鸡蛋作为人们日常膳食中必不可少的一种动物性蛋白质来源[1],因价廉物美,广受消费者青睐。鸡蛋的销售方式主要是鲜销,因而消费者购买鲜蛋时在追求鸡蛋营养和风味需求的同时会注重鸡蛋的外观品质,如蛋壳色泽、蛋壳质量等[2-3],其中蛋壳表面是否有暗斑亦成为消费者挑选的重要依据之一[4]。据调研发现,商超所售鸡蛋暗斑平均发生率为20%~40%,且在夏季时暗斑发生率近46%[5]。出现暗斑的鸡蛋不仅遭到重视蛋壳外观的消费者“嫌弃”,同时会影响鸡蛋生产者和销售商的经济效益,尤其是当前蛋鸡产业进入微利时代,解析蛋壳暗斑产生的原因及探究降低其发生率的方法对蛋鸡养殖行业的健康发展意义重大。尽管国际上就鸡蛋暗斑成因、评价方法及其对蛋品质影响等方面已开展了广泛的研究,但是暗斑形成机理尚无定论,且近些年对暗斑评价方法和营养调控提出了新的解决方案。因此,本文将对暗斑形成原因、评价方法、暗斑对蛋品质的影响及其营养调控措施的研究进展进行系统阐述和归纳,旨在增加人们对暗斑的深入认识,为调控鸡蛋蛋壳暗斑的研究与应用提供参考。
1 蛋壳暗斑的成因
暗斑的成因最初被认为是由蛋壳内水分含量不同直接导致的。出现暗斑的鸡蛋蛋壳干燥后,暗斑会逐渐消失,再将干燥的蛋壳浸入水中,暗斑会重新出现在原位置[6]。对蛋壳水分含量检测发现,暗斑蛋壳水分含量(2.18%)确实比正常蛋壳水分含量(1.25%)高。进一步分析发现,相比正常蛋壳,暗斑蛋壳中较高的基质蛋白含量降低了蛋壳的水蒸气交换效率,造成水分积聚在蛋壳中产生暗斑[11]。随着对蛋壳超微结构的深入观察,发现暗斑的产生与蛋壳乳突层的结构异常相关。相比无暗斑蛋壳,暗斑蛋壳的乳突层厚度显著增加且蛋壳乳突排列稀疏,乳突空隙较大,这样加快了蛋壳内水分的散失,当蛋壳内水分散失速度大于蛋壳表面水分蒸发速度时,水分就会在蛋壳中贮存,引起蛋壳水分含量增加,当光通过含水率较高的区域时改变了光的折射率及反射率以呈现出暗斑[4,12-13]。除了乳突分布,乳突的形态也影响着乳突的结构变化[14]。在蛋壳形成时,暗斑蛋壳易出现早期乳突核心的变异,乳突融合晚,乳突核心处向四周额外钙化、乳突呈现球状钙化B型乳突小体,进而减少其与蛋壳膜的接触面积,允许更多水分的贮存,因而增加了光的穿透形成暗斑[15-16]。鸡蛋蛋壳膜结构的变化亦与暗斑的形成相关。相比正常蛋壳,暗斑蛋壳壳下膜的蛋白分泌不够,引起壳下膜厚度变薄,进而增大了纤维网间空隙,壳下膜结构变得疏松,降低了蛋壳壳下膜的阻水性能,这就导致蛋内水分更易通过该膜渗透入蛋壳石灰质硬壳层中,增加了蛋壳光的透射率,最终逐渐形成暗斑[17-18]。此外,蛋壳孔隙的形态与暗斑的形成有关。通过微型计算机断层扫描技术重建蛋壳的三维显微结构,发现孔隙狭窄、非球形,并存在很多分支,可能会造成孔内水分滞留时间延长,降低水蒸气交换效率,进而促成暗斑的形成[19]。总而言之,蛋壳暗斑可能是蛋壳膜、乳突层、蛋壳孔隙等结构变异造成的(图1),这势必与蛋壳矿化过程异常相关,特别是钙的代谢。通过检测蛋壳钙含量发现,暗斑蛋壳中钙含量显著低于正常蛋壳[13,20],推测钙在暗斑蛋形成过程中起到一定的作用。