滇南小耳猪又名冬瓜猪,主要分布于云南省海拔800~1 300 m的热带、亚热带地区,属典型华南型猪种,具有抗逆性强、耐粗饲和肉品质优良等种质特性[1]。该猪种已于2011年经国家畜禽遗传资源委员会鉴定为我国特有地方猪种资源,收录于《中国畜禽遗传资源志(猪志)》[2]。与引进猪种相比,我国地方猪种在特殊生长环境与饲喂方式下形成了独特的肠道微生物群落结构[3]。因此,挖掘利用地方猪种具有益生潜力的肠道微生物资源,对开发新型饲用微生态制剂具有重要的理论价值和实际应用意义。
1 材料与方法
1.1 菌株
DN3-1由本课题组从滇南小耳猪新鲜粪便中分离获得;金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S. aureus)ATCC 49521、单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,L. monocytogenes)BNCC336877、大肠杆菌(Escherichia coli,E. coli)K88和宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei,S. sonnei)CMCC51592为本课题组保藏菌株。
1.2 主要试剂与仪器
胰酪大豆胨(tryptic soy broth,TSB)培养基、胰酪大豆胨琼脂(tryptic soy agar,TSA)培养基、LB(Luria-Bertani)培养基购自广东环凯生物科技有限公司;10×磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS)购自武汉赛维尔生物科技有限公司;牛胆盐、总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)检测试剂盒、羟自由基(HO·)清除能力检测试剂盒、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力检测试剂盒、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)含量检测试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶检测生化管购自杭州滨和微生物试剂有限公司。高速低温离心机(Thermo Fisher ST-16R)、全波长多功能酶标仪(Varioskan Flash)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 全基因组测序及序列分析
将活化后的DN3-1(1%,V/V)接种至TSB培养基中,于37 ℃有氧条件下培养至对数生长期。随后以2 800×g离心10 min收集菌体,并用无菌PBS洗涤3次。采用基因组DNA提取试剂盒纯化菌株总DNA,所得DNA样品依次经过Nanodrop分光光度计、Qubit荧光定量仪进行浓度测定,并通过琼脂糖凝胶电泳评估其完整性。经质量验证合格后,使用BluePippin全自动核酸片段回收系统进行大片段DNA筛选纯化,并构建测序文库。文库制备完成后,分别采用Qubit荧光定量仪测定其浓度,利用Agilent 2100生物分析仪检测其片段大小分布。质量合格的文库分别在Pacific Biosciences Sequel Ⅱe三代测序平台和Illumina NovaSeq 6000二代测序平台上开展测序。
利用Hifiasm软件对三代长读长测序数据进行组装,采用Pilon v1.22软件,结合二代短读长测序数据对其进行纠错优化,以获得高精确度的完整基因组序列。使用Prodigal v2.6.3预测编码序列(CDS);利用RepeatMasker v4.1.4识别重复序列;基于上述组装与注释结果,运用Circos v0.69.6绘制基因组圈图。搜索京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)及碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes,CAZy)数据库,对预测的编码序列进行功能注释。
1.3.2 比较基因组分析
使用原核生物基因组和泛基因组分析平台(integrated prokaryotes genome and pan-genome analysis,IPGA)(v1.09)计算DN3-1与其他29株枯草芽孢杆菌之间的平均核苷酸同一性(average nucleotide identity,ANI),并构建泛-核心基因集。枯草芽孢杆菌基因组信息见表1。
表1 枯草芽孢杆菌基因组信息Table 1 Genomic information of B.subtilis |
| 菌株 Strains | 分离源 Isolation source | 基因组大小 Genome size/Mb | GC含量 GC content/% | GenBank编号 GenBank ID |
|---|---|---|---|---|
| B.subtilis 168 | 4.2 | 43.5 | GCA_000009045.1 | |
| B.subtilis 21855 | 猪属 Sus scrofa | 4.2 | 43.5 | GCA_028748025.1 |
