rates of DM and crude protein (CP) in rumen in P1C1 group were significantly increased (P<0.05); the concentrations of bacterial protein, butyric acid, isobutyric acid, valeric acid, isovaleric acid and total volatile fatty acids in rumen fluid were significantly increased (P<0.05), while the acetic acid to propionic acid ratio in rumen fluid was significantly decreased (P<0.05); meanwhile, the glutathione peroxidase activity in rumen fluid was significantly increased (P<0.05), while the malondialdehyde content in rumen fluid was significantly decreased (P<0.05). From the above, it can be known that appropriately reducing the dietary protein level and supplementing rumen-protected amino acids have no negative effects on the in vitro degradation rates of nutrients, rumen fermentation and antioxidant level in rumen fluid of dairy cows. At the same time, the COS supplementation can promote the in vitro degradation rates of DM and CP in rumen, improve the rumen fermentation and enhance the antioxidant capacity in rumen.

Key words： low-protein diets; chitosan; in vitro rumen fermentation; nutrient degradation rate; antioxidant

Cite this article

GUO Yongmei , WANG Jialu , DU Juan , SONG Yan , LI Jiarong , ZHANG Nan , ZHAO Yanli , GUO Xiaoyu , YAN Sumei . Effects of Chitosan on in Vitro Rumen Fermentation, Nutrient Degradation and Antioxidant Level of Dairy Cows Fed Low-Protein Diets[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2026 , 38(2) : 1447 -1458 . DOI: 10.12418/CJAN2026.114

当前,我国奶牛养殖业对饲料的需求量和使用量逐年增加,豆粕因含有丰富的蛋白质被作为奶牛饲粮中主要的植物蛋白质原料,但目前80%豆粕依赖进口且价格居高不下,威胁到我国粮食安全。为解决这一难题,中共中央国务院部署实施的《饲用豆粕减量替代三年行动方案》已取得突破性进展^[1]。其中,低蛋白质饲粮技术成效尤为突出,该技术通过精准调控饲粮中必需氨基酸的平衡,在保障养殖效益的同时能够降低蛋白质饲料的使用比例。相较于正常蛋白质水平的饲粮,低蛋白质饲粮具有降低饲料成本^[2-3]、减少豆粕依赖^[4]、提高畜禽生长性能^[5]以及减少氮磷排放^[6]等优势。但也有报道指出,较低蛋白质水平的饲粮会影响动物血浆皮质醇浓度,干扰活性氧(ROS)在动物体内的生成,最终影响动物体内的氧化代谢^[7]。泌乳前期是引发奶牛氧化应激的高峰期,氧化应激不仅降低奶牛生产性能,也影响其免疫功能^[8]。本课题组前期研究已经证实,处于泌乳前期的奶牛血清丙二醛(MDA)浓度显著升高,血清总抗氧化能力(T-AOC)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性均显著低于其他生长阶段的奶牛,机体抗氧化水平降低^[9]。奶牛在氧化应激状态下,体内产生的大量自由基不能被及时清除,导致脂质发生过氧化反应,引起机体抗氧化和免疫功能失调,疾病易感率升高,营养物质代谢率降低,对奶牛产奶性能和乳品质产生负面影响^[10]。因此,提高奶牛的抗氧化功能对于机体抵抗疾病至关重要。瘤胃作为奶牛主要且占比最大的消化器官,饲粮摄入后首先进入瘤胃被微生物降解和发酵,生成的营养物质被奶牛消化利用后,可直接影响奶牛的生产性能,同时也可通过饲料转化率影响牧场的经济效益^[11]。随着2025年中央一号文件^[12]的发布,在扎实推进乡村全面振兴的背景下,畜牧业应坚持绿色环保、可持续发展的理念,在低蛋白质饲粮中添加新型绿色抗氧化剂对我国畜牧业的发展具有积极作用。研究表明,饲粮添加多糖等天然抗氧化剂可以缓解奶牛氧化应激^[13]。因此,如何在低蛋白质饲粮中添加外源抗氧化剂,并在不影响奶牛瘤胃健康、营养物质降解及抗氧化防御机制的前提下,减少蛋白质原料的浪费并最大限度提高动物对蛋白质的利用率,已成为当前畜禽生产营养与应用研究领域的重要课题。