而子宫、肠道是蛋壳矿化时机体进行钙代谢的重要靶器官。苏木精-伊红(HE)染色分析发现,产暗斑蛋壳的子宫黏膜上皮细胞明显缺损、纤毛缺失、上皮组织完整性变差,进一步采用转录组学分析发现,子宫黏膜组织中补体激活、白细胞介素1细胞反应等与应激、免疫相关代谢通路发生了异常[21]。就肠道而言,产暗斑蛋蛋鸡的十二指肠中钙结合蛋白D28k(CaBP-D28k)、谷胱甘肽S-转移酶Alpha3(GSTA3)表达下调[22],空肠和回肠中三磷酸腺苷酶活性、空肠中谷胱甘肽过氧化物酶和脂肪酶活性显著降低[23],肠道功能减退,影响钙的吸收转运,进而影响蛋壳矿化过程,增加暗斑形成的几率。
2 蛋壳暗斑的变化规律和评价方法
事实上,鸡蛋刚产出后的数小时内晶莹透亮,并未出现暗斑[6],但随放置时间的推移,暗斑变得明显且增多[24]。王德贺等[8]在刚产的鸡蛋中未观察到暗斑,待鸡蛋存放2~3 d后通过照蛋能看到暗斑,7 d后肉眼可以清楚分辨。付良等[4]研究发现,鸡蛋在产出后24 h左右才形成暗斑,较小的暗斑会在第3天开始减少,且在第20天左右显著减少。高绪莉等[25]观察到,产出后2 h的鸡蛋表面开始出现暗斑,暗斑发生高峰期为4~12 h,加重期为12 h~3 d,而3 d后正常蛋不再形成暗斑。张名凯等[26]同样发现,暗斑最快是产蛋后2 h出现,最晚是4 d,其中暗斑发生高峰期在16~24 h。类似地,霍学婷等[27]发现,在产出后24 h内暗斑的产生量呈直线上升趋势,然而该学者在刚产出的鸡蛋就观察到了少量暗斑,这与刚产出的鸡蛋没有暗斑这一观点相矛盾,推测跟蛋鸡的饲养环境和周龄差有关,具体原因尚不明了。以上研究结果共同点是暗斑蛋随时间的变化有增加的趋势,但暗斑形成和变化的时间段并不一致,这种现象的产生与蛋鸡品种和周龄、蛋鸡健康水平、鸡蛋储存环境和条件等因素均有着密不可分的关系。
蛋壳的暗斑数量和大小均变异很大,且其在蛋壳上的分布没有规律可循。大部分研究将暗斑视为数量性状,且从这个角度对暗斑的严重程度进行观察和人工分级。人工分级的标准各不相同,从3级到6级不等(表1)。最初Holst等[6]通过专门制作的蜡烛机拍照观察,随后观察主要采取在暗室里用小型手电筒式照蛋器照射鸡蛋。这种评价方法对于评价人员来说耗时耗力,且受主观影响较大,因而难以精准、客观地评价蛋壳暗斑的情况。近年来,相关研究不断探索了基于参数计算暗斑总面积占蛋壳总面积的比例来评价暗斑的方法,包括灰度识别法和自动识别法。灰度识别法是在暗室中用LED灯从鸡蛋锐端发射光源,穿透整个鸡蛋,并用数码相机拍摄鸡蛋照片,随后再用画图软件打开图片后计算鸡蛋的长度和宽度,再使用Photoshop软件对图像中的暗斑点进行手动变暗以区别背景噪音,统计暗斑的面积,再计算暗斑比例[28]。该方法尽管将暗斑评价从主观评价转变为客观定量评价,但仍需要人工操作且过程复杂。自动识别法同样需要先获得暗斑鸡蛋图像,然后采用ImageJ软件进行图像输入、图像预处理、训练特征、随机森林模型构建、预测和输出,其中训练特征输出的结果作为模型构建的标准,将这些提取的特征用来创建决策树,在随机森林算法中选择图像中的暗斑来计算暗斑比例[19,29]。该方法实现了对暗斑的全自动客观评价,为暗斑表型精准测量的深入研究奠定了坚实基础。当前市场上也发布了一款基于云识别计算暗斑的数字化蛋壳蛋斑评定仪(Mottled Eggs-1A,ORKA,以色列),为暗斑的全自动客观评价提供了便利。
