我国每年产生的农业资源废弃物储量庞大,目前主要采取微生物降解纤维素以提高这类资源的利用率[1-2]。纤维素降解常见的方法有物理降解法、化学降解法和生物降解法[3-4]。其中,物理降解法包括机械粉碎法、超声波处理法、冷冻粉碎法等,这类方法能量成本较高;化学降解法包括酸碱处理法、有机溶剂法等,此类方法易造成环境污染;生物降解法则是利用青霉菌、木霉菌、链霉菌和芽孢杆菌等纤维素降解菌来处理纤维素,具有反应条件温和、对环境友好、生产成本相对较低等优势[5]。因此,利用微生物产纤维素酶来降解纤维素成为当前研究热点[6-7]。具有降解纤维素功能的微生物中,主要的真菌包括木霉菌、曲霉菌和青霉菌等[8-9],但真菌在降解纤维素过程中通常需要较长的代谢周期;相比之下,细菌在纤维素酶生产方面具有发酵周期短、培养条件简单、环境适应能力较强等特点,且细菌来源的纤维素酶具有真菌来源的所不具备的耐碱性、耐热性等,这对实际的工业生产有重要作用[10-11]。在纤维素降解细菌中,芽孢杆菌广泛存在于自然环境中,在适宜的条件下能够迅速生长,具有较强的产酶特性[12-13]。纤维素酶在酿造、造纸、中药提取等方面均有广泛应用。因此,优化细菌产酶条件对提高酶活力具有重要意义。
博落回属于罂粟科,是一种多年生直立草本植物,也是我国传统中药材。该植物在我国资源较为丰富,主要分布于长江流域以南至南岭以北的地区[14]。博落回的活性成分主要为异喹啉类生物碱,包括血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、α-别隐品碱、β-别隐品碱等[15-16]。研究表明,博落回中的活性成分具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤等生物学作用[17]。
博落回生物碱作为天然的植物源抗生素,具有绿色、环保等特点,因此对其开展应用研究兼具重要的理论意义与经济价值。目前,博落回生物碱的提取方法主要有逆流法、沸腾法、超声法和层析柱法等[18-19],这些方法通常操作繁琐、设备成本较高;另有一些方法,如酸水溶解、碱沉析晶、加热回流等,虽降低了设备要求,但存在过程繁杂不利于工业生产及溶剂污染等问题[20-21]。近年来,利用产酶微生物处理博落回逐渐受到关注,该方法不仅绿色环保、有助于降低生产成本,还能通过改变植物细胞壁的通透性,有效提高生物碱的提取率[22]。
本研究选用可产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)为发酵菌种,以稻壳、玉米皮、苜蓿、稻秆等农业资源作为碳源,首先对其产酶发酵条件进行优化,随后将所得纤维素酶应用于博落回生物碱的提取,并通过优化酶解条件进一步提高提取率,以期为后续博落回生物碱的规模化生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与碳源
解淀粉芽孢杆菌1-4分离自西藏藏猪粪便样品,保藏于长江大学生命科学学院微生物实验室。稻壳、玉米皮、苜蓿、稻秆、博落回原料均由湖北博瑞生物科技股份有限公司提供,经粉碎并过100目筛后,分装于无菌袋中备用。
1.1.2 试剂
牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、酵母浸粉、葡萄糖、羧甲基纤维素钠、柠檬酸、柠檬酸钠、酒石酸钾钠、盐酸、氢氧化钠、苯酚、亚硫酸钠均由国药集团化学试剂公司提供,以上试剂中的化学试剂均为分析纯。博落回生物碱标准品购自上海源叶生物科技有限公司。
3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂:称取45.5 g酒石酸钾钠溶于125 mL热水后再分别加入1.575 g 3,5-二硝基水杨酸、65.5 mL 2 mol/L氢氧化钠溶液、1.25 g苯酚、1.25 g亚硫酸钠,冷却后定容至250 mL,阴凉避光条件下保存7 d后使用。
0.05 mol/L柠檬酸缓冲液(pH=4.8):称取柠檬酸0.644 g、柠檬酸钠1.059 g,用蒸馏水溶解后倒入容量瓶,定容至100 mL。
1%羧甲基纤维素钠溶液:称取1.0 g羧甲基纤维素钠,用100 mL柠檬酸缓冲液溶解。
葡萄糖标准溶液(1 mg/mL):将葡萄糖于80 ℃烘至恒重,称取0.1 g烘干后的葡萄糖,用少量蒸馏水充分溶解后倒入100 mL容量瓶中,再用蒸馏水定容至100 mL。
1.1.3 培养基
牛肉膏蛋白胨培养基(固体):牛肉膏3 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化钠5 g/L,琼脂20 g/L,pH 7.0,121 ℃高压20 min灭菌。