壳聚糖(chitosan,COS)是自然界唯一的一种碱性多糖,可以从海洋生物的外壳中获取,其提取工艺简单易行、数量多、来源途径广,还具备可生物降解、食用安全无毒性以及生物相容性等优点。目前,COS已在食品、医药和化工等方面应用,将其作为一种绿色添加剂应用到畜牧业中很有潜力。本课题组前期试验证实,在奶牛饲粮中添加COS可通过抑制核因子-κB(NF-κB)信号通路使诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因和蛋白表达降低,减少一氧化氮(NO)的过量生成,从而改善奶牛机体的抗氧化功能^[14]。Vendramini等^[15]研究发现,在奶牛饲粮中添加150 mg/kg COS,可提高粗蛋白质(CP)消化率。郭芸芳^[16]采用装有瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛瘤胃液进行体外发酵,随着COS添加剂量的提高,挥发性脂肪酸(VFA)浓度显著提高,氨态氮(NH₃-N)浓度相对降低。李倜宇^[17]研究发现,在饲粮中添加COS,以1 000和1 500 mg/kg的添加剂量对奶牛血清免疫球蛋白A、免疫球蛋白G和白细胞介素-2浓度以及谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和过氧化氢酶活性效果较好,同时可从NO和花生四烯酸分子途径调节奶牛的免疫功能。目前,关于COS添加剂量的相关研究主要集中在饲粮正常蛋白质水平下对奶牛营养物质降解、瘤胃发酵及抗氧化活性的影响,对COS在低蛋白质补加过瘤胃氨基酸饲粮下的应用报道较少。鉴于此,本试验利用体外三步法和体外瘤胃发酵,探究低蛋白质补加过瘤胃氨基酸饲粮中添加不同剂量COS对奶牛体外瘤胃发酵、瘤胃-皱胃-小肠营养物质降解率以及瘤胃液抗氧化水平的影响,以期为低蛋白质补加过瘤胃氨基酸饲粮中添加绿色抗氧化剂在奶牛生产中的合理应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用过瘤胃赖氨酸(RPLys)纯度为40%,过瘤胃率为80%,小肠吸收率为80%;过瘤胃蛋氨酸(RPMet)中羟基蛋氨酸异丙酯含量为40%,过瘤胃率为50%,小肠吸收率为78%;COS在20 ℃时的脱乙酰度为85.38%,分子质量≤5 000 u,pH为8.0,黏度为80 mPa·s。

1.2 瘤胃液的采集

本试验由内蒙古农业大学实验动物福利与伦理委员会审核批准,审批编号为NND2024002。试验选用3头体况、胎次和产奶量相近的健康泌乳期奶牛作为瘤胃液供体动物,于晨饲前采用瘤胃液采样器通过口腔采集瘤胃液到提前预热且充满二氧化碳(CO₂)的保温壶中,将3头奶牛的瘤胃液进行混匀,快速返回实验室后经2层纱布过滤到39 ℃并通CO₂的发酵罐中,待用。

1.3 试验设计和饲粮

试验采用单因素完全随机设计,共设置7个组,每组6个重复,其中对照组(CON组)饲粮蛋白质水平为17.4%[正常蛋白质,依据NASEM(2021)《奶牛营养需要》];低蛋白质饲粮蛋白质水平分别为15.5%和14.5%,并分别添加过瘤胃氨基酸,其中15.5%低蛋白质饲粮添加0.85% RPLys+0.11% RPMet(P1组),14.5%低蛋白质饲粮添加0.65% RPLys+0.13% RPMet(P2组);同时,在P1组和P2组饲粮的基础上,分别添加1 500和2 000 mg/kg COS,其中,P1组分别对应P1C1组和P1C2组,P2组分别对应P2C1组和P2C2组。1 500 mg/kg COS的添加剂量参考本课题组前期研究结果^[14]。饲粮组成及营养水平见表1,其中饲粮干物质(DM)、CP、粗脂肪(EE)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、钙和磷含量分别参照GB/T 6435—2014、GB/T 6432—2018、GB/T 6433—2006、GB/T 20806—2022、NY/T 1459—2022、GB/T 6436—2018和GB/T 6437—2018中方法进行测定,泌乳净能参考《奶牛饲养标准》(NY/T 34—2004)进行计算。

表1 饲粮组成及营养水平(干物质基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of diets (DM basis) %