| B.subtilis BS21 | 猪属 Sus scrofa | 4.8 | 44.0 | GCA_029958885.1 |
| B.subtilis QXKL-3 | 猪属 Sus scrofa | 4.1 | 44.0 | GCA_047302565.1 |
| B.subtilis 23-1 | 原鸡 Gallus gallus | 4.4 | 43.0 | GCA_032878855.1 |
| B.subtilis A1.2 | 原鸡 Gallus gallus | 4.2 | 43.5 | GCA_029625925.1 |
| B.subtilis 0SU1015-21 | 原鸡 Gallus gallus | 4.6 | 42.5 | GCA_029350885.1 |
| B.subtilis ZBAW6 1 | 原鸡 Gallus gallus | 4.3 | 43.5 | GCA_030846335.1 |
| B.subtilis 1 | 牛属 Bos | 4.3 | 43.5 | GCA_027497435.1 |
| B.subtilis JC1005 1 | 牛属 Bos | 4.0 | 44.0 | GCA_012926045.1 |
| B.subtilis MS1577 BS1 | 牛属 Bos | 4.3 | 43.5 | GCA_001187765.1 |
| B.subtilis N2-10 | 牛属 Bos | 4.0 | 44.0 | GCA_023702085.1 |
| B.subtilis O4 | 牛属 Bos | 4.2 | 43.5 | GCA_026410045.1 |
| B.subtilis TATVAM-FAB3 | 羊亚科 Caprinae | 4.0 | 44.0 | GCA_046592855.1 |
| B.subtilis TATVAM-FAB32 | 羊亚科 Caprinae | 4.0 | 43.5 | GCA_046592575.1 |
| B.subtilis TATVAM-FAB79 | 羊亚科 Caprinae | 4.2 | 43.5 | GCA_046591695.1 |
| B.subtilis TATVAM-FAB85 | 羊亚科 Caprinae | 4.0 | 43.5 | GCA_046535715.1 |
| B.subtilis 5-1 | 智人 Homo sapiens | 4.0 | 43.5 | GCA_010580645.1 |
| B.subtilis 8-1 | 智人 Homo sapiens | 4.0 | 43.5 | GCA_010578225.1 |
| B.subtilis ANA3 | 智人 Homo sapiens | 4.0 | 44.0 | GCA_038397795.1 |
| B.subtilis EYE 54 | 智人 Homo sapiens | 4.2 | 43.5 | GCA_023148545.1 |
| B.subtilis MRD-ZNGN | 智人 Homo sapiens | 4.0 | 44.0 | GCA_045275325.1 |
| B.subtilis SF106 | 智人 Homo sapiens | 4.0 | 43.5 | GCA_025452155.1 |
| B.subtilis TLO3 | 智人 Homo sapiens | 4.1 | 43.5 | GCA_002290305.1 |
| B.subtilis ZL27 | 智人 Homo sapiens | 4.0 | 43.5 | GCA_003762825.1 |
| B.subtilis MENO2 | 蜜蜂属 Apis | 4.1 | 44.0 | GCA_009497795.1 |
| B.subtilis TV1 | 蜜蜂属 Apis | 4.1 | 43.5 | GCA_010912695.1 |
| B.subtilis DSM 28592 | 小鼠属 Mus | 4.2 | 43.0 | GCA_024623085.1 |
| B.subtilis MG-1 | 水貂 Neovison vison | 4.4 | 43.5 | GCA_026153475.1 |
B.subtilis:枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis。 |
1.3.3 细菌素和次级代谢产物合成基因簇预测
通过antiSMASH在线平台(https://antismash.secondarymetabolites.org)预测DN3-1潜在的天然产物生物合成基因簇。
1.3.4 毒力和耐药基因检索分析
利用毒力因子数据库(virulence factors database,VFDB)v20240301注释DN3-1基因组中的毒力因子相关基因,并通过综合抗生素耐药性数据库(comprehensive antibiotic resistance database,CARD)v3.2.9识别抗生素耐药基因。参照我国农业农村部发布的《微生物直接饲喂和发酵产品中所用菌株的鉴定与安全性评估指南》[12],设定注释可靠性阈值:相似性≥80%,序列覆盖度≥70%,E值<10-5。