种子培养基:牛肉膏3 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化钠5 g/L,pH 7.0,121 ℃高压20 min灭菌。
发酵产酶培养基:碳源11 g/L,蛋白胨10 g/L,磷酸氢二钾6.0 g/L,七水硫酸镁1.0 g/L,酵母浸粉5.0 g/L,pH 7.0,121 ℃高压20 min灭菌。
1.2 方法
1.2.1 菌种活化与种子液制备
菌种活化:将保藏的解淀粉芽孢杆菌1-4菌株接种至牛肉膏蛋白胨培养基(固体),在恒温培养箱中37 ℃培养24 h。
种子液制备:从试管斜面挑取1-2环已活化的菌种,接种至种子培养基,在恒温振荡培养箱(37 ℃、180 r/min)中培养24 h。
1.2.2 解淀粉芽孢杆菌产纤维素酶发酵条件优化
单因素试验:将种子液按一定的接种量接种于体积规格为49 mm×41 mm×32 mm的装有100 mL发酵产酶培养基的广口培养瓶中,37 ℃、180 r/min振荡培养48 h。考察碳源种类(稻壳、玉米皮、苜蓿和稻秆)、碳源添加量(9、11、13、15、17 g/L)、接种量(2%、4%、6%、8%,v/v)、初始pH(5、6、7、8、9)对羧甲基纤维素酶活力的影响。
响应面试验:基于单因素试验数据,固定碳源为苜蓿,选取苜蓿添加量(A)、接种量(B)和初始pH(C)这3个因素为自变量,以羧甲基纤维素酶活力(Y)为响应值,采用Box-Behnken设计进行响应面试验。Box-Behnken设计的因素与水平见表1。
表1 Box-Behnken设计的因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design |
| 水平 Levels | 因素 Factors | ||
|---|---|---|---|
| 苜蓿添加量 Alfalfa addition amount (A)/(g/L) | 接种量 Inoculation volume (B)/% | 初始pH Initial pH (C) | |
| -1 | 11 | 6 | 6.0 |
| 0 | 13 | 8 | 6.5 |
| 1 | 15 | 10 | 7.0 |
1.2.3 发酵液酶解博落回提取生物碱试验
采用响应面试验优化后的发酵条件生产纤维素酶,发酵结束后向100 mL发酵液中加入0.25 g博落回粉,在不同温度(37、40 ℃)下进行酶解不同时间(1.5、3.0、5.0、10.0 h);酶解结束后,酶解液在15 455×g条件下离心7 min;取上清液10 mL调节pH至9~10,恒温静置24 h后,在8 694×g条件下离心10 min,得博落回生物碱沉淀。测定在不同酶解时间(1.5、3.0、5.0、10.0 h)及酶解温度(37、40 ℃)下所得博落回生物碱的浓度,以确定发酵液酶解博落回提取生物碱的最佳酶解时间和酶解温度。
1.2.4 指标检测
葡萄糖标准曲线的制作:将浓度为1 mg/mL的葡萄糖标准溶液与适量蒸馏水进行梯度稀释,制备成系列浓度梯度的葡萄糖标准溶液;再添加3 mL DNS试剂后充分混匀,置于沸水浴反应5 min;待反应体系终止后,将样品用25 mL容量瓶定容;在540 nm波长处测定吸光度值,其中以蒸馏水为空白对照,以葡萄糖浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,制作葡萄糖标准曲线。
羧甲基纤维素酶活力的测定:参照吕宗浩[23]的方法并稍作改动。具体步骤如下:在不同发酵条件下培养48 h后,将发酵液倒入离心管中,10 733×g离心5 min,取上清液作为粗酶液;取粗酶液0.5 mL,60 ℃水浴预热10 min后加入0.5 mL 1%羧甲基纤维素钠溶液,再在60 ℃水浴条件下催化反应10 min;反应结束后加入1.25 mL DNS试剂,混匀煮沸5 min使样品显色;取出冷却,在540 nm处测定吸光度值。为消除粗酶液中原有还原糖及其他可能干扰物质带来的本底吸光度,设置空白对照。其操作如下:取等量粗酶液先加1.25 mL DNS试剂钝化酶活,再60 ℃水浴预热10 min后加入0.5 mL 1%羧甲基纤维素钠溶液,60 ℃水浴10 min后煮沸5 min,在540 nm处测定吸光度值。根据葡萄糖标准曲线的回归方程,分别计算出样品与空白对照反应体系产生的葡萄糖量,以两者差值表示酶反应实际生成的葡萄糖量。羧甲基纤维素酶活力定义为每分钟水解羧甲基纤维素生成1 μg葡萄糖的量为1个酶活力单位(U)。根据如下公式计算羧甲基纤维素酶活力:
羧甲基纤维素酶活力(U/mL)=葡萄糖浓度(mg/mL)×反应液体积(mL)×1 000/[粗酶液体积(mL)×反应时间(min)]。
博落回生物碱标准曲线的制作:准确称取10 mg博落回生物碱标准品于10 mL 60%乙醇中,超声30 min使其溶解,加60%乙醇定容至100 mL,配成标准品母液。将母液逐级稀释,配制7个不同浓度的标准工作液。以60%乙醇为空白对照,在284 nm波长下测定吸光度值,以博落回生物碱浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制博落回生物碱标准曲线。
博落回生物碱浓度的测定:在所得生物碱沉淀中加入5 mL的盐酸溶液(pH 5),充分振荡使沉淀完全溶解,在284 nm波长下测定吸光度值。将所得吸光度值代入博落回生物碱的标准曲线回归方程,计算得出博落回生物碱的浓度(μg/mL)。
1.3 统计分析
采用Design-Expert 10.0.7软件进行Box-Behnken响应面试验设计与数据分析。运用SPSS 27.0软件进行单因素方差分析和Duncan氏多重比较。试验数据以平均值±标准差表示,显著性水平设定为:P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。使用Origin 8.5 软件绘图。
2 结果与分析
2.1 葡萄糖标准曲线
葡萄糖标准曲线如图1所示,该标准曲线的线性回归方程为y=0.701 45x+0.007 18,其决定系数(R2)高达0.996,表明在该线性范围内,葡萄糖浓度与吸光度值呈良好的正比关系,可用于准确定量。
2.2 解淀粉芽孢杆菌产纤维素酶发酵条件优化的单因素试验结果
2.2.1 碳源种类对羧甲基纤维素酶活力的影响
碳源种类显著影响羧甲基纤维素酶活力(P<0.05),羧甲基纤维素酶活力在苜蓿为碳源时达到峰值,在稻秆为碳源时最低(图2)。因此,确定以苜蓿为最优碳源,并进一步考察其添加量对羧甲基纤维素酶活力的影响。
2.2.2 苜蓿添加量对羧甲基纤维素酶活力的影响
苜蓿添加量同样显著影响羧甲基纤维素酶活力(P<0.05),如图3所示,苜蓿添加量在9~13 g/L时,羧甲基纤维素酶活力随添加量的提升而增加,超过13 g/L后,羧甲基纤维素酶活力则呈下降趋势。苜蓿添加量为13 g/L时羧甲基纤维素酶活力最高,表明适量添加苜蓿能够提高发酵产酶水平。因此,后续试验将苜蓿添加量优化为13 g/L。
2.2.3 接种量对羧甲基纤维素酶活力的影响
接种量对羧甲基纤维素酶活力的影响如图4所示,随着接种量的增大,羧甲基纤维素酶活力呈现逐步上升的趋势。因此,选取8%作为优化后的接种量。
2.2.4 初始pH对羧甲基纤维素酶活力的影响
2.3 解淀粉芽孢杆菌产纤维素酶发酵条件优化的响应面试验结果
2.3.1 响应面试验与数据回归分析
表2 发酵条件优化Box-Behnken试验设计与结果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment for fermentation condition optimization |
| 编号 No. | 因素Factors | 羧甲基纤维素酶活力 CMCase activity/ (U/mL) | ||
|---|---|---|---|---|
| 苜蓿添加量 Alfalfa addition amount (A)/(g/L) | 接种量 Inoculation volume (B)/% | 初始pH Initial pH(C) | ||
| 1 | 0 | 0 | 0 | 154.2 |
| 2 | -1 | -1 | 0 | 48.8 |
| 3 | 0 | -1 | 1 | 89.0 |
| 4 | 0 | 1 | -1 | 121.4 |
| 5 | 1 | -1 | 0 | 73.6 |
| 6 | 0 | 0 | 0 | 134.2 |
| 7 | 1 | 1 | 0 | 95.4 |
| 8 | 0 | -1 | -1 | 52.2 |
| 9 | -1 | 0 | 1 | 59.2 |
| 10 | -1 | 0 | -1 | 93.8 |
| 11 | 1 | 0 | 1 | 77.0 |
| 12 | 0 | 0 | 0 | 144.2 |
| 13 | 0 | 0 | 0 | 187.6 |
| 14 | -1 | 1 | 0 | 58.6 |
| 15 | 0 | 0 | 0 | 221.0 |
