Chinese Journal of Animal Nutrition >

2026 , Vol. 38 >Issue 3: 2184 - 2194

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2026.175

RESEARCH PAPER

Promoting Effects of Synthesis of Selenium on Sphingosine-1-Phosphate and Its Mediated Antioxidant and Anti-Inflammatory Responses in Peripheral Blood Mononuclear Cells of Donkey

  • LI Li ,
  • ZHAO Yanli ,
  • GUO Yongmei ,
  • MENG Fanzhu ,
  • ZHANG Yue ,
  • SONG Yan ,
  • YAN Sumei , *
Expand
  • Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science at The University of Inner Mongolia Autonomous Region, College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China
*professor, E-mail:

Received date: 2025-08-15

  Online published: 2026-03-16

Fold

Abstract

This study was conducted to investigate the promoting effects of selenium (Se) on the synthesis of sphingosine-1-phosphate (S1P) and its mediated antioxidant and anti-inflammatory responses in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of donkey, and to screen for the appropriate doses of Se or S1P. Two experiments were employed a single-factor completely randomized experimental design, adding different doses of Se [0, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0 and 5.0 nmol/L, which were named as SE0 (control), SE0.2, SE0.5, SE1.0, SE2.0 and SE5.0 groups, with eight replicates per group] or different doses of S1P [0, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 and 2.0 nmol/L, which were named as SP0 (control), SP0.1, SP0.2, SP0.5, SP1.0 and SP2.0 groups, with eight replicates per group] in PBMCs. The results showed as follows: 1) compared with SE0 group, the cell viability and activities of catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and superoxide dismutase (SOD) and contents of S1P and interleukin (IL)-2 in PBMCs of SE0.5 and SE1.0 groups were significantly increased (P<0.05), and the contents of IL-4, IL-6 and lipopolysaccharide (LPS) were significantly decreased (P<0.05); the mRNA relative expression levels of sphingosine-1-phosphate receptor 2 (S1PR2), acid ceramidase 1 (ASAH1) and sphingosine kinase 2 (SPHK2) in PBMCs of SE0.5 and SE1.0 groups were significantly increased (P<0.05); the mRNA relative expression levels of IL-2 and IL-10 in PBMCs of SE1.0 group were significantly increased (P<0.05), and the IL-6 mRNA relative expression level was significantly decreased (P<0.05). 2) Compared with SP0 group, the activities of CAT and SOD and contents of IL-2 and IL-6 in PBMCs of SP0.2 and SP0.5 groups were significantly increased (P<0.05), and the content of malondialdehyde (MDA) and activities of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and reactive oxygen species (ROS) were significantly decreased (P<0.05); the mRNA relative expression levels of S1PR2, ASAH1, SPHK2 and IL-10 in PBMCs of SP0.2 group were significantly increased (P<0.05); the mRNA relative expression levels of GPx1 and IL-2 in PBMCs of SP0.2 and SP0.5 groups were significantly increased (P<0.05), and the mRNA relative expression levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and IL-6 were significantly decreased (P<0.05). In summary, both Se and S1P can promote the antioxidant level and anti-inflammatory response in PBMCs of donkey, enhance the cell vitality, and Se can increase the S1P content and the mRNA relative expression levels of S1P synthesis-related genes ASAH1 and SPHK2 and receptor gene S1PR2. It shows good effects when the addition doses of Se and S1P are 0.5, 1.0 nmol/L and 0.2, 0.5 nmol/L, respectively.

Key words： selenium; sphingosine-1-phosphate; peripheral blood mononuclear cells; antioxidant

Cite this article

LI Li , ZHAO Yanli , GUO Yongmei , MENG Fanzhu , ZHANG Yue , SONG Yan , YAN Sumei . Promoting Effects of Synthesis of Selenium on Sphingosine-1-Phosphate and Its Mediated Antioxidant and Anti-Inflammatory Responses in Peripheral Blood Mononuclear Cells of Donkey[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2026 , 38(3) : 2184 -2194 . DOI: 10.12418/CJAN2026.175