1.3.5 耐酸、耐胆盐能力测定
将TSB培养基经稀盐酸(0.1 mol/L)调节至目标pH(2.0、3.0、4.0),接种1%(V/V)活化后的DN3-1菌液,于37 ℃、150 r/min有氧振荡培养。分别于0、1、2和3 h收集菌液,经梯度稀释后,取100 μL涂布TSA培养基,37 ℃培养24 h后统计活菌数,按公式计算存活率,每组试验重复3次。在TSB培养基中添加牛胆盐至终浓度0.1%、0.2%和0.3%,接种1%(V/V)活化后的DN3-1菌液,按照上述方法测定0、1、2和3 h的存活率,每组试验重复3次。存活率计算公式如下:
存活率(%)=(Nt/N0)×100。
式中:N0为初始活菌数;Nt为处理t h后活菌数。
1.3.6 黏附能力测定
将DN3-1过夜培养后,5 000×g、4 ℃离心10 min收集菌体,用PBS洗涤2次并重悬至1×108 CFU/mL,并记录600 nm处吸光度(A0)。取2 mL菌悬液与2 mL二甲苯混合,涡旋5 min,静置30 min分层后测定水相600 nm处吸光度(A1),以计算疏水率,每组试验重复3次,计算公式如下:
疏水率(%)=[1-(A1/A0)]×100。
将DN3-1过夜培养后,5 000×g、4 ℃离心10 min收集菌体,用PBS洗涤2次并重悬至1×108 CFU/mL。涡旋混匀10 s,37 ℃静置孵育。分别于0(A0)和3 h(A2)取上层200 μL悬液测定600 nm处吸光度,以计算自聚集率,每组试验重复3次,计算公式如下:
自聚集率(%)=[1-(A2/A0)]×100。
1.3.7 产酶能力测定
蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶发酵培养基参照陈来凤等[13]的方法配制。采用活化后的DN3-1分别接种(接种量5%,V/V)于蛋白酶、淀粉酶及纤维素酶发酵培养基(37 ℃、150 r/min,培养48 h)和脂肪酶发酵培养基(37 ℃、150 r/min,培养72 h)。发酵完成后,经离心(10 000×g,10 min)收集上清液,测定胞外酶活性,每组试验重复3次。蛋白酶活性参照GB/T 28715—2012[14]的方法进行测定,脂肪酶活性采用对硝基苯酚法[15]进行测定,淀粉酶活性采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法[16]进行测定,纤维素酶活性采用GB/T 23881—2009[17]的方法进行测定。
1.3.8 抗氧化活性测定
将活化后的DN3-1按1%(V/V)接种量接种于TSB培养基中,于37 ℃、150 r/min振荡培养8 h。培养结束后,5 000×g离心10 min,分离发酵上清液和菌体沉淀。菌体经PBS缓冲液(pH 6.8)洗涤2次后,用相同缓冲液重悬并调整至1×108 CFU/mL。采用超声破碎仪(功率300 W,工作3 s,间隔5 s,总时长15 min)处理菌悬液,4 ℃、8 000×g离心15 min后收集上清,制备无细胞提取物。分别取发酵上清液和无细胞提取物,按照相应试剂盒说明书测定总抗氧化能力、超氧化物歧化酶活性、还原型谷胱甘肽含量、DPPH自由基清除率及羟自由基清除率,每组试验重复3次。
1.3.9 抑菌活性测定
将活化后的DN3-1菌液按1%(V/V)接种量转接至TSB培养基中过夜培养,收集发酵液于8 000×g离心15 min,取上清液备用。将E. coli、S. aureus、S. sonnei和L. monocytogenes分别以0.5%(V/V)的接种量加入LB固体培养基,混匀后倾注至放置有牛津杯的培养皿中。待培养基凝固后取出牛津杯,在所形成的孔中加入200 μL无菌上清液。37 ℃培养24 h后,测量抑菌圈直径,每组试验重复3次。
1.3.10 生物胺产生能力检测
挑取DN3-1单菌落接种至氨基酸空白对照管以及鸟氨酸、精氨酸和赖氨酸脱羧酶试验管中,37 ℃培养24 h后观察颜色变化。当试验管与阴性对照管均呈黄色时判定为菌株相应氨基酸脱羧酶阴性;若对照管呈黄色而试验管呈紫色,则判定为菌株相应氨基酸脱羧酶阳性,表明菌株具有相应氨基酸脱羧酶活性,能够产生腐胺、胍丁胺或尸胺。
1.3.11 溶血活性检测
将无菌滤纸片(直径6 mm)紧贴于哥伦比亚血琼脂平板表面,分别吸取20 μL的DN3-1菌液(1×108 CFU/mL)和阳性对照菌株(S. aureus NBRC 100910)悬液(1×108 CFU/mL)滴加于滤纸片上。37 ℃恒温培养24 h后,观察并记录溶血环形成情况。阳性判定标准为出现完全透明的β-溶血环,部分溶血(α-溶血)或无明显溶血环(γ-溶血)均判定为阴性结果。
1.4 数据统计与分析
试验数据采用SPSS 25.0统计软件进行分析。采用t检验进行2组间差异比较,多组间差异比较先进行单因素方差分析(one-way ANOVA),方差分析显著时进一步用Duncan氏法进行多重比较。数据均以平均值±标准差(mean±SD)表示,以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 比较基因组分析
2.1.1 ANI比较
采用ANI对DN3-1与29株不同来源的枯草芽孢杆菌进行了全基因组水平的亲缘关系分析。由图1可知,所有参比菌株的ANI值均大于95%。根据目前普遍认可的微生物物种界定标准(ANI>95%为同种),该结果充分证实了DN3-1的分类学地位确属于枯草芽孢杆菌。