| 16 | 1 | 0 | -1 | 64.0 |
| 17 | 0 | 1 | 1 | 44.0 |
表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model |
| 方差来 Source of variance | 平方和 Sum of squares | 自由度 Freedom | 均方 Mean square | F值 F-value | P值 P-value | 显著性 Significance |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 模型 Model | 37 116.31 | 9 | 4 124.03 | 4.96 | 0.023 2 | * |
| A | 307.52 | 1 | 307.52 | 0.37 | 0.562 3 | NS |
| B | 389.21 | 1 | 389.21 | 0.47 | 0.515 9 | NS |
| C | 483.61 | 1 | 483.61 | 0.58 | 0.470 6 | NS |
| AB | 36.00 | 1 | 36.00 | 0.044 | 0.841 1 | NS |
| AC | 566.44 | 1 | 566.44 | 0.68 | 0.436 4 | NS |
| BC | 3 260.41 | 1 | 3 260.41 | 3.92 | 0.088 2 | NS |
| A2 | 11 013.94 | 1 | 11 013.94 | 13.24 | 0.008 3 | ** |
| B2 | 9 699.03 | 1 | 9 699.03 | 11.66 | 0.011 2 | * |
| C2 | 8 002.21 | 1 | 8 002.21 | 9.62 | 0.017 3 | * |
| 残差 Residual | 5 821.28 | 7 | 831.61 | |||
| 失拟项 Lack of fit | 729.09 | 3 | 243.03 | 0.19 | 0.897 5 | NS |
| 纯误差 Pure error | 5 092.19 | 4 | 1 273.05 | |||
| 总和 Sum total | 42 937.60 | 16 |
A:苜蓿添加量(g/L);B:接种量(%);C:初始pH。模型的决定系数(R2)=0.864 4,变异系数(CV)=28.84%,信噪比(AP)=5.468。ND表示影响不显著(P>0.05),*表示影响显著(P<0.05),**表示影响极显著(P<0.01)。 | |
A: alfalfa addition amount (g/L); B: inoculation volume (%); C: initial pH. The coefficient of determination (R2) of the model was 0.864 4, the coefficient of variation (CV) was 28.84%, and the adequate precision (AP) was 5.468. ND indicated no significant effect (P>0.05), * indicated significant effect (P<0.05), and ** indicated extremely significant effect (P<0.01). |
使用软件Design-Expert 10.0.7进行回归分析,得到回归模型,生成多元二次回归方程:
Y=168.24+6.2A+6.98B-7.78C+3AB+11.9AC-28.55BC-51.15A2-48B2-43.6C2。
由表3的方差分析结果可知,该模型显著(P<0.05),失拟项不显著(P>0.05),信噪比(AP)为5.468,大于4,说明模型预测值与试验观测值之间有较高的吻合度,受干扰程度较低,可用于预测最佳产酶条件。
模型的方差分析显示,一次项与交互项对结果的影响均不显著(P>0.05);二次项中A2对结果的影响极显著(P<0.01),B2、C2对结果的影响显著(P<0.05)。因此,各试验因素对解淀粉芽孢杆菌1-4产羧甲基纤维素酶活力的影响不是简单的线性关系。表3中的F值与各因素对响应变量的贡献度呈正相关,其中C(初始pH)对菌株产酶活力的影响最大,其次为B(接种量),A(苜蓿添加量)的影响相对较小。
2.3.2 响应面各因素交互作用分析