随着健康饮食理念的普及,驴肉因其独特的营养价值备受青睐。然而,集约化养殖在提升产肉性能的同时,也因养殖密度高、运动量少导致了氧化应激问题。因此,提高驴的抗氧化和抗炎症能力是非常必要的。硒(Se)作为机体不可或缺的微量元素,在诸多的动物试验研究中已经证实了其对生长性能以及抗氧化功能的促进效果[1-3],但其作用机制不完全清楚,有待于进一步探究,这对通过合理利用Se提高驴的抗氧化和抗炎症能力具有重要意义。研究发现,饲粮中添加Se提高了奶牛血清中抗氧化酶的活性,并降低了丙二醛(MDA)和白细胞介素-1β(IL-1β)的含量,促进了其抗氧化功能,从而提高了泌乳性能[2]。Se通过促进奶牛体外乳腺上皮细胞(BMECs)的抗氧化和抗炎症能力,从而促进其细胞增殖[4];一项关于泌乳驴的研究也得出了类似的结果[1]。
1-磷酸-鞘氨醇(S1P)是鞘脂类代谢产物中具有重要生物学功能的信号分子,可调节细胞存活、增殖和凋亡[5]。S1P可以减少辐射引起的活性氧(ROS)积累,并通过抗凋亡和抗氧化机制保护睾丸细胞免受氧化应激[6]。载脂蛋白M(ApoM)和S1P复合物在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)处理的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)上,可以保护HUVECs免受损伤和炎症,表现为焦亡相关蛋白、炎症细胞因子和黏附分子表达的减弱[7]。有研究表明,产前饲粮中添加Se提高了奶牛产后多种鞘脂类物质的生成,这可能有助于减缓围产期奶牛产后氧化应激、炎症、胰岛素抵抗以及预防脂肪肝的发生[8]。外周血单个核细胞(PBMCs)是一类重要的免疫效应细胞,因其易获取性和能够反映机体感染及疾病的发生、评估机体免疫功能的强弱[9],常将其作为体外研究抗氧化水平与抗炎症反应的首选材料。课题组前期已经以奶牛PBMCs为细胞模型,研究了壳聚糖缓解脂多糖(LPS)诱导的氧化损伤的缓解机制[10]。目前,有关Se促进驴抗氧化和抗炎症反应的研究未见报道,其机制也有待深入探讨。因此,本试验以驴PBMCs为模型,通过外源添加Se或S1P,研究其对抗氧化和抗炎症反应的调节作用,同时研究Se对S1P及其相关基因的表达的影响,为深入阐明Se在抗氧化和抗炎症反应中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验试剂配制

称取5 mg硒代蛋氨酸(SeMet,美国Sigma公司)溶于25 mL超纯水中,配成1 mmol/L SeMet一级母液;称取1 mg S1P(上海麦克林生化科技股份有限公司)溶于2.635 mL甲醇中[11],配成1 mmol/L S1P一级母液。采用逐级稀释的原则,分别用超纯水和磷酸盐缓冲液(PBS)稀释SeMet和S1P,配制不同浓度的梯度初级工作液;再用不含胰岛素-转铁蛋白-硒钠(ITS)的饥饿培养基稀释配制为符合试验设计需求的梯度工作液。上述母液均通过0.22 μm的过滤器过滤,并避光保存,工作液现用现配。

1.2 PBMCs的分离与培养

本试验获得内蒙古农业大学实验动物福利与伦理委员会的许可(批准号:[2019]035)。选择1岁肉用德州公驴,通过颈静脉采集抗凝血(抗凝剂为乙二胺四乙酸)后,参照Zheng等[10]报道的密度梯度离心分离法分离PBMCs。简要步骤如下:将血液加入盛有PBMCs分离液的离心管中,血液与分离液比例为3∶2,600×g离心30 min,离心后吸取环状乳白色PBMCs层,并用PBS重悬清洗细胞,250×g离心10 min后弃上清,重复清洗细胞2次后,将细胞接种于25 cm2培养瓶中,于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培养箱中培养,培养68 h至活细胞数>95%(台盼蓝染色计数)后,将细胞250×g离心15 min后收集,进行后续试验。

1.3 试验设计

2个试验均采用单因素完全随机试验设计,每个试验分为6个组,每组8个重复。试验1中,Se的添加剂量分别为0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 nmol/L,分别记为SE0、SE0.2、SE0.5、SE1.0、SE2.0和SE5.0组,其中SE0为对照组,Se作用于细胞的时间为24 h[12-13]。试验2中,S1P的添加剂量分别为0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 nmol/L,分别记为SP0、SP0.1、SP0.2、SP0.5、SP1.0和SP2.0组,其中SP0为对照组,S1P作用于细胞的时间为12 h[14]。

1.4 测试指标与方法

1.4.1 细胞活力、抗氧化酶活性以及炎症细胞因子、S1P、LPS和MDA含量

细胞活力采用CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)测定。将分离得到的PBMCs按照上述试验设计接种于96孔细胞培养板(接种密度均为6×106个/mL)中,并在每孔加入20 μL的CCK-8与细胞培养液混匀,于37 ℃、5% CO2的条件下孵育1 h,测定450 nm波长下的吸光度(OD)值,并计算细胞活力:
细胞活力(%)=100×试验组OD值/对照组OD值。
将分离得到的PBMCs按照上述试验设计接种于24孔细胞培养板(接种密度均为6×106个/mL)中。培养结束后,收集细胞上清液用于抗氧化和抗炎症相关指标的测定。培养液中各指标采用标准试剂盒测定,其中,总抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性及MDA含量测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供,一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合成酶(iNOS)活性测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供,IL-1β、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、TNF-α含量和ROS活性测定试剂盒由北京华英生物技术研究所提供。采用酶联免疫法(ELISA)测定培养液中S1P和LPS含量,严格按照试剂盒说明书操作,试剂盒由上海酶联生物科技有限公司提供。

1.4.2 S1P和细胞因子相关基因的mRNA表达

培养结束后,收集细胞样品,250×g离心10 min后,弃掉上清液,加入1 mL Trizol Plus于冰上反复吹打裂解细胞,用于后续RNA的提取。根据Prime Script RT reagent K反转录试剂盒(翌圣生物科技股份有限公司)说明书操作将RNA反转为cDNA。使用SYBR Green Premix Ex Taq Ⅱ(翌圣生物科技股份有限公司)在实时荧光定量PCR系统(LightCycler 480,瑞士罗氏有限公司)检测细胞培养液中酸性神经酰胺酶1(ASAS1)、鞘氨醇激酶2(SPHK2)、1-磷酸-鞘氨醇受体2(S1PR2)、GPx1、IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α的mRNA表达。内参基因为β-肌动蛋白(β-actin)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH),采用2-△△Ct法计算各目的基因的mRNA相对表达量。内参基因和目的基因的引物均使用NCBI在线引物设计工具Primer Blast设计。引物序列信息见表1。
表1 引物序列信息