2.1.2 泛基因和核心基因组分析
2.2 DN3-1全基因组测序与分析
图3 DN3-1基因组组成圈图第1圈:基因组大小;第2、3圈:正链、负链上的编码序列(CDS),不同的颜色表示CDS不同的直系同源簇(COG)的功能分类;第4圈:rRNA和tRNA;第5圈:GC含量,红色表示该区域GC含量高于全基因组平均GC含量,峰值越高表示与平均GC含量差值越大,蓝色表示该区域GC含量低于全基因组平均GC含量,峰值越高表示与平均GC含量差值越大;第6圈:GC-Skew值。 Fig.3 Genome composition circle map of DN3-1 Circle 1: genome size; circles 2 and 3: coding sequences (CDS) on the positive and negative chains, different colors indicate the functional classification of CDS with different clusters of orthologous groups (COGs); circle 4: rRNA and tRNA; circle 5: GC content, the red indicates that the GC content in the region is higher than the average GC content of the whole genome, and the higher the peak value indicates the greater the difference with the average GC content, the blue indicates that the GC content in the region is lower than the average GC content of the whole genome, and the higher the peak value indicates the greater the difference with the average GC content; circle 6: GC-Skew value. |
表2 DN3-1基因组特征Table 2 DN3-1 genomic characterization |
| 基因组信息 Genomic information | 结果 Result |
|---|---|
| 长度 Length/bp | 4 121 215 |
| GC含量 GC content/% | 43.73 |
| 编码基因总数 Total number of coding genes/个 | 4 069 |
| rRNA数量 rRNA number/个 | 30 |
| tRNA数量 tRNA number/个 | 85 |
| sRNA数量 sRNA number/个 | 91 |
| 前噬菌体 Prophage/bp | |
| 前噬菌体1 Prophage 1 | 1 295 948~1 324 116 |
| 前噬菌体2 Prophage 2 | 2 061 095~2 081 306 |
| 转座子 Transposon/bp | |
| 转座子1 Transposon 1 | 1 620 100~1 620 363 |
| 转座子2 Transposon 2 | 2 186 477~2 186 896 |
| 转座子3 Transposon 3 | 2 187 893~2 188 255 |
2.3 DN3-1基因功能注释分析
2.3.1 KEGG功能注释
由图4可知,DN3-1的编码基因经KEGG功能注释显示,其基因主要分布于6大类:代谢(metabolism)、人类疾病(human diseases)、有机体系统(organismal systems)、细胞过程(cellular processes)、遗传信息处理(genetic information processing)及环境信息处理(environmental information processing)。在代谢相关基因中,全局概览图的基因数量最多(846个),其次为碳水化合物代谢(270个)、氨基酸代谢(231个)及辅因子与维生素的代谢(215个)。在人类疾病相关基因中,药物耐药性:抗菌型的基因数量最多(40个)。在有机体系统相关基因中,内分泌系统的基因数量最多(18个)。在细胞过程相关基因中,细胞群落-原核生物的基因数量最多(96个)。在遗传信息处理相关基因中,翻译的基因数量为多(88个)。在环境信息处理相关基因中,信号转导的基因数量最多(166个)。以上结果表明,DN3-1具有广泛的代谢潜能及环境适应性。
2.3.2 CAZy功能注释分析