使用Design-Expert 10.0.7软件,通过对苜蓿添加量、接种量、初始pH这3个因素对响应值羧甲基纤维素酶活力的交互作用进行分析,根据回归方程绘制等高线图和三维立体响应面图(图6)。苜蓿添加量与接种量以及苜蓿添加量与初始pH的交互作用对羧甲基纤维素酶活力的调控能力较弱;接种量与初始pH之间存在较强的交互作用,随着两因素水平的增加,羧甲基纤维素酶活力先上升后下降,拟合曲线有最大值。
2.3.3 验证试验
使用Design-Expert 10.0.7软件分析,根据模型预测出的解淀粉芽孢杆菌1-4的最佳产酶条件为苜蓿添加量13.101 g/L,接种量8.22%(v/v),初始pH 6.441,此条件下模型预测的羧甲基纤维素酶活力达到169.24 U/mL。为了便于实际操作,将最佳工艺参数修改为苜蓿添加量13 g/L、接种量8%(v/v)、初始pH 6.5,在此条件下进行验证试验,设置5个平行,测得羧甲基纤维素酶活力为168.24 U/mL,相对误差为0.5%,与模型所得预测值接近,这表明所选择的响应面优化模型能够较好地预测该解淀粉芽孢杆菌所产羧甲基纤维素酶的活力。
2.4 博落回生物碱标准曲线
博落回生物碱标准曲线如图7所示,该标准曲线的线性回归方程为y=0.040 3x+0.095 96,其R2高达0.999 5,说明该标准曲线具有良好的线性,可用于准确定量分析。
2.5 发酵液酶解博落回提取生物碱的试验结果
2.5.1 酶解时间对博落回生物碱浓度的影响
发酵液在37 ℃下分别酶解博落回粉1.5、3.0、5.0、10.0 h后所得酶解液中博落回生物碱的浓度如图8所示。随着酶解时间的增加,博落回生物碱浓度呈现先增大后下降的趋势,在酶解时间为5.0 h时,博落回生物碱浓度达到最大,为139.09 μg/mL。因此,确定最佳酶解时间为5 h。
2.5.2 酶解温度对博落回生物碱浓度的影响
3 讨论
3.1 产纤维素酶的微生物
在自然环境中,产纤维素酶的微生物有真菌、放线菌和细菌等。产纤维素酶的真菌主要包括木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)和根霉属(Rhizopus)等[24-25],真菌分泌的胞外酶具有含纤维素酶的多酶系特点;产纤维素酶的放线菌主要有链霉菌属(Streptomyces)、诺卡氏菌属(Nocardia)和高温单胞菌属(Thermomonospora)等[25-26],放线菌具有繁殖缓慢、降解纤维素能力弱的特点[27];产纤维素酶的代表性细菌有芽孢杆菌属(Bacillus)和梭菌属(Clostridium)等[28],细菌在纤维素酶生产方面具有发酵周期短、培养条件简单、环境适应能力较强等特点[29]。本研究选用的解淀粉芽孢杆菌1-4具有稳定性好、环境适应性高、高产酶活性等优势,适合在工农业领域应用。
3.2 发酵条件对解淀粉芽孢杆菌产纤维素酶活力的影响
适宜的发酵条件对于微生物的生长代谢有着促进作用,可以提高微生物代谢产物产率,缩短发酵周期,降低发酵成本。本研究中,苜蓿添加量、接种量和初始pH是影响解淀粉芽孢杆菌1-4产纤维素酶活力的主要因素。微生物的代谢活动与产物合成高度依赖于碳源,其理化与结构差异直接影响菌体生长[30]。纤维素酶属诱导型酶类,其合成受特定机制调控,添加相应诱导剂是提高发酵产率的有效策略[31]。苜蓿作为碳源,在提供营养的同时,还能通过诱导作用促进纤维素酶的合成,从而提升菌株产酶能力[32]。接种量同样可以影响微生物的生长和所产酶的活力,过大或者过小的接种量都不利于菌株产酶效率[33]。接种量过小,生物量较少,生长缓慢产酶效率低;接种量过高可能导致菌体浓度迅速增加,快速消耗营养组分,加快菌种衰退,抑制纤维素酶活力[30]。pH是微生物发酵的一个重要参数。培养基的初始pH影响微生物的生长代谢,进而调控其产酶活性响[34]。菌株在适宜的pH条件下生长良好,代谢旺盛,从而最终表现为较高的产酶活性[32]。
3.3 纤维素酶的应用
4 结论
本研究选用可产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌1-4,通过单因素试验及响应面试验优化其产酶条件,确定最佳发酵条件为:以苜蓿为碳源,添加量13 g/L,接种量8%(v/v),初始pH 6.5,37 ℃、180 r/min振荡培养48 h。在此发酵条件下,所产羧甲基纤维素酶活力达168.24 U/mL。将该发酵液用于提取博落回生物碱,进一步优化酶解条件发现,在37 ℃酶解5 h时提取效率最高,生物碱浓度可达139.09 μg/mL。