项目 Items	饲粮蛋白质水平Dietary protein levels/%
项目 Items	17.4	15.5	14.5
原料Ingredients
玉米青贮Corn silage	23.20	24.73	28.83
苜蓿Alfalfa	13.00	10.07	4.00
燕麦草Oat grass	3.80	5.30	7.27
玉米粉Corn flour	32.93	36.93	38.23
豆饼粉Soybean cake flour	13.82	8.60	6.80
葵饼Sunflower cake	9.10	10.22	10.72
预混料Premix¹⁾	2.65	2.65	2.65
小苏打NaHCO₃	1.00	1.00	1.00
食盐NaCl	0.50	0.50	0.50
合计Total	100.00	100.00	100.00
额外添加Additional
过瘤胃赖氨酸RPLys		0.85	0.65
过瘤胃蛋氨酸RPMet		0.11	0.13
营养水平Nutrient levels²⁾
泌乳净能NE_L/(MJ/kg)	6.65	6.65	6.65
粗蛋白质CP	17.74	15.80	14.77
粗脂肪EE	4.23	4.66	3.92
中性洗涤纤维NDF	34.49	35.91	31.53
酸性洗涤纤维ADF	15.67	14.69	15.05
钙Ca	1.17	1.18	1.23
磷P	0.44	0.41	0.39

	1)每千克预混料含有 One kilogram of the premix contained the following:VA 600 000 IU,VD 240 000 IU,VE 3 000 IU,Fe 2 250 mg,Cu 600 mg,Zn 4 500 mg,Mg 1 500 mg,I 150 mg,Se 18 mg,Co 30 mg。
	2)泌乳净能为计算值,其他为实测值。NE_L was a calculated value, while the others were measured values.

1.4 体外缓冲液和培养液的配制

参考杜霞^[18]的方法配制营养物质降解缓冲液。将400 mL瘤胃液加入至由1 330 mL缓冲液A和266 mL缓冲液B配制成的混合液中,得到体外模拟瘤胃液。将2 g胃蛋白酶(P110928,Aladdin)溶于2 L的pH为1.9的盐酸溶液中,得到体外模拟皱胃液。称取9.47 g Na₂HPO₄于烧杯中,用蒸馏水溶解,定容至1 000 mL;再称取9.08 g KH₂PO₄于烧杯中,用蒸馏水溶解,定容至1 000 mL,将2种溶液以915∶85比例混匀,得到磷酸盐缓冲液(pH=7.75)。将3 g胰酶(P110505,Aladdin)和1 mL细菌生长抑制剂(0.5%氯霉素溶液)溶于1 L磷酸盐缓冲液中,得到体外模拟小肠液。

参考Menke等^[19]的方法配制体外瘤胃发酵缓冲液,始终39 ℃水浴,并持续通入CO₂备用。

1.5 测定指标和方法

1.5.1 瘤胃体外营养物质降解率

称取6 g发酵底物放入已标号恒重后的尼龙袋中,用尼龙线封口。向4个发酵罐中分别加入1 330 mL缓冲液A和266 mL缓冲液B后,放入6个装有饲粮样品的尼龙袋和1个空白尼龙袋,将样品尼龙袋平均放置在分隔板的两侧,39 ℃水浴加热且持续通入CO₂ 20~30 min。量取400 mL过滤后的瘤胃液倒入装有缓冲液的发酵罐中,混匀,该过程全程通入CO₂,使发酵罐处于厌氧环境,在39 ℃连续培养24 h。培养结束后取出尼龙袋,立即用大量自来水冲洗,直至洗涤液澄清。将洗干净的尼龙袋65 ℃烘干至恒重,测定并计算发酵底物经瘤胃降解后残渣的瘤胃体外DM、CP、EE、NDF、ADF和有机物(OM)降解率,其中粗灰分(Ash)含量参照GB/T 6438—2007中方法测定,并计算OM含量;NDF和ADF含量参考Van Soest等^[20]的方法,采用ANKOM纤维分析仪进行测定。

体外某营养物质降解率计算公式如下:

体外某营养物质降解率(%)=100×(降解前

发酵底物该营养物质含量-发酵底物降

解后残渣中该营养物质含量)/降解前发酵底物该营养物质含量。

1.5.2 皱胃-小肠体外营养物质降解率

提前39 ℃预热体外模拟皱胃液和小肠液,将体外瘤胃培养结束后的残渣尼龙袋挤出多余的瘤胃液,重新置于体外模拟皱胃液,39 ℃恒温培养1 h。培养结束后弃掉胃液,用自来水冲洗干净尼龙袋后再重新置于模拟小肠液的发酵罐中,39 ℃恒温培养24 h后,取出尼龙袋用自来水冲洗至洗涤液澄清。将洗干净的尼龙袋65 ℃烘干至恒重,测定并计算经皱胃-小肠降解后残渣的体外DM、OM、CP和EE降解率。