Table 1 Primer sequence information

基因
Genes		 引物序列
Primer sequences (5'—3')		 GenBank登录号
GenBank
accession No.		 长度
Length/bp
酸性神经酰胺酶1
ASAH1		 F:CTGTTTTTGGCGTGACGGTT
R:GCCCACAGAGAATCCTGCTT		 XM_014836464.3 175
1-磷酸-鞘氨醇受体2
S1PR2		 F:GAACAGACAGCCGGATACTC
R:TGAATCCTCTGCCAAGTGAGG		 XM_014857584.3 253
鞘氨醇激酶2
SPHK2		 F:GAAACCTCTGACTCCACGCT
R:GTTGCAGCAAGATCACGTCC		 XM_070499176.1 118
谷胱甘肽过氧化物酶1
GPx1		 F:CCAGTTCGGGCATCAGGAGAA
R:CAAAGAGTGTGAAGTTGGGCTC		 XM_014840420.3 126
白细胞介素-2
IL-2		 F:CGCACTAACTCTTGCAGTCC
R:AGCATCTTGGAGAGTTTGGGA		 XM_014845524.3 150
白细胞介素-10
IL-10		 F:TGAAGGTCGATACATCAGGGC
R:GCCAGGAAGACCAGGTAACATA		 NM_001082490.3 120
肿瘤坏死因子-α
TNF-α		 F:AGCCTCTTCTCCTTCCTCCTTGTC
R:CATTCGGTAACTGCTCTTCCCTCTG		 XM_014831604.3 196
白细胞介素-6
IL-6		 F:TCAAGGGTGAAAAGGAAAACATC
R:GGTGGTTACTTCTGGATTCTTC		 XM_014830631.3 154
β-肌动蛋白
β-actin		 F:GTGGAGGGACTCATGACCAC
R:AGCTTCCCATTCAGCTCAGG		 XM_014834961.1 173
甘油醛-3-磷酸脱氢酶
GAPDH		 F:CGGCGGCGCCCTATAAAA
R:CGTCATCCATGGCTAGCTGGG		 XM_023655002.1 140

1.5 数据处理

采用SAS 9.2软件的ANOVA程序对所有数据进行显著性检验和Duncan氏多重比较,并采用回归统计程序分析各组对所有指标的一次线性和一元二次效应关系。结果以平均值和均值标准误(SEM)表示,P<0.05表示组间差异或回归关系显著。

2 结果

2.1 Se和S1P对PBMCs细胞活力的影响

由图1可知,与SE0组相比,SE0.2、SE0.5和SE1.0组的细胞活力均显著增加(P<0.05),以SE0.5和SE1.0组的细胞活力较高;回归分析表明,随Se添加剂量的增加,细胞活力呈显著的一次线性和一元二次曲线变化(P<0.05)。与SP0组相比,SP0.2和SP1.0组的细胞活力均显著增加(P<0.05),以SP0.2组的细胞活力最高;回归分析表明,随S1P添加剂量的增加,细胞活力呈显著的一次线性和一元二次曲线变化(P<0.05)。
图1 Se和S1P对PBMCs细胞活力的影响

P表示处理的差异,P1表示一次线性曲线的差异,P2表示一元二次曲线的差异。数据点标记不同大写字母表示差异显著(P<0.05),相同大写字母表示差异不显著(P>0.05)。

Fig.1 Effect of Se and S1P on cell viability in PBMCs

P indicated the difference of treatment, P1 indicated the difference of linear curve, and P2 indicated the difference of quadratic curve. Data points marked with different capital letters indicate significant differences (P<0.05), while marked with the same capital letters indicate no significant differences (P>0.05).

2.2 Se和S1P对PBMCs中抗氧化酶活性及S1P、MDA和LPS含量的影响

由表2可知,与SE0组相比,SE0.5和SE1.0组的S1P含量显著增加(P<0.05),SE0.2、SE0.5、SE1.0和SE2.0组的T-AOC显著增加(P<0.05),SE0.5、SE1.0和SE2.0组的CAT活性显著增加(P<0.05),SE0.5和SE1.0组的GPx和SOD活性显著增加(P<0.05),SE0.5组的MDA含量显著降低(P<0.05),SE0.2、SE0.5、SE1.0、SE2.0和SE5.0组的LPS含量显著降低(P<0.05)。回归分析表明,随Se添加剂量的增加,S1P、LPS含量和GPx活性呈显著的一次线性和一元二次曲线变化(P<0.05),T-AOC和CAT活性呈显著的一元二次曲线变化(P<0.05),SOD活性和MDA含量呈显著的一次线性变化(P<0.05)。
表2 Se对PBMCs中抗氧化酶活性及S1P、MDA和LPS含量的影响

Table 2 Effects of Se on antioxidant enzyme activities and S1P, MDA and LPS contents in PBMCs