表1 暗斑评价方法Table 1 Assessment methods for dark spots |
| 等级Grades | 文献Literature | 分级标准Grading standards |
|---|---|---|
| 3级 Level 3 | Host等[6] | 1级:蛋壳上几乎不存在暗斑或仅有少量暗斑,暗斑面积占比<10%; 2级:蛋壳上有较多较小的半透明斑点,暗斑面积占比10%~50%; 3级:蛋壳上出现大面积且较大的片状的暗斑,面积占比50%~80% |
| 4级 Level 4 | Wang等[28] | 1级:光源照射蛋壳透光均匀,肉眼观察不到暗斑点;2级:光源 照射时蛋壳有较多较小的暗斑或有零星较大的暗斑点,且肉眼 观察能看到暗斑点;3级:光源照射时蛋壳表面有较多较大的暗斑点, 且肉眼可以观察到暗斑点;4级:光源照射时有较多较大的暗斑点 连成一片,且肉眼可以看到较大的暗斑区域 |
| 5级 Level 5 | 张铭凯[30] | 1级:光源照射蛋壳透光均匀,无透光过强的点或区域;2级:光源照射蛋壳 透光均匀,有零星点状透光过强部位,透光点分布不均匀且直径小于 1 mm;3级:光源照射蛋壳透光均匀,有点状透光过强部位,透光点在蛋壳表 面均匀分布且直径小于1 mm;4级:蛋壳表面有零星水印状斑点,光源照射 蛋壳有大量点状透光过强部位,且透光点小于1 mm或少量大型透光区域且透光 区域直径大于1 mm;5级:蛋壳表面有明显水印斑点,光源照射蛋壳表面 有均匀分布的透光区域,且透光区域直径大于1 mm |
| 6级 Level 6 | 孙得发等[9] | 1级:光源照射蛋壳表面分布极少细微亮点且室光下无暗斑;2级:光源照射蛋壳 表面分布少量细微亮点且室光下无暗斑;3级:光源照射蛋壳表面分布较多 细微亮点且室光下无暗斑;4级:光源照射蛋壳表面分布大量细微亮点且室光下 有少量暗斑;5级:光源照射蛋壳表面密布细微亮点及大亮点且室光下有较多暗斑; 6级:光源照射蛋壳表面各种亮点和大量暗斑密布 |
3 蛋壳暗斑对蛋品质的影响
目前,关于暗斑是否对常规蛋品质有影响的看法不一。聂伟[13]、姜明君[20]研究表明,暗斑蛋的蛋壳强度、蛋壳比例、蛋黄颜色、蛋白高度等蛋品质指标与正常鸡蛋比较均无显著差异,且有研究认为暗斑与蛋壳厚度亦无相关性[31]。相似地,另有研究指出,除了蛋壳颜色变深外,暗斑对其他蛋品质指标的影响还不确定[32]。而王德贺[18]、杜元军等[23]发现,与正常蛋相比,暗斑蛋内部质量无差异,但暗斑蛋的蛋壳膜更薄,蛋壳强度增加,蛋壳更厚。高金波等[12]观察到暗斑蛋蛋白高度和哈氏单位均显著低于正常蛋。这些研究说明暗斑不仅与蛋壳质量有关,还会影响蛋内质量,而庄宏等[24]进一步验证了这一观点。相反,张铭容[17]、彭庆[33]研究证明,暗斑蛋蛋壳比正常蛋蛋壳薄,且蛋壳硬度低于正常蛋壳。这些研究结果的差异可能与蛋鸡的品种、饲养管理、饲粮营养成分、蛋鸡的生理状态等有关,但尚需对内在机制进行深入探讨。