1.5.3 瘤胃-皱胃-小肠体外营养物质降解率

依据饲粮营养物质在瘤胃和皱胃-小肠的体外降解率计算瘤胃-皱胃-小肠体外DM、CP、EE和OM降解率。

1.5.4 体外瘤胃发酵参数

准确称取1 g发酵底物于体积为100 mL的培养瓶中,备用。将经纱布过滤后的瘤胃液与配好且通入CO₂的Menke缓冲液以1∶2的比例混合,使用连续分液器分装到通CO₂的培养瓶中,培养体系体积为60 mL,该步骤全程通入CO₂,保证厌氧环境。分装完成后迅速盖好瓶塞,连接到AGRS-Ⅲ型64通路微生物发酵微量装置,39 ℃连续培养24 h后,将发酵瓶从培养的环境中置于冰上进行冷却,终止发酵。

瘤胃发酵液pH采用手持便携式pH计测定;采用血细胞计数板法^[21]进行原虫计数;NH₃-N浓度采用比色法^[22]进行测定;菌体蛋白(BCP)浓度采用考马斯亮蓝法测定;采用气相色谱仪(岛津GC-2014)测定VFA浓度^[21],并计算总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度和乙酸/丙酸值。

1.5.5 体外瘤胃液抗氧化水平

将体外发酵后的瘤胃液移取2 mL于离心管中,向瘤胃液加入研磨钢珠,用组织研磨仪匀浆1 min,再经4 ℃、1 566×g离心15 min后,取上清液待用。采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定T-SOD、GPx活性和T-AOC以及MDA含量,测定步骤按照试剂盒随附说明书进行;自由基清除率采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法测定。

1.6 数据统计分析

试验数据采用Excel 2021进行初步整理和计算,然后采用SAS 9.0软件进行单因素方差分析和Duncan氏多重比较,结果数据采用平均值和均值标准误(SEM)表示,P<0.05表示差异显著,0.05≤P<0.10表示差异趋于显著。

2 结果

2.1 COS在低蛋白质饲粮下对奶牛体外营养物质降解率的影响

2.1.1 瘤胃体外营养物质降解率

由表2可知,与CON组相比,除P2C1组瘤胃体外DM降解率无显著差异(P>0.05)外,其他试验组体外DM降解率均显著提高(P<0.05);其中,以P1组、P1C1组和P1C2组较高,尤以P1C1组最高,显著高于P2组、P2C1组和P2C2组(P<0.05);同时,P1组、P1C1组和P1C2组间体外DM降解率无显著差异(P>0.05)。P1C1组体外CP降解率显著高于CON组、P2组、P2C1组和P2C2组(P<0.05);P1组和P1C2组体外CP降解率与CON组相比数值上有所升高,但差异不显著(P>0.05)。与CON组相比,P1组、P1C1组和P1C2组体外EE和NDF降解率差异不显著(P>0.05),但均显著高于P2组、P2C1组和P2C2组(P<0.05)。各组间体外ADF降解率均无显著差异(P>0.05)。CON组和P1组体外OM降解率显著高于P2C1组和P2C2组(P<0.05),与P2组、P1C1组和P1C2组相比有升高趋势,但差异不显著(P>0.05)。

表2 COS在低蛋白质饲粮下对奶牛瘤胃体外营养物质降解率的影响

Table 2 Effects of COS on in vitro nutrient degradation rates in rumen of dairy cows fed low-protein diets %

项目 Items	干物质 DM	粗蛋白质 CP	粗脂肪 EE	中性洗涤纤维 NDF	酸性洗涤纤维 ADF	有机物 OM
组别Groups
CON	71.64^d	67.99^b	72.68^a	51.49^a	33.89	75.10^a
P1	75.10^ab	68.29^ab	73.25^a	50.93^a	32.33	75.39^a
P2	73.73^bc	67.60^b	65.63^b	40.59^b	31.93	73.77^ab
P1C1	75.58^a	70.83^a	74.93^a	50.22^a	33.74	73.71^ab
P1C2	74.76^abc	69.52^ab	73.63^a	48.24^a	33.69	73.40^ab
P2C1	73.16^cd	67.39^b	66.14^b	41.02^b	32.80	71.41^b
P2C2	73.64^bc	66.90^b	66.63^b	39.85^b	33.51	71.64^b
均值标准误SEM	0.534	0.842	1.572	1.507	2.132	0.810
P值P-value	<0.001	0.033	<0.001	<0.001	0.991	0.007

	同列数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05),不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。
	In the same column, values with no letter or the same letter superscripts indicated no significant differences (P>0.05), while with different letter superscripts indicated significant differences (P<0.05). The same as below.