项目
Items		 组别 Groups SEM P值 P-value
SE0 SE0.2 SE0.5 SE1.0 SE2.0 SE5.0 P P1 P2
1-磷酸-鞘氨醇
S1P/(nmol/L)		 436.13c 371.67d 532.44b 574.15a 384.06d 354.23d 10.563 <0.001 0.008 0.010
总抗氧化能力
T-AOC/(U/mL)		 2.01b 2.62a 2.89a 2.74a 2.68a 2.17b 0.128 <0.001 0.181 0.004
过氧化氢酶
CAT/(U/mL)		 27.25c 27.11c 30.38b 32.27a 29.02b 27.14c 0.571 <0.001 0.275 0.002
谷胱甘肽过氧化物酶
GPx/(U/μL)		 86.19c 90.32bc 97.77a 95.51ab 89.84bc 83.79c 2.247 0.001 0.025 0.012
超氧化物歧化酶
SOD/(U/mL)		 40.96b 42.03ab 44.96a 44.62a 39.06b 39.57b 0.993 <0.001 0.019 0.066
丙二醛
MDA/(nmol/μL)		 1.09a 1.06ab 0.97b 1.06ab 1.08a 1.14a 0.031 0.023 0.025 0.068
脂多糖
LPS/(ng/mL)		 128.45a 112.30c 107.62cd 103.69d 103.48d 119.15b 2.098 <0.001 0.049 0.018

P表示处理的差异,P1表示一次线性曲线的差异,P2表示一元二次曲线的差异。同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

P indicated the difference of treatment, P1 indicated the difference of linear curve, and P2 indicated the difference of quadratic curve. In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

由表3可知,与SP0组相比,SP0.1和SP0.2组的S1P含量显著增加(P<0.05),SP0.1、SP0.2和SP0.5组的CAT活性显著增加(P<0.05),SP0.1和SP0.2组的GPx活性显著增加(P<0.05),SP0.2、SP0.5和SP1.0组的SOD活性显著增加(P<0.05),SP0.2、SP0.5和SP2.0组的MDA含量显著降低(P<0.05),SP0.2组的LPS含量显著降低(P<0.05)。回归分析表明,随S1P添加剂量的增加,S1P、LPS含量和SOD活性呈显著的一次线性和一元二次曲线变化(P<0.05)。
表3 S1P对PBMCs中抗氧化酶活性及S1P、MDA和LPS含量的影响

Table 3 Effects of S1P on antioxidant enzyme activities and S1P, MDA and LPS contents in PBMCs

项目
Items		 组别 Groups SEM P值 P-value
SP0 SP0.1 SP0.2 SP0.5 SP1.0 SP2.0 P P1 P2
1-磷酸-鞘氨醇
S1P/(nmol/L)		 307.59b 343.87a 363.62a 265.88c 305.7b 256.78c 8.808 <0.001 <0.001 0.001
总抗氧化能力
T-AOC/(U/mL)		 2.02 2.17 2.44 2.17 2.09 2.21 0.186 0.737 0.929 0.991
过氧化氢酶
CAT/(U/mL)		 24.87d 26.71bc 28.39a 27.91ab 26.24cd 25.61cd 0.500 <0.001 0.239 0.067
谷胱甘肽过氧化物酶
GPx/(U/μL)		 76.81bc 86.20a 88.16a 84.81ab 76.28c 80.22ab 2.704 0.014 0.228 0.472
超氧化物歧化酶
SOD/(U/mL)		 35.26cd 35.69cd 40.62a 38.43ab 38.22ab 33.02d 0.973 <0.001 0.039 0.001
丙二醛
MDA/(nmol/μL)		 1.33a 1.29ab 1.02c 1.08bc 1.25ab 1.11bc 0.071 0.021 0.306 0.515
脂多糖
LPS/(ng/mL)		 118.39bc 115.88bc 106.89d 121.31ab 133.08a 124.95ab 4.010 0.011 0.026 0.018

2.3 Se和S1P对PBMCs中iNOS和ROS活性及NO和细胞因子含量的影响

由表4可知,与SE0组相比,SE0.5、SE1.0和SE5.0组的IL-2含量显著增加(P<0.05),SE0.5、SE1.0、SE2.0和SE5.0组的IL-4含量显著降低(P<0.05),SE1.0组的IL-10含量显著增加(P<0.05),SE0.5组的TNF-α含量显著降低(P<0.05),SE0.5和SE1.0组的IL-6含量显著降低(P<0.05),SE1.0和SE5.0组的NO含量显著降低(P<0.05),SE0.2、SE0.5和SE5.0组的iNOS活性显著降低(P<0.05),SE0.5组的ROS活性显著降低(P<0.05)。回归分析表明,随Se添加剂量的增加,IL-4含量呈显著的一元二次曲线变化(P<0.05),IL-10含量呈显著的一次线性变化(P<0.05),NO含量和iNOS活性呈显著的一次线性和一元二次曲线变化(P<0.05)。
表4 Se对PBMCs中iNOS和ROS活性及NO和细胞因子含量的影响

Table 4 Effects of Se on iNOS and ROS activities and NO and cytokine contents in PBMCs