除了常规蛋品质,暗斑是否会对细菌入侵鸡蛋产生影响值得关注。早期的研究已指出,细菌对蛋壳的穿透性与蛋壳暗斑具有显著关联,半透明蛋壳区域乳突层的变化导致蛋壳裂纹的发生率增加,使得沙门氏菌和大肠杆菌等细菌更容易入侵暗斑蛋壳[34]。与此类似,张铭容[17]同样发现,暗斑蛋易受到沙门氏菌侵扰,且暗斑愈严重,蛋壳及蛋内容物细菌菌落数增长愈迅速。然而,Ray等[35]研究指出,尽管暗斑蛋的蛋壳分支孔数增加,但不影响鸡蛋壳沙门氏菌的渗透性。相反,在时学锋[36]的研究中提到,与正常蛋相比,暗斑并不会提升大肠杆菌入侵的可能性,因为蛋壳的厚度和胶护膜的质量是决定细菌穿透蛋壳入侵蛋内的关键因素[37],而暗斑与蛋壳厚度、胶护膜质量并不相关[31]。关于细菌入侵鸡蛋的可能性,另有研究认为,蛋壳气孔直径是关键。蛋壳的气孔是细菌进入蛋内的通道,一般情况下,当细菌直径大于气孔直径,细菌穿透蛋壳阻力增大,而当细菌直径小于蛋壳气孔时,细菌容易穿过蛋壳进而对蛋内容物造成污染[38]。由此看来,暗斑是否会增加细菌的跨壳污染情况有待进一步确认。
4 蛋壳暗斑的营养调控措施
4.1 矿物质添加剂
近年来,各种矿物质已被评估用于降低暗斑蛋的发生,对维持蛋壳超微结构有至关重要的作用。钙、磷等是蛋壳形成必不可少的矿物元素[39]。研究发现,饲粮中添加5 900 mg/kg磷酸一二钙能使蛋壳乳突结构均一性得到改善,蛋壳超微结构的变异减少,鸡蛋暗斑的发生率降低[40]。同样,聂伟[13]报道,在饲粮中添加0.4%非植酸磷亦能减少蛋鸡暗斑蛋的发生,推测钙和磷的代谢可能与鸡蛋暗斑发生有关。此外,微量矿物质在蛋壳的形成过程中同样起着至关重要的作用。有研究显示,在饲粮中添加120 mg/kg锰、110 mg/kg锌或者0.3 mg/kg纳米硒-褐藻寡糖,能增加蛋鸡蛋壳腺钙代谢相关基因碳酸酐酶(CA)、CaBP-D28k、雌激素受体α(ERα)表达,改善蛋壳腺功能,促进蛋壳中钙和蛋壳膜中粗蛋白质沉积,提高蛋壳晶体结构的致密性,降低水分在蛋壳中的积聚,降低暗斑发生率[41]。类似地,有研究发现,饲粮中添加0.45 mg/kg酵母硒会提高促黑素细胞皮质素原(POMC)、多效生长因子(PTN)基因表达,调动蛋壳腺中雌激素的应答,进而调控蛋壳矿化和离子转运,改善蛋壳质量,蛋壳半透明度降低[42]。另有研究显示,饲粮额外分别添加40、40、7 mg/kg锌、锰、铜能有效改善种蛋半透明蛋的发生率,这些微量元素作为辅助因子提升蛋壳膜形成相关酶的活性,促进了蛋壳膜的发育,形成更优的蛋壳超微结构并增加了蛋壳厚度,从而降低半透明蛋的发生[43]。相似地,孙得发等[9]在饲粮中添加羟基蛋氨酸螯合锌(20 mg/kg锌)和羟基蛋氨酸螯合铜(4 mg/kg铜)显著降低了暗斑蛋的发生率,进一步证实了微量元素与暗斑的形成有关。总之,饲粮中添加矿物质主要通过促进钙规律的沉积、提升蛋壳超微结构来改善蛋壳暗斑状况。