2.1.2 皱胃-小肠体外营养物质降解率

由表3可知,各组间皱胃-小肠体外DM、CP、EE和OM降解率均无显著差异(P>0.05),但P1C1组体外DM、CP和OM降解率在各试验组中较高。

表3 COS在低蛋白质饲粮下对奶牛皱胃-小肠体外营养物质降解率的影响

Table 3 Effects of COS on in vitro nutrient degradation rates in abomasum-small intestine of dairy cows fed low-protein diets %

项目Items	干物质DM	粗蛋白质CP	粗脂肪EE	有机物OM
组别Groups
CON	23.52	86.02	31.22	27.35
P1	23.33	85.80	29.58	27.79
P2	20.64	83.85	30.89	23.13
P1C1	23.22	86.70	30.02	25.10
P1C2	20.20	85.17	30.50	24.09
P2C1	21.44	84.11	30.80	23.85
P2C2	20.61	83.97	30.61	22.54
均值标准误SEM	1.671	1.088	3.026	2.661
P值P-value	0.605	0.386	0.100	0.740

2.1.3 瘤胃-皱胃-小肠体外营养物质降解率

由表4可知,各组间瘤胃-皱胃-小肠体外DM、CP、EE和OM降解率均无显著差异(P>0.05)。

表4 COS在低蛋白质饲粮下对奶牛瘤胃-皱胃-小肠体外营养物质降解率的影响

Table 4 Effects of COS on in vitro nutrient degradation rates in rumen-abomasum-small intestine of dairy cows fed low-protein diets %

项目Items	干物质DM	粗蛋白质CP	粗脂肪EE	有机物OM
组别Groups
CON	79.73	95.25	79.14	78.90
P1	79.29	95.31	79.86	80.29
P2	79.20	95.18	79.19	80.08
P1C1	79.34	95.24	79.99	79.23
P1C2	79.06	95.19	75.26	79.08
P2C1	78.83	93.94	79.11	79.66
P2C2	79.12	94.77	76.85	80.94
均值标准误SEM	0.339	0.428	1.658	0.657
P值P-value	0.668	0.269	0.367	0.300

2.2 COS在低蛋白质饲粮下对奶牛体外瘤胃发酵参数的影响

由表5可知,与CON组相比,P2组、P1C2组、P2C1组和P2C2组瘤胃液pH均显著提高(P<0.05),P1C1组瘤胃液BCP浓度显著提高(P<0.05);各组间瘤胃液NH₃-N浓度和原虫数量无显著差异(P>0.05)。

表5 COS在低蛋白质饲粮下对奶牛体外瘤胃发酵参数的影响

Table 5 Effects of COS on in vitro fermentation parameters in rumen of dairy cows fed low-protein diets

项目 Items	pH	菌体蛋白 BCP/(mg/dL)	氨态氮 NH₃-N/(mg/dL)	原虫 Protozoa/(×10⁴个/mL)
组别Groups
CON	6.17^d	40.98^b	20.04	6.28
P1	6.21^d	43.32^ab	19.77	6.08
P2	6.37^ab	42.13^ab	19.58	5.75
P1C1	6.23^cd	43.81^a	19.72	4.05
P1C2	6.31^bc	42.30^ab	19.41	5.37
P2C1	6.39^a	42.97^ab	19.43	6.80
P2C2	6.39^a	42.72^ab	19.08	5.67
均值标准误SEM	0.023	0.558	0.683	0.846
P值P-value	<0.001	0.037	0.973	0.412

2.3 COS在低蛋白质饲粮下对奶牛体外瘤胃液VFA浓度的影响

由表6可知,与CON组相比,P1组、P1C1组和P1C2组瘤胃液乙酸浓度无显著差异(P>0.05),其他试验组瘤胃液乙酸浓度均显著降低(P<0.05)。P1C1组瘤胃液丙酸浓度较CON组有升高趋势(P>0.05),较其他试验组显著提高(P<0.05)。P1C2组瘤胃液异丁酸浓度显著高于其他组(P<0.05),且P1组浓度最低。P1C1组和P1C2组瘤胃液丁酸浓度显著高于其他组(P<0.05),且P1C1组在数值上大于P1C2组(P>0.05);P1组和P2组瘤胃液丁酸浓度与CON组对比差异不显著(P>0.05)。瘤胃液异戊酸、戊酸和TVFA浓度以P1C1组和P1C2组较高,均显著高于其他组(P<0.05)。P1组和P2C2组瘤胃液异戊酸浓度较低,但与CON组和P2组相比无显著差异(P>0.05),而显著低于P1C1组、P1C2组和P2C1组(P<0.05)。P2C2组瘤胃液戊酸浓度显著低于其他组(P<0.05)。CON组和P1组瘤胃液乙酸/丙酸值显著高于除P2C2组外的其他组(P<0.05)。