由图5可知,DN3-1共编码152个碳水化合物活性酶基因,分布于71个基因家族。其中,糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GHs)家族基因数量最多(55个),其次为糖基转移酶(glycosyl transferases,GTs)家族(47个)和碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases,CEs)家族(31个);多糖裂解酶(polysaccharide lyases,PLs)家族(8个)、辅助活性酶(auxiliary activities,AAs)家族(8个)以及碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding modules,CBMs)家族(3个)基因数量相对较少。
2.4 毒力和耐药基因注释
由表3可知,基于VFDB和CARD数据库的基因组分析表明,DN3-1含有13个符合《直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南》要求的耐药基因,未检出毒力因子相关基因。
表3 DN3-1 CARD注释结果Table 3 Annotation results of CARD for DN3-1 |
| 基因编号 Gene No | ARO名称 ARO name | 抗生素类型 Type of antibiotics | 基因位点 Genetic locus/bp |
|---|---|---|---|
| gene0133 | Bacillus subtilis rpoB mutants conferring resistance to rifampin | 利福平 | 121 458~125 039 |
| gene0303 | lmrB | 林可酰胺类 | 280 110~329 825 |
| gene0897 | Bacillus subtilis mprF | 达托霉素 | 893 059~895 629 |
| gene2404 | bmr | 吖啶类、氟喹诺酮类、 氯霉素类、嘌呤霉素 | 2 372 130~2 373 299 |
| gene0613 | vmlR | 林可霉素、链阳霉素A | 590 382~592 028 |
| gene2628 | blt | 罗丹明类、吖啶类、氟喹诺酮类 | 2 566 443~2 567 645 |
| gene2657 | aadK | 链霉素 | 2 593 789~2 594 643 |
| gene1395 | ykkD | 氨基糖苷类、苯酚类、四环素类 | 1 353 705~1 354 022 |
| gene0288 | mphK | 大环内酯类 | 265 885~266 805 |
| gene0350 | tmrB | 核苷类 | 329 232~329 825 |
| gene1394 | ykkC | 氨基糖苷类、苯酚类、四环素类 | 1 353 367~1 353 705 |
| gene0139 | Enterococcus faecium EF-Tu mutants conferring resistance to GE2270A | GE2270A | 132 421~133 611 |
| gene4120 | tet(L) | 四环素类 | 4 066 024~4 067 400 |
2.5 DN3-1的生物胺产生能力
由图6可知,脱羧酶活性检测结果表明,DN3-1的鸟氨酸、精氨酸和赖氨酸脱羧酶试验管与对照管均呈现黄色反应,判定为阴性结果。以上结果表明,DN3-1不产生腐胺、胍丁胺和尸胺。
2.6 DN3-1的溶血活性
由图7可知,阳性对照S. aureus呈现β-溶血特征(形成明显无色透明溶血圈),而DN3-1未观察到溶血现象(γ-溶血)。以上结果表明,DN3-1不具有溶血活性。
2.7 DN3-1的益生特性相关基因分析
由表4可知,DN3-1含有不同的耐酸相关基因、耐胆盐相关基因、黏附相关基因及抗氧化相关基因。
表4 DN3-1的益生特性相关基因Table 4 Genes related to probiotic characteristics of DN3-1 |
| 基因位置 Gene locations | 基因名 Gene name | 定义 Definition |
|---|---|---|
| 酸耐受性 Acid resistance | ||
| gene3713 | atpA | ATP合酶F1亚基α |
| gene3717 | atpB | F0F1 ATP合酶A亚基 |
| gene3710 | atpC | F0F1 ATP合酶ε亚基 |
| gene3711 | atpD | F0F1 ATP合酶β亚基 |
| gene3716 | atpE | F0F1 ATP合酶C亚基 |
| gene3715 | atpF | F0F1 ATP合酶B亚基 |
| gene3712 | atpG | ATP合酶F1亚基γ |
| gene3714 | atpH | F0F1 ATP合酶δ亚基 |
| gene3718 | atpI | ATP合酶Ⅰ亚基 |
| gene1042、gene2356 | nhaC | 钠离子(Na+)/氢离子(H+)逆向转运蛋白NhaC |
| gene1387 | arcA | 精氨酸脱亚胺酶 |
| gene3352 | arcD | 精氨酸-鸟氨酸反向转运蛋白/赖氨酸通透酶 |
| 胆盐耐受性 Bile salt resistance | ||
| gene3763 | argS | 精氨酰-tRNA合成酶 |