项目
Items		 组别 Groups SEM P值 P-value
SE0 SE0.2 SE0.5 SE1.0 SE2.0 SE5.0 P P1 P2
白细胞介素-2
IL-2/(pg/mL)		 30.95c 35.77bc 42.94a 40.12ab 33.47c 39.99ab 1.858 0.001 0.110 0.250
白细胞介素-4
IL-4/(pg/mL)		 1.34a 1.32ab 1.16c 1.16c 1.06d 1.24bc 0.028 <0.001 0.274 <0.001
白细胞介素-10
IL-10/(pg/mL)		 2.96bc 2.98bc 3.04ab 3.08a 2.94c 2.90c 0.035 0.011 0.028 0.055
肿瘤坏死因子-α
TNF-α/(pg/mL)		 8.92ab 9.32a 8.26c 8.50bc 8.99ab 9.00ab 0.201 0.011 0.522 0.549
白细胞介素-1β
IL-1β/(pg/mL)		 4.77 4.20 4.20 3.94 4.14 4.54 0.260 0.027 0.685 0.167
白细胞介素-6
IL-6/(pg/mL)		 24.84a 23.35ab 21.40b 22.67b 24.65a 24.90a 0.649 0.002 0.066 0.160
一氧化氮
NO/(μmol/L)		 21.26a 21.12a 20.93ab 20.14bc 20.81ab 20.03c 0.286 0.019 0.007 0.020
诱导型一氧化氮合酶
iNOS/(U/mL)		 6.77a 6.56b 6.08c 6.74a 6.74a 6.02c 0.047 <0.001 <0.001 <0.001
活性氧
ROS/(U/μL)		 128.78a 128.12a 117.48b 128.13a 131.97a 130.32a 2.988 0.029 0.183 0.360
由表5可知,与SP0组相比,SP0.1、SP0.2、SP0.5和SP2.0组的IL-2含量显著增加(P<0.05),SP1.0和SP2.0组的IL-4含量显著降低(P<0.05),SP0.2组的IL-10含量显著增加(P<0.05),SP0.2和SP0.5组的IL-6含量显著降低(P<0.05),SP1.0和SP2.0组的NO含量显著增加(P<0.05),SP0.2、SP0.5、SP1.0和SP2.0组的iNOS和ROS活性显著降低(P<0.05)。回归分析表明,随S1P添加剂量的增加,IL-4、IL-10、TNF-α和NO含量呈显著的一次线性和一元二次曲线变化(P<0.05),iNOS和ROS活性呈显著的一元二次曲线变化(P<0.05)。
表5 S1P对PBMCs中iNOS和ROS活性及NO和细胞因子含量的影响

Table 5 Effects of S1P on iNOS and ROS activities and NO and cytokine contents in PBMCs

项目
Items		 组别 Groups SEM P值 P-value
SP0 SP0.1 SP0.2 SP0.5 SP1.0 SP2.0 P P1 P2
白细胞介素-2
IL-2/(pg/mL)		 40.07c 46.06b 52.67a 46.63b 42.43bc 45.35b 1.958 0.027 0.090 0.183
白细胞介素-4
IL-4/(pg/mL)		 1.15ab 1.17ab 1.22a 1.10bc 0.98d 1.04cd 0.026 <0.001 <0.001 <0.001
白细胞介素-10
IL-10/(pg/mL)		 2.49b 2.48b 2.61a 2.49b 2.32c 2.45b 0.034 <0.001 0.038 0.009
肿瘤坏死因子-α
TNF-α/(pg/mL)		 9.99ab 9.37b 9.30b 9.27b 10.08ab 10.56a 0.270 0.009 0.003 0.008
白细胞介素-1β
IL-1β/(pg/mL)		 4.71 4.72 4.39 4.49 4.62 4.62 1.499 0.645 0.696 0.910
白细胞介素-6
IL-6/(pg/mL)		 27.01a 26.96a 25.33b 25.38b 26.55a 26.28a 0.288 <0.001 0.766 0.292
一氧化氮
NO/(μmol/L)		 17.65cd 17.81c 17.13cd 16.88d 17.81b 20.75a 0.259 <0.001 <0.001 <0.001
诱导型一氧化氮合酶
iNOS/(U/mL)		 5.47a 5.51a 4.51c 4.62c 5.06b 5.20b 0.067 <0.001 0.944 0.012
活性氧
ROS/(U/μL)		 178.30a 172.29ab 165.49bc 156.70c 161.76bc 163.47bc 4.773 0.043 0.104 0.017

2.4 Se和S1P对PBMCs中S1P和细胞因子相关基因表达的影响

由表6可知,与SE0组相比,SE0.5和SE1.0组的S1PR2、ASAH1、SPHK2的mRNA相对表达量显著增加(P<0.05),SE0.5组的GPx1的mRNA相对表达量显著增加(P<0.05),SE1.0组的IL-2的mRNA相对表达量显著增加(P<0.05),SE1.0和SE2.0组的IL-10的mRNA相对表达量显著增加(P<0.05),SE1.0和SE2.0组的IL-6的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)。回归分析表明,随Se添加剂量的增加,IL-2、IL-10和IL-6的mRNA相对表达量呈显著的一元二次曲线变化(P<0.05),TNF-α的mRNA相对表达量呈显著的一次线性和一元二次曲线变化(P<0.05)。
表6 Se对PBMCs中S1P和细胞因子相关基因表达的影响