表6 COS在低蛋白质饲粮下对奶牛体外瘤胃液VFA浓度的影响

Table 6 Effects of COS on VFA concentration in vitro rumen fluid of dairy cows fed low-protein diets

项目 Items	乙酸 Acetic acid/ (mmol/L)	丙酸 Propionic acid/ (mmol/L)	异丁酸 Isobutyric acid/ (mmol/L)	丁酸 Butyric acid/ (mmol/L)	异戊酸 Isovaleric acid/ (mmol/L)	戊酸 Valeric acid/ (mmol/L)	总挥发性脂肪酸 TVFA/ (mmol/L)	乙酸/丙酸 Acetic acid/ propionic acid
组别Groups
CON	48.95^a	22.09^ab	0.53^de	13.26^b	1.37^bc	1.81^b	82.70^b	2.06^ab
P1	47.80^a	20.71^bc	0.48^e	13.92^b	1.11^c	1.98^b	85.39^b	2.09^a
P2	37.54^b	19.20^bc	0.73^cd	12.14^bc	1.38^bc	1.89^b	72.69^b	1.95^c
P1C1	50.08^a	23.62^a	0.95^b	16.97^a	1.83^a	2.27^a	97.84^a	2.00^c
P1C2	49.88^a	20.11^bc	1.16^a	16.50^a	2.13^a	2.36^a	93.10^a	1.98^c
P2C1	38.54^b	18.73^bc	0.76^bc	10.94^c	1.49^b	1.84^b	72.95^b	1.99^c
P2C2	34.05^b	16.80^c	0.60^cde	8.63^d	1.14^c	1.56^c	62.78^c	2.00^bc
均值标准误SEM	2.223	1.191	0.067	0.624	0.106	0.080	1.639	0.020
P值P-value	<0.001	0.005	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001

2.4 COS在低蛋白质饲粮下对奶牛体外瘤胃液抗氧化水平的影响

由表7可知,与CON组相比,P1C1组和P1C2组瘤胃液GPx活性显著提高(P<0.05),且以P1C1组最高;其他试验组瘤胃液GPx活性无显著差异(P>0.05)。与CON组相比,P1C1组瘤胃液T-SOD活性有升高趋势(P>0.05);同时,P1C1组瘤胃液T-SOD活性显著高于P2组、P2C1组和P2C2组(P<0.05),与P1组和P1C2组相比无显著差异(P>0.05)。P2C2组瘤胃液T-AOC显著低于其他各组(P<0.05),且其他组间无显著差异(P>0.05)。与CON组相比,P1组和P2组瘤胃液MDA含量无显著差异(P>0.05),P1C1组、P1C2组、P2C1组和P2C2组瘤胃液MDA含量均显著降低(P<0.05)。与CON组相比,P2组、P2C1组和P2C2组瘤胃液DPPH自由基清除率显著降低(P<0.05),其他试验组瘤胃液DPPH自由基清除率无显著差异(P>0.05)。

表7 COS在低蛋白质饲粮下对奶牛体外瘤胃液抗氧化水平的影响

Table 7 Effects of COS on antioxidant level in vitro rumen fluid of dairy cows fed low-protein diets

项目 Items	谷胱甘肽过氧化物酶 GPx/(U/ mg prot)	总超氧化物歧化酶 T-SOD/ (U/mg prot)	总抗氧化能力 T-AOC/ (U/mg prot)	丙二醛 MDA/(nmol/ mg prot)	DPPH自由基清除率 DPPH free radical scavenging rate/%
组别Groups
CON	17.25^c	0.18^ab	0.51^a	5.73^a	0.27^a
P1	18.30^bc	0.18^ab	0.51^a	5.46^ab	0.28^a
P2	17.69^bc	0.17^bc	0.50^a	5.79^a	0.18^c
P1C1	23.76^a	0.23^a	0.52^a	4.12^c	0.29^a
P1C2	22.12^ab	0.20^ab	0.50^a	4.42^c	0.26^ab
P2C1	21.63^abc	0.12^cd	0.53^a	4.43^c	0.23^b
P2C2	21.41^abc	0.11^d	0.44^b	4.89^c	0.14^d
均值标准误SEM	1.472	0.016	0.011	0.252	0.014
P值P-value	0.023	<0.001	0.040	<0.001	<0.001