| gene3052、gene3315 | dps | 饥饿诱导型DNA结合蛋白 |
| gene1841 | glnA | 谷氨酰胺合成酶 |
| gene0272、gene3520 | nagB | 葡糖胺-6-磷酸脱氨酶 |
| gene1214 | oppA | 寡肽运输系统底物结合蛋白 |
| gene1225 | pepF | 寡肽内肽酶F |
| gene2450 | pepP | Xaa-Pro氨肽酶 |
| gene4101 | ppaC | 锰依赖性无机焦磷酸酶 |
| 黏附性 Adhesion | ||
| gene0139 | tuf | 延伸因子Tu |
| gene0793、gene0833、 gene2490、gene3355 | ltaS | 脂磷壁酸合酶 |
| gene3885 | dltA | D-丙氨酸-聚磷酸核糖醇连接酶亚基1 |
| gene3886 | dltB | 参与D-丙氨酸输出的膜蛋白 |
| gene3887 | dltC | D-丙氨酸-聚磷酸核糖醇连接酶亚基2 |
| gene3889 | dltE | 未鉴定的氧化还原酶 |
| 抗氧化性 Oxidative resistance | ||
| gene4047、gene4048 | ahpC | 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)依赖性 过氧还蛋白亚基C |
| gene4048 | ahpF | NADH依赖性过氧还蛋白亚基F |
| gene0364、gene3225 | Fnr | 铁氧还蛋白/黄素氧还蛋白-烟酰胺腺嘌呤二核 苷磷酸(NADP+)还原酶 |
| gene0506、gene0601、gene1515、 gene2836、gene3293 | trxA | 硫氧还蛋白1 |
| gene2294、gene3497 | trxB | 硫氧还蛋白还原酶(NADP+型) |
| gene2938 | tpx | 硫氧还蛋白依赖性过氧还蛋白 |
| gene2886 | nrdR | 转录阻遏蛋白NrdR |
| gene1958 | ggt | γ-谷氨酰转肽酶/谷胱甘肽水解酶 |
| gene2186 | btuE | 谷胱甘肽过氧化物酶 |
| gene2387 | zwf | 葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶 |
| gene0451 | pxpA | 5-氧代脯氨酸酶(ATP水解型)亚基A |
2.8 次级代谢产物基因簇预测
由表5可知,基于antiSMASH分析预测,DN3-1基因组含有11个次级代谢产物生物合成基因簇。其中,5个基因簇与已知功能基因簇高度相似(相似度达100%),分别编码杆菌烯、泛革素、杆菌霉素、枯草菌素A和杆溶菌素;而表面活性素合成基因簇相似度达82%。此外,鉴定出1个三型聚酮合酶基因簇,其与已知基因簇相似度为16%。
表5 次级代谢产物合成区域鉴定结果Table 5 Identification results of secondary metabolite synthesis region |
| 基因位点 Genetic locus/bp | 产物类型 Product type | 最相似产物 Most similar product | 相似度 Similarity/% | 来源 Source |
|---|---|---|---|---|
| 348 576~413 964 | 非核糖体多肽类 | 表面活性素 | 82 | 贝莱斯芽孢杆菌FZB42 |
| 514 192~540 511 | 羊毛硫肽-Ⅲ类 | - | - | |
| 1 125 408~1 146 214 | 萜烯 | - | - | |
| 1 739 100~1 853 889 | 反式AT型酮聚合酶;三型聚酮 合酶;非核糖体多肽类 | 杆菌烯 | 100 | 贝莱斯芽孢杆菌FZB42 |
| 1 922 096~1 999 845 | 非核糖体多肽类;β内酯 | 泛革素 | 100 | 贝莱斯芽孢杆菌FZB42 |
| 2 104 061~2 125 959 | 萜烯 | - | - | |
| 2 174 418~2 215 515 | 三型酮聚合酶 | 碳青霉烯-3-羧酸 | 16 | 胡萝卜软腐坚固杆菌 |
| 3 120 157~3 171 934 | 非核糖体多肽金属载体; 非核糖体多肽类 | 杆菌霉素 | 100 | 贝莱斯芽孢杆菌 FZB42 |
| 3 699 577~3 721 188 | 塞克肽类 | 枯草菌素A | 100 | 枯草芽孢杆菌斯氏亚种 ATCC 6633 |
| 3 724 162~3 765 580 | 其他 | 杆溶菌素 | 100 | 贝莱斯芽孢杆菌FZB42 |
| 3 967 682~3 987 951 | 核糖体合成和翻译后修饰的 多肽(RiPP)识别元件 | - | - | - |
“-”代表该基因簇在数据库中尚未比对到同源序列。 | |
“-” means the gene cluster has not been identified in the database. |
2.9 DN3-1的耐酸、耐胆盐能力