Table 6 Effects of Se on expression of S1P and cytokine related genes in PBMCs

项目
Items		 组别 Groups SEM P值 P-value
SE0 SE0.2 SE0.5 SE1.0 SE2.0 SE5.0 P P1 P2
1-磷酸-鞘氨醇受体2
S1PR2		 1.00c 0.40e 1.39a 1.18b 0.66d 1.00c 0.055 <0.001 0.631 0.892
酸性神经酰胺酶1
ASAH1		 1.00b 0.12c 1.25a 1.32a 0.93b 1.05b 0.060 <0.001 0.185 0.092
鞘氨醇激酶2
SPHK2		 1.00b 0.91b 1.33a 1.18a 0.99b 0.93b 0.055 <0.001 0.092 0.104
谷胱甘肽过氧化物酶1
GPx1		 1.00b 0.52d 1.20a 1.09b 0.76c 0.85c 0.033 <0.001 0.424 0.691
白细胞介素-2
IL-2		 1.00bc 0.83d 1.05b 1.18a 0.58e 0.90cd 0.045 <0.001 0.139 0.035
白细胞介素-10
IL-10		 1.00bc 0.85c 1.15ab 1.25a 1.28a 0.90c 0.071 <0.001 0.511 <0.001
肿瘤坏死因子-α
TNF-α		 1.00ab 0.90b 0.80b 0.97ab 0.89b 1.16a 0.078 0.049 0.016 0.020
白细胞介素-6
IL-6		 1.00b 1.06ab 0.96b 0.60c 0.50c 1.14a 0.047 <0.001 0.357 <0.001
由表7可知,与SP0组相比,SP0.2组的S1PR2、ASAH1、SPHK2和IL-10的mRNA相对表达量显著增加(P<0.05),SP0.2、SP0.5和SP1.0组的GPx1的mRNA相对表达量显著增加(P<0.05),SP0.2和SP0.5组的IL-2的mRNA相对表达量显著增加(P<0.05),SP0.2和SP0.5组的TNF-α的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05),SP0.2、SP0.5和SP2.0组的IL-6的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)。回归分析表明,随S1P添加剂量的增加,S1PR2、ASAH1和IL-6的mRNA相对表达量呈显著一次线性和一元二次曲线变化(P<0.05),GPx1、IL-2和TNF-α的mRNA相对表达量呈显著的一元二次曲线变化(P<0.05)。
表7 S1P对PBMCs中S1P和细胞因子相关基因表达的影响

Table 7 Effects of S1P on expression of S1P and cytokine related genes in PBMCs

项目
Items		 组别 Groups SEM P值 P-value
SP0 SP0.1 SP0.2 SP0.5 SP1.0 SP2.0 P P1 P2
1-磷酸-鞘氨醇受体2
S1PR2		 1.00bc 0.95bc 1.36a 1.11ab 0.59d 0.86cd 0.054 <0.001 0.003 0.002
酸性神经酰胺酶1
ASAH1		 1.00b 1.01b 1.19a 0.95c 0.64d 0.95b 0.044 <0.001 0.038 <0.001
鞘氨醇激酶2
SPHK2		 1.00b 0.87c 1.08a 1.01b 1.01b 0.99b 0.021 <0.001 0.698 0.478
谷胱甘肽过氧化物酶1
GPx1		 1.00c 0.53e 1.26b 1.25b 1.41a 0.80d 0.047 <0.001 0.953 <0.001
白细胞介素-2
IL-2		 1.00c 1.01c 2.31a 1.73b 1.15c 1.01c 0.100 <0.001 0.074 0.038
白细胞介素-10
IL-10		 1.00b 0.38d 1.24a 1.08ab 0.86c 0.95bc 0.063 <0.001 0.905 0.871
肿瘤坏死因子-α
TNF-α		 1.00b 1.58a 0.56c 0.47c 0.88b 0.95b 0.053 <0.001 0.489 0.014
白细胞介素-6
IL-6		 1.00b 1.14a 0.83c 0.87c 1.08ab 0.83c 0.032 <0.001 0.006 0.011

3 讨论

3.1 S1P对驴PBMCs抗氧化水平和抗炎症反应的促进作用

GPx、CAT、SOD、ROS、T-AOC和MDA通常被认为是反映细胞抗氧化能力的标志性指标。氧化应激与炎症反应密切相关,往往相互触发、相互促进[15]。当机体处于炎症状态时,会释放大量iNOS介导的NO,导致促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的大量产生[16]。IL-2、IL-4和IL-10是常见的抗炎细胞因子。IL-2/抗IL-2抗体复合物减少了ROS介导的损伤并改善了抗氧化功能[17]。PBMCs因其易获取性和能够反映机体感染及疾病的发生、评估机体免疫功能的强弱[9],常作为体外研究抗氧化水平和抗炎症反应的首选材料。S1P是鞘脂类代谢产物中具有重要生物学功能的信号分子,可调节细胞存活、增殖和凋亡[6];S1P处理可保护HUVECs免受损伤和炎症,增强其细胞活力[7,18]。本试验研究发现,S1P的添加可增加PBMCs中IL-2和IL-10含量,降低NO含量和IL-6、TNF-α含量及其mRNA相对表达量,而且其影响效果与添加量均呈剂量依赖性。这说明S1P调控促炎因子和抗炎因子的基因表达,对PBMCs抗炎症反应和细胞增殖产生促进效果,添加剂量为0.2和0.5 nmol/L表现出较好的效果。Hahn等[19]研究表明,S1P通过调节抗氧化酶的表达,对胰腺β细胞的氧化损伤起到保护作用。S1P可通过抑制炎症因子的释放来改善内皮屏障功能[20],同时促进肿瘤相关巨噬细胞分泌抗炎因子[21]。这些研究结果与本试验结果相似。S1P主要通过其受体发挥生物学效应,S1PR2是其中之一,具有抑制凋亡、细胞增殖和肌动蛋白重塑并参与心脏发育的作用[22]。而本试验中,S1P的添加增强了S1PR2的表达,这也说明了S1P可正向调控其受体从而发挥作用。