3 讨论

3.1 COS在低蛋白质饲粮下对奶牛体外营养物质降解率的影响

反刍动物对饲粮的消化吸收可以通过微生物对营养物质的降解情况来体现,DM、CP、NDF和ADF降解率是评价营养物质降解率的重要指标^[23]。DM降解率是影响干物质采食量的一个重要因素,与饲粮消化能力成正比。本试验利用体外三步法(瘤胃-皱胃-小肠)研究得出,与CON组相比,除瘤胃体外DM降解率外,低蛋白质补加过瘤胃氨基酸饲粮的P1组体外营养物质降解率均无显著差异;除瘤胃体外DM、EE和NDF降解率外,P2组其他体外营养物质降解率也均无显著差异,这表明降低饲粮蛋白质水平并补充过瘤胃氨基酸对奶牛体外营养物质降解几乎无负面影响。此外,低蛋白质补加过瘤胃氨基酸饲粮添加COS的各试验组瘤胃体外DM降解率与CON组相比均有所提高,且以P1C1组最高,表明添加COS有利于提高DM降解率;同时,P1C1组和P1C2组瘤胃体外CP降解率高于CON组和P1组,表明添加COS具有提高CP降解率的趋势,可为瘤胃微生物提供丰富的氮源,间接为反刍动物提供更多的BCP。赵浩翔^[24]在奶牛体外瘤胃降解试验中发现,在饲粮中添加0.15% COS能够显著提高DM和CP降解率;研究表明,在饲粮中添加150 mg/kg COS不影响奶牛干物质采食量,并且提高了CP消化率^[25];在Araújo等^[26]的奶牛试验中,饲粮添加50、100和150 mg/kg COS对干物质采食量无显著影响,但提高了CP表观消化率,本试验研究结果与上述研究结果相似。本试验中,COS添加组瘤胃体外EE、NDF、ADF和OM降解率与对应低蛋白质补加过瘤胃氨基酸饲粮组相比均无显著差异;但对比不同添加剂量的COS发现,2 000 mg/kg COS组体外NDF和ADF降解率比1 500 mg/kg COS组更低,其原因可能是添加COS剂量过多,会影响瘤胃对纤维的消化程度^[27]。结合瘤胃-皱胃-小肠体外营养物质降解率的变化规律可知,在低蛋白质补加过瘤胃氨基酸饲粮中添加COS不仅不会对营养物质降解产生负面影响,还可一定程度上提高瘤胃体外DM和CP降解率,且选择添加1 500 mg/kg COS效果较好。值得注意的是,本研究在利用体外三步法测定营养物质降解率的过程中,可能会受尼龙袋的影响,在瘤胃降解以及皱胃-小肠消化后都需要用大量自来水冲洗尼龙袋降温,使其中止发酵,这可能会造成尼龙袋内残渣的损失以及营养物质的流失,使得测得的降解率偏高。

3.2 COS在低蛋白质饲粮下对奶牛体外瘤胃发酵参数的影响

稳定的瘤胃内环境是保障反刍动物发挥正常生理功能的基础,不仅关系着营养物质的消化吸收,还反映动物的健康状况。pH呈弱酸性可为瘤胃微生物提供良好的场所,正常的瘤胃pH为5.5~7.5,本试验各组瘤胃液pH(6.17~6.39)均在正常范围内,说明添加COS不会影响瘤胃内环境。NH₃-N和BCP是瘤胃发酵的重要指标,可反映饲粮中能被降解的蛋白质含量和微生物合成蛋白质的情况。体外研究表明,在绵羊饲粮中添加1 500 mg/kg COS,随着发酵时间的延长,瘤胃液NH₃-N浓度逐渐降低^[28]。另有研究发现,在肉牛饲粮中添加2 000 mg/kg COS可使瘤胃液NH₃-N浓度降低^[29]。本试验结果发现,各组间瘤胃液NH₃-N浓度虽无显著差异,但与CON组相比,各试验组瘤胃液NH₃-N浓度在数值上均有所降低;同时,与CON组相比,P1C1组瘤胃液BCP浓度显著提高,其他各试验组瘤胃液BCP浓度在数值上有升高的趋势,这表明在低蛋白质(15.5%)补加过瘤胃氨基酸饲粮中添加1 500 mg/kg COS,可在一定程度上使瘤胃微生物充分利用饲粮中的蛋白质,更有利于氮源的利用。