由图8可知,DN3-1在不同pH(2.0、3.0和4.0)和胆盐浓度(0.1%、0.2%和0.3%)条件下均表现出良好的耐受性,存活率均保持在97%以上。在同一时间点时,不同pH和不同胆盐浓度下菌株的存活率均无显著差异(P>0.05)。以上结果表明,DN3-1具有良好的耐酸和耐胆盐特性,为其在胃肠道环境中的存活和应用提供了重要保障。
2.10 DN3-1的黏附性能
由表6可知,DN3-1的疏水率为(88.83±1.92)%,自聚集率为(68.06±1.75)%。以上结果表明,DN3-1表现出优异的表面疏水性和自聚集能力。
表6 DN3-1的黏附性能Table 6 Adhesion performance of DN3-1 |
| 项目 Items | 结果 Result |
|---|---|
| 疏水率 Hydrophobicity ratio | 88.83±1.92 |
| 自聚集率 Auto-aggregation ratio | 68.06±1.75 |
2.11 DN3-1的产酶能力
由图9可知,DN3-1具有蛋白酶[(7.21±0.39) U/mL]、脂肪酶[(33.46±2.29) U/mL]、淀粉酶[(114.94±0.70) U/mL]及纤维素酶[(2.76±0.08) U/mL]活性。以上结果表明,DN3-1表现出多种酶活性特征。
2.12 DN3-1的抗氧化性能
由图10可知,DN3-1发酵上清液和无细胞提取物均表现出抗氧化活性。DN3-1发酵上清液的总抗氧化能力、超氧化物歧化酶活性、还原型谷胱甘肽含量、DPPH自由基清除率及羟自由基清除率均显著高于无细胞提取物(P<0.05)。
2.13 DN3-1发酵上清液的抑菌能力
由图11可知,DN3-1发酵上清液对多种致病菌表现出优异的抑菌活性,DN3-1发酵上清液对E. coli、S. aureus、S.sonnei和L. monocytogenes的抑菌圈直径分别为(20.49±1.13) mm、(17.83±1.09) mm、(20.48±1.08) mm和(33.33±1.03) mm。
图11 DN3-1发酵上清液的抑菌能力A:DN3-1的抑菌效果;B:DN3-1发酵上清液的抑菌圈直径。A: antibacterial effect of DN3-1; B: diameter of inhibition zone by fermentation supernatant of DN3-1. E. coli:大肠杆菌 Escherichia coli; S. aureus:金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus;S. sonnei:宋内氏志贺氏菌 Shigella sonnei;L. monocytogenes:单核增生李斯特菌 Listeria monocytogenes。 Fig.11 Antibacterial ability of fermentation supernatant of DN3-1 |
3 讨论
联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)将益生菌定义为“适量摄入时对宿主健康有益的活微生物”[18]。利用地方猪种独特的肠道微生物资源,对开发新型饲料添加剂具有重要意义。本研究对DN3-1的益生特性及全基因组进行了系统分析,以期为开发新型微生物饲料添加剂提供理论依据。
益生菌的安全性评估是其临床应用和工业化开发的重要前提[19]。本研究结果显示,DN3-1在血琼脂平板上未表现出溶血活性,同时缺乏鸟氨酸、精氨酸和赖氨酸脱羧酶活性,这表明该菌株既不具备破坏宿主红细胞的能力,也不会产生腐胺、胍丁胺和尸胺等具有潜在毒性的生物胺。全基因组测序分析进一步证实,DN3-1不携带任何已知的毒力因子或致病相关基因。值得注意的是,虽然检测到13个耐药相关基因,但这些基因均定位于染色体上,且其基因组环境分析显示周围不存在前噬菌体、转座子等可移动遗传元件,表明其发生水平基因转移的风险极低[20]。综合表型和基因型分析结果,DN3-1展现出良好的安全特性,为其作为益生菌的进一步开发应用提供了重要的安全性基础。
具备一定的耐胃酸和耐胆盐能力是益生菌能够在体内发挥作用的重要前提,因而耐酸和耐胆盐特性成为了筛选益生菌的重要标准之一[21]。本研究发现,DN3-1对酸和胆盐耐受能力均高于97%,优于郑凯天等[22]从贵州香猪新鲜粪便中分离得到的枯草芽孢杆菌BSC43,表明该菌株具备良好的胃肠道环境耐受特性。KEGG数据库注释表明,DN3-1的基因组包含完整的F型氢离子(H+)/钠离子(Na+)转运ATP酶系统(atpA-atpI基因)。质子泵通过ATP水解排出细胞内多余的H+,从而维持细胞质pH稳态[23]。DN3-1中F型H+/Na+转运ATP酶系统的完整性确保了其在酸性条件下的高存活率。DN3-1基因组中鉴定到精氨酸脱亚氨基酶途径(arginine deiminase pathway,ADI)的关键基因(如arcA、arcD)。其中,arcA基因编码的精氨酸脱氨酶可通过产氨中和环境酸度并提供能量,表明该菌株在不利环境(如酸性胁迫)下可能通过激活ADI途径增强其耐酸能力[24]。