3.2 Se对驴PBMCs抗氧化水平和抗炎症反应的促进作用

Se具有较强的抗氧化、抗炎症和抗癌等生物活性。课题组前期研究发现,Se对BMEC增殖、硒蛋白GPx活性及其基因表达、SOD活性和T-AOC的促进作用以及对MDA和ROS含量的抑制作用表现出剂量依赖性效果,但高剂量的Se可抑制细胞增殖,甚至导致细胞凋亡[4]。Se可通过抑制PBMCs中IL-6和IL-1β含量发挥抗炎作用[23]。在本试验中,Se的添加可提高PBMCs中GPx和SOD活性和GPx1的mRNA相对表达量,降低MDA含量,降低IL-6、TNF-α含量及其mRNA相对表达量;PBMCs增殖率与Se水平呈剂量依赖性升高。这说明Se通过促进抗氧化酶和抗炎因子相关的基因表达,降低促炎因子相关基因表达,从而增强PBMCs抗氧化水平和抗炎症反应,促进细胞增殖,添加剂量为0.5和1.0 nmol/L表现出较好的效果。研究发现,S1P是一种生物活性脂质介质,通过ASAH1催化将神经酰胺转化为鞘氨醇[24];鞘氨醇通过和鞘氨醇激酶(SPHKs)磷酸化为S1P,SPHKs主要以2种不同的同种型存在,即SPHK1和SPHK2,它们分别与细胞外和细胞内室中S1P的合成有关[20]。如前所述,本研究得出S1P具有促进抗氧化水平和抗炎症反应的功能,同时Se处理PBMCs可提高S1P含量,增强S1PR2、ASAH1和SPHK2的mRNA相对表达量,这也说明了Se可能通过增强ASAH1和SPHK2的基因表达,上调S1P的含量,增加S1P与受体S1PR2的结合来发挥Se在促增殖、提高抗氧化水平和抗炎症反应中的积极作用,为深入探究Se发挥抗氧化和抗炎症的作用机制提供了新思路。然而,目前的相关研究甚少,还需要进一步验证。

4 结论

Se和S1P均可提高驴PBMCs的抗氧化水平和抗炎症反应,并增强细胞活力;Se和S1P添加剂量分别为0.5、1.0 nmol/L和0.2、0.5 nmol/L时具有较好的效果。Se还可提升S1P含量及其合成相关基因ASAH1和SPHK2和受体基因S1PR2的mRNA相对表达量。

References

Publishing order | Descend order by publishing year | Descend order by cited within
[1]
TONG M M, LI S Y, HUI F, et al. Effects of dietary selenium yeast supplementation on lactation performance,antioxidant status,and immune responses in lactating donkeys[J]. Antioxidants, 2024, 13(3):275.

DOI

[2]
GONG J, NI L L, WANG D F, et al. Effect of dietary organic selenium on milk selenium concentration and antioxidant and immune status in midlactation dairy cows[J]. Livestock Science, 2014, 170:84-90.

DOI

[3]
ALIMOHAMADY R, ALIARABI H, BAHARI A, et al. Influence of different amounts and sources of selenium supplementation on performance,some blood parameters,and nutrient digestibility in lambs[J]. Biological Trace Element Research, 2013, 154(1):45-54.

DOI

[4]
GUO Y M, GUO X Y, YAN S M, et al. Mechanism underlying the protective effect of selenium on no-induced oxidative damage in bovine mammary epithelial cells[J]. Biological Trace Element Research, 2019, 191(1):104-114.

DOI PMID

[5]
WANG D F, TANG Y D, WANG Z C. Role of sphingolipid metabolites in the homeostasis of steroid hormones and the maintenance of testicular functions[J]. Frontiers in Endocrinology, 2023, 14:1170023.

DOI

[6]
SORDILLO P P, SORDILLO D C, HELSON L. Review:the prolonged QT interval:role of pro-inflammatory cytokines,reactive oxygen species and the ceramide and sphingosine-1 phosphate pathways[J]. In Vivo, 2015, 29(6):619-636.

[7]
LIU Y, TIE L. Apolipoprotein M and sphingosine-1-phosphate complex alleviates TNF-α-induced endothelial cell injury and inflammation through PI3K/AKT signaling pathway[J]. BMC Cardiovascular Disorders, 2019, 19(1):279.

DOI PMID

[8]
张盼. 硒对围产期奶牛血浆磷脂和鞘脂生成模式的影响[D].硕士学位论文. 呼和浩特: 内蒙古师范大学, 2025.