VFA是由碳水化合物经瘤胃发酵后得到的最终产物,其中乙酸、丙酸和丁酸是反映瘤胃发酵的重要指标。鞠九洲^[28]在绵羊饲粮中添加COS,结果显示不同时间点体外瘤胃液的乙酸、丁酸浓度以及乙酸/丙酸值均显著降低,而丙酸浓度显著提高。张婕等^[30]研究表明,在奶牛饲粮中添加COS,随着COS添加剂量的提高丙酸浓度显著提高,乙酸/丙酸值显著降低。本试验中,与CON组相比,低蛋白质(15.5%)补加过瘤胃氨基酸饲粮中添加1 500 mg/kg COS显著提高体外发酵瘤胃液丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和TVFA浓度,有提高瘤胃液丙酸浓度的趋势,同时显著降低瘤胃液乙酸/丙酸值,表明COS可提高能量利用效率,促进碳水化合物的分解,改变瘤胃发酵模式且具有一定的促进作用。

3.3 COS在低蛋白质饲粮下对奶牛体外瘤胃液抗氧化水平的影响

ROS是由机体在正常代谢和某些细胞群体抵御疾病的过程中产生的,ROS的产生与生物体抗氧化防御能力之间的不平衡会诱发机体氧化应激,使脂质和其他大分子过氧化损伤,破坏DNA和蛋白质,进而导致多种疾病的发生。当激活细胞内的特定信号通路时可抑制氧化应激,从而维持细胞的稳态。超氧化物歧化酶(SOD)是对抗氧自由基的最佳生理防御工具,可将机体产生的自由基清除,抑制机体脂质过氧化的发生。MDA是脂质过氧化物的生成产物,是代表细胞损伤的指标之一。SOD、GPx等抗氧化酶在体内活性的提高以及MDA含量的降低均表明机体抗氧化能力增强。商常发等^[31]在患有乳房炎的奶牛饲粮中添加COS发现,血清SOD活性显著提高,血清MDA含量显著降低,表明COS提高了乳房炎奶牛的抗氧化能力,血清自由基代谢得到改善,并且促进了奶牛乳房炎的康复。研究表明,在辽宁绒山羊饲粮中添加500 mg/kg COS可降低血清MDA含量^[32]。本课题组前期研究表明,在奶牛饲粮中添加0.1% COS可增强血清SOD活性和T-AOC,对奶牛抗氧化能力具有显著的促进作用^[33-34]。在李倜宇^[17]的研究中也有类似的报道,随着奶牛饲粮中COS添加剂量的提高,血清GPx活性显著升高,血清MDA含量显著降低。瘤胃在消化营养物质的过程中,自由基也会对消化道组织造成损伤,瘤胃液是反刍动物主要的消化液,其中含有抗氧化物质。本试验结果表明,在低蛋白质补加过瘤胃氨基酸饲粮中添加COS能够提高体外瘤胃液GPx活性,降低MDA含量,且以1 500 mg/kg添加剂量效果较好;而低蛋白质补加过瘤胃氨基酸饲粮组体外瘤胃液GPx、T-SOD活性和T-AOC以及MDA含量与CON组相比无显著差异,这说明降低饲粮蛋白质水平并补充过瘤胃氨基酸并不会影响奶牛瘤胃液抗氧化水平,且以降低饲粮蛋白质水平至15.5%时较好。综上所述,在低蛋白质补加过瘤胃氨基酸饲粮中添加COS能在一定程度上增强奶牛瘤胃液的抗氧化能力,但关于COS提高机体抗氧化能力的分子机制,还需要进一步探讨。

4 结论

适当降低饲粮蛋白质水平并补充过瘤胃氨基酸对奶牛体外营养物质降解、瘤胃发酵和瘤胃液抗氧化水平均没有负面影响,因此适当降低饲粮蛋白质水平并补加过瘤胃氨基酸是可行的。同时,在低蛋白质补加过瘤胃氨基酸饲粮中添加1 500 mg/kg COS可在一定程度上促进瘤胃体外DM和CP降解,对瘤胃-皱胃-小肠体外降解无不利影响,并可改善奶牛瘤胃发酵,提升瘤胃抗氧化能力。

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