4.2 维生素添加剂
维生素D3通常与钙和磷代谢有关,能促进蛋鸡钙和磷吸收、转运,进而影响蛋壳形成[44]。张继良等[45]研究发现,在饲粮中添加0.2 g/kg维生素D3及锌、锰复合物后,维生素D3与维生素D受体结合,增加蛋壳腺钙结合蛋白的表达,提高钙、磷的吸收转运,同时协同锌、锰矿物元素促进蛋壳形成,显著提升了蛋壳厚度,降低水印蛋比例。25-羟基维生素D3作为维生素D3的一种中间活性代谢物,已被证明具有比维生素D更好的生物活性[46]。有研究表明,饲粮中添加0.069 mg/kg 25-羟基维生素D3能降低暗斑蛋的发生率,可能是25-羟基维生素D3有效地调节机体钙、磷的代谢,提高了蛋壳腺造壳能力[47]。25-羟基维生素D3与植物精油协同发挥作用时,亦能显著增加蛋壳有效层厚度,减少蛋壳乳突层厚度和比例,改善蛋壳超微结构,进而降低蛋鸡半透明蛋发生率[48]。维生素A和维生素K均能调节家禽的生理功能,对维持机体的正常代谢有重要作用。研究发现,饲粮中添加7 000 IU/kg维生素A可以提高蛋鸡蛋壳腺抗氧化水平,促进蛋壳钙结晶的结合效果,降低暗斑蛋评分;另外,该研究还发现,饲粮中添加2.0 mg/kg维生素K3后,可能在蛋鸡体内转化为维生素K2,转运到蛋壳腺中激活相关代谢酶,促进钙离子的富集,提高蛋鸡蛋壳腺的抗氧化能力,降低暗斑蛋的发生率;但维生素A和维生素K3在降低暗斑蛋上不存在交互作用[49]。类似地,刘禹辰等[50]研究发现,产蛋后期饮水补充液态复合维生素(包含维生素A、维生素D、维生素B)尽管能降低破蛋率,但对暗斑蛋产生率并无显著影响。综上所述,饲粮中添加维生素可以提高钙的代谢,改善蛋壳暗斑的发生率。
4.3 其他
除了矿物质、维生素以外,其他物质如氨基酸、均衡油脂、益生菌等也有改善蛋壳暗斑的效果。李亚杰等[51]研究表明,L-丝氨酸能通过增加蛋壳中骨桥蛋白的含量,促进蛋壳晶体的生长,改善蛋壳微观结构,缓解蛋壳暗斑的发生。张雅岚等[52]在饲粮中添加均衡油脂(包含椰子油、玉米油、花生油、亚麻油等)4周后,发现暗斑蛋发生率从15.9%降至4.4%,均衡油脂可能通过脂代谢调节参与蛋壳膜形成的蛋白活性或表达量,改善蛋壳膜的质量,降低蛋壳暗斑的发生率。另外,在饲粮中添加唾液乳杆菌SNK-6能减少鸡蛋暗斑,因其能促进肠道中乳酸等有机酸的产生[53],而乳酸等有机酸能增加动物对钙的吸收,有利于蛋壳的矿化,进而改善蛋壳的结构[54-55]。
5 小结
蛋壳暗斑(也称作半透明蛋或水印蛋)被认为是一种蛋壳质量问题,与蛋壳膜结构、蛋壳矿化过程相关;其随放置时间的推移会发生一定的变化,且对蛋品质有不利影响。已有研究显示,加入适量营养调控物如矿物质、微量元素、氨基酸等能够一定程度上降低鸡蛋蛋壳暗斑的发生率。不过,当前的营养调控研究多聚焦于单一蛋鸡品种、周龄和环境,忽略了蛋鸡暗斑形成的条件多样性及其营养调控措施的适用性。未来的研究需要拓展至不同蛋鸡品种、周龄和饲养环境下,探究不同的营养添加物对蛋壳暗斑的影响,开发更为广泛的营养调控措施,这对蛋鸡产业的高质量发展具有重要的应用价值和意义。