ZHANG P. Effects of selenium on plasma phospholipids and sphingolipids profile in dairy cows during periparturient period[D].Master’s Thesis. Hohhot: Inner Mongolia Normal University, 2025. (in Chinese)

[9]
KHAN S, KAIHARA K A. Single-cell RNA-sequencing of peripheral blood mononuclear cells with ddSEQ[J]. Methods in Molecular Biology, 2019, 1979:155-176.

DOI PMID

[10]
ZHENG Y G, YAN S M, QI J Y, et al. Protective effect of chitosan oligosaccharide against oxidative damage of peripheral blood mononuclear cells in dairy cows induced by diethylenetriamine/nitric oxide via NF-κB signalling pathway[J]. Italian Journal of Animal Science, 2020, 19(1):602-609.

DOI

[11]
HE Y Z, SHI B Y, ZHAO X R, et al. Sphingosine-1-phosphate induces islet β-cell proliferation and decreases cell apoptosis in high-fat diet/streptozotocin diabetic mice[J]. Experimental and Therapeutic Medicine, 2019, 18(5):3415-3424.

DOI PMID

[12]
郭咏梅, 张博綦, 闫素梅, 等. 硒对脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤的保护作用[J]. 动物营养学报, 2017, 29(9):3375-3384.

GUO Y M, ZHANG B Q, YAN S M, et al. Protective effects of selenium on bovine mammary epithelial cells oxidative damaged by lipopolysaccharide[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2017, 29(9):3375-3384. (in Chinese)

[13]
张朝莹, 文兆海, 张玥, 等. 旋毛虫钙网蛋白对小鼠巨噬细胞和大鼠PBMC免疫功能的影响[J]. 南京农业大学学报, 2024, 47(1):1-8.

ZHANG Z Y, WEN Z H, ZHANG Y, et al. Effect of Trichinella spiralis calreticulin on immune function of mouse macrophages and rat PBMC[J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 2024, 47(1):1-8. (in Chinese)

[14]
REN K, LU Y J, MO Z C, et al. ApoA-I/SR-BI modulates S1P/S1PR2-mediated inflammation through the PI3K/Akt signaling pathway in HUVECs[J]. Journal of Physiology and Biochemistry, 2017, 73(2):287-296.

DOI PMID

[15]
LI S, HONG M, TAN H Y, et al. Insights into the role and interdependence of oxidative stress and inflammation in liver diseases[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2016, 2016(1):4234061.

DOI

[16]
FLORESCU D N, BOLDEANU M V, ŞERBAN R E, et al. Correlation of the pro-inflammatory cytokines IL-1β,IL-6,and TNF-α,inflammatory markers,and tumor markers with the diagnosis and prognosis of colorectal cancer[J]. Life, 2023, 13(12):2261.

DOI

[17]
JANG J Y, KIM H W, YAN J J, et al. Interleukin-2/anti-interleukin-2 immune complex attenuates cold ischemia-reperfusion injury after kidney transplantation by increasing renal regulatory T cells[J]. Clinical and Translational Medicine, 2024, 14(3):e1631.

DOI

[18]
严惠, 赵虎. S1P通过调控S1PR1对高糖诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用[J]. 华中科技大学学报(医学版), 2024, 53(2):175-180.

YAN H, ZHAO H. S1P protects against high glucose-induced vascular endothelial cell injury through S1PR1[J]. Acta Medicinae Universitatis Scientiae et Technologiae Huazhong (Medical Edition), 2024, 53(2):175-180. (in Chinese)

[19]
HAHN C, TYKA K, SABA J D, et al. Overexpression of sphingosine-1-phosphate lyase protects insulin-secreting cells against cytokine toxicity[J]. Journal of Biological Chemistry, 2017, 292(49):20292-20304.

DOI PMID

[20]
STEPANOVSKA B, LANGE A I, SCHWALM S, et al. Downregulation of S1P lyase improves barrier function in human cerebral microvascular endothelial cells following an inflammatory challenge[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2020, 21(4):1240.

DOI

[21]
RODRIGUEZ Y I, CAMPOS L E, CASTRO M G, et al. Sphingosine-1 phosphate:a new modulator of immune plasticity in the tumor microenvironment[J]. Frontiers in Oncology, 2016, 6:218.

[22]
BURCZYK M, BURKHALTER M D, BLÄTTE T, et al. Phenotypic regulation of the sphingosine 1-phosphate receptor miles apart by G protein-coupled receptor kinase 2[J]. Biochemistry, 2015, 54(3):765-775.

DOI PMID

[23]
WACKER M, BALL A, BEER H D, et al. Immunophenotyping of monocyte migration markers and therapeutic effects of selenium on IL-6 and IL-1β cytokine axes of blood mononuclear cells in preoperative and postoperative coronary artery disease patients[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2023, 24(8):7198.

DOI

[24]
KARIKARI T K, PASCOAL T A, ASHTON N J, et al. Blood phosphorylated tau 181 as a biomarker for Alzheimer’s disease:a diagnostic performance and prediction modelling study using data from four prospective cohorts[J]. The Lancet Neurology, 2020, 19(5):422-433.

DOI

Options
Outlines

/

〈 〉

京ICP备17050989号-2
Copyright © Chinese Journal of Animal Nutrition, All Rights Reserved.
Tel: 010－62817823　E-mail: cjan@vip.163.com
Powered by Beijing Magtech Co., Ltd.