细菌的疏水性及自聚集能力与其黏附特性密切相关,是益生菌发挥功能的重要生理基础[29]。本研究发现,DN3-1表现出优良的表面疏水性和自聚集能力。进一步分析显示,DN3-1基因组中存在tuf基因,其编码的延伸因子EF-Tu可作为黏附素,可能介导菌体与宿主细胞的初始黏附,为定植过程提供分子基础[30]。此外,DN3-1携带完整的脂磷壁酸(LTA)合成相关基因,包括编码脂磷壁酸合成酶的ltaS基因以及dlt操纵子基因。在革兰氏阳性菌中,LTA作为细胞壁关键组分,通过分子间相互作用增强细菌对宿主细胞的黏附。其中,ltaS基因主导LTA的合成,而dlt操纵子基因则通过调节LTA上D-丙氨酸的修饰程度,改变细胞表面净电荷,削弱静电排斥以增强黏附[31-32]。这些遗传特征共同构成了DN3-1优异的黏附能力基础,为其潜在的益生功能提供了分子机制解释。
抗氧化活性是益生菌适应宿主体内环境、发挥益生功能以及应对生态竞争的重要基础[33]。本研究发现,DN3-1的发酵上清液和无细胞提取物均表现出抗氧化活性。DN3-1基因组中存在硫氧还蛋白系统(trxA、trxB)以及谷胱甘肽抗氧化系统(zwf、btuE和ggt)相关基因。其中,硫氧还蛋白系统可通过向硫醇依赖性过氧化物酶供电子而快速清除活性氧[34]。而在还原型谷胱甘肽的代谢过程中,zwf可通过提供烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸参与维持细胞内还原型谷胱甘肽的适当水平,btuE利用还原型谷胱甘肽进行抗氧化等反应并加速其氧化还原循环[35-36];同时,ggt表达的酶分解胞外的还原型谷胱甘肽,产生氨基酸前体被细胞吸收,进而用于胞内还原型谷胱甘肽的再合成[37]。此外,过氧化物酶系统中的ahpC和ahpF基因,可通过清除过氧化物,保护细胞免受氧化损伤[38]。菌株自身强大的抗氧化系统不仅保障了其在宿主肠道氧化环境中的生存,其分泌的抗氧化物质还可能被宿主肠道细胞利用或直接清除宿主肠道内的过量活性氧,从而减轻宿主因环境应激(如高温)、疾病或饲粮因素引起的肠道氧化损伤,维护肠道屏障功能[33]。
分泌抑菌物质是益生菌抵抗病原菌、发挥其益生作用的重要机制之一[39]。本研究证实,DN3-1具有广谱抗菌作用,即对革兰氏阳性致病菌(S. aureus、L. monocytogenes)和革兰氏阴性致病菌(E. coli、S. sonnei)均表现出明显的生长抑制作用,其中对S. aureus、L. monocytogenes及E. coli的抑制效果均强于枯草芽孢杆菌BSC43[22]。这一特性表明DN3-1可能通过分泌细菌素或其他抗菌代谢产物,从而抑制致病菌生长繁殖。基于antiSMASH的生物信息学分析表明,DN3-1基因组中含有6个编码潜在抑菌活性次级代谢产物的生物合成基因簇,其中与杆菌烯、泛革素、杆菌霉素、枯草菌素A以及杆溶菌素的相似度均达到100%,这些次级代谢产物可通过多种分子机制发挥抑菌作用。其中,杆菌烯通过抑制蛋白质合成干扰病原菌生长,泛革素和杆菌霉素作为脂肽类物质能够破坏细胞膜完整性,枯草菌素A增加细胞膜通透性以裂解细菌,而杆溶菌素则通过特异性干扰来抑制细菌细胞壁肽聚糖的合成[40-44]。这些基因簇的存在为解释DN3-1表现出的广谱抑菌活性提供了分子基础,也表明该菌株可能通过多靶点、多机制的协同作用实现对病原菌的有效抑制。这种抑菌能力使得DN3-1作为饲料添加剂具有替代或减少抗生素使用的潜力,直接保护猪只免受肠道病原侵袭,降低腹泻等疾病发生率,从而提高猪群健康水平和生产效益。
益生菌可通过分泌多种消化酶增强宿主的营养吸收功能[45]。本研究发现,DN3-1可分泌淀粉酶和纤维素酶。与袁林等[46]从仔猪粪便中分离的枯草芽孢杆菌GZ-0107、GZ-0183和SR-096相比,DN3-1表现出更高的淀粉酶活性,但其纤维素酶活性相对较低,这可能是由于菌株对不同碳源利用的代谢调控机制存在偏好。通过CAZy数据库预测到DN3-1基因组存在丰富的GHs和GTs家族基因。GHs可以以内切或外切方式水解各种含糖化合物(包括单糖苷、寡糖、多糖、皂甙和糖蛋白等)中的糖苷键,生成单糖、寡糖或糖复合物[47]。而GTs是一类能够催化活化糖供体向蛋白质、脂质、碳水化合物及其他小分子等多种受体转移糖基的酶,可参与糖蛋白、糖脂和多糖的合成[48]。这表明DN3-1具备强大的碳水化合物代谢潜能。笔者推测DN3-1可能通过分泌淀粉酶分解饲料淀粉,通过分泌纤维素酶等GHs直接降解植物细胞壁纤维素,产生可利用糖类。这种高效的碳水化合物分解能力,一方面提升饲料能量与营养物质的利用率,支持宿主生长;另一方面其降解产物(如短链脂肪酸)可为肠上皮细胞供能,维持肠道酸性健康环境并抑制病原菌[49]。因此,DN3-1的CAZy酶谱可能构成了滇南小耳猪长期进化中适应粗放饲养、形成耐粗饲特性的重要微生物学基础。DN3-1所蕴含的CAZy潜能为开发提升畜禽粗饲料利用效率的益生菌制剂提供了重要候选资源。
4 结论
滇南小耳猪源DN3-1是一株安全且具有优良益生潜力的菌株,其安全性体现在无溶血活性、不产生有害生物胺、未携带毒力因子,且耐药基因的传播风险低。在益生功能上,DN3-1具备强大的胃肠环境耐受性、优异的黏附能力、显著的抗氧化与广谱抑菌活性,并能分泌多种消化酶。DN3-1全基因组分析结果进一步从分子层面揭示了其上述特性的基础,鉴定出大量与耐受、黏附、抗氧化相关的功能基因,丰富的次级代谢产物合成基因簇,以及多样的碳水化合物酶编码基因。因此,DN3-1展现出作为饲用微生态制剂的良好开发前景。