Chinese Journal of Animal Nutrition >

2026 , Vol. 38 >Issue 4: 2994 - 3002

DOI: https://doi.org/10.12418/CJAN2026.240

RESEARCH PAPER

Establishment of an Oxidative Damage Model in Donkey Mammary Epithelial Cells Induced by Diethylenetriamine/Nitric Oxide Polymer

  • ZHANG Yue ,
  • MENG Fanzhu ,
  • ZHAO Yanli ,
  • GUO Yongmei ,
  • GUO Xiaoyu ,
  • ZHANG Qingyue ,
  • YAN Sumei , *
Expand
  • Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science at Universities of Inner Mongolia Autonomous Region, College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China
*professor, E-mail:

Received date: 2025-10-31

  Online published: 2026-04-14

Fold

Abstract

This experiment aimed to investigate the conditions for inducing oxidative damage in donkey mammary epithelial cells (DMECs) using diethylenetriamine/nitric oxide polymer (DETA/NO), in order to establish a reliable cellular oxidative damage model for research related to donkey mammary glands. In experiment 1, F2 generation DMECs cultured in vitro were treated with varying concentrations (0, 200, 400, 600, 800, 1 000 and 1 200 μmol/L) of DETA/NO as a stressor for 2, 4, 6 and 8 h to simulate an oxidative damage environment caused by excessive nitric oxide (NO) accumulation in vivo, and to identify the suitable DETA/NO treatment time based on the cell proliferation rate. In experiment 2: based on the suitable DETA/NO treatment time (6 h) identified in experiment 1, DMECs were treated with different concentrations (0, 200, 400, 600, 800, 1 000 and 1 200 μmol/L) of DETA/NO for 6 h. Using oxidative stress and inflammatory response indicators as criteria, the optimal DETA/NO concentration for establishing the DMEC oxidative damage model was further determined. Additionally, to validate the successful establishment of the DETA/NO-induced oxidative damage model in DMECs, the expression of genes related to antioxidant and inflammatory factors were measured in the oxidative damaged DMECs. The results showed as follows: 1) when DMECs were treated with 1 000 μmol/L DETA/NO for 6 h, the cell proliferation rate was 66.61%, which falled within the suitable range (60% to 70%) for establishing a cellular oxidative damage model. Thus, 6 h was selected as the suitable DETA/NO treatment time. 2) DETA/NO at concentrations of 800 to 1 200 μmol/L induced oxidative damage in DMECs compared with the control group (0 μmol/L), as indicated by significantly reduced activities of catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and superoxide dismutase (SOD) (P<0.05), along with significantly elevated levels of the interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) (P<0.05). Furthermore, compared with the 800 μmol/L group, the 1 000 and 1 200 μmol/L groups exhibited even lower activities of the aforementioned antioxidant enzymes and higher levels of inflammatory factors such as IL-1β. However, no significant differences were observed in these indicators between the 1 000 and 1 200 μmol/L groups (P>0.05). Considering that the cell proliferation rate in the 1 200 μmol/L group was relatively lower (58.6%), 1 000 μmol/L was selected as the optimal DETA/NO treatment concentration for establishing the oxidative damage model. Validation of the DMEC oxidative damage model established by treatment with 1 000 μmol/L DETA/NO for 6 h, the results showed that the mRNA relative expression levels of CAT and GPx1 in the 1 000 μmol/L group were significantly lower than those in the control group (P<0.05), while the mRNA relative expression levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α were significantly higher (P<0.05). In summary, treatment with 1 000 μmol/L DETA/NO for 6 h can successfully establish an oxidative damage model in DMECs.

Key words： donkey; mammary epithelial cells; nitric oxide; oxidative damage model

Cite this article

ZHANG Yue , MENG Fanzhu , ZHAO Yanli , GUO Yongmei , GUO Xiaoyu , ZHANG Qingyue , YAN Sumei . Establishment of an Oxidative Damage Model in Donkey Mammary Epithelial Cells Induced by Diethylenetriamine/Nitric Oxide Polymer[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2026 , 38(4) : 2994 -3002 . DOI: 10.12418/CJAN2026.240

驴乳是一种高营养价值的功能性乳品,不仅具有低脂、低乳糖和低致敏性的特点,而且抗氧化和抗菌活性强,富含乳清蛋白、溶菌酶,是一种可代替人乳的优质动物乳[1-2]。乳腺组织是哺乳动物在泌乳期新陈代谢最旺盛的组织之一,因其代谢强度高很容易引起活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮等自由基的积累,导致氧化应激,降低乳腺抗氧化能力和产奶性能[3]。乳中活性物质和营养成分主要是由乳腺上皮细胞合成并分泌的[4]。因此,深入探究驴乳腺上皮细胞(donkey mammary epithelial cells,DMECs)的氧化损伤机制,对提高细胞的抗氧化能力以及提升产奶量和乳中活性物质含量具有重要的意义。一氧化氮(nitric oxide,NO)在体内具有双重作用,生理剂量的NO在机体内起到神经传递和免疫调节作用,但高剂量的NO不仅能诱导脂质过氧化,还会放大炎症反应,对机体造成严重损伤[5-6]。氧化应激可以通过激活核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)等信号通路来启动诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的转录,产生高浓度的NO[6]。建立体外细胞氧化损伤模型已成为研究氧化应激发生机制的关键环节。对奶牛和猪等家畜的乳腺上皮细胞的研究已较为成熟[7-8],但关于DMECs的研究相对滞后,构建DMECs氧化损伤模型对于模拟和防治驴乳腺组织氧化应激具有重要意义。乙烯三胺/一氧化氮聚合物(diethylenetriamine/nitric oxide polymer,DETA/NO)可作为一种外源性NO供体,通过缓慢释放NO分子,在多种氧化损伤和疾病模型构建中发挥关键作用。本课题组前期研究发现,DETA/NO可引起奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)和外周血单个核细胞的氧化损伤[9-10]。基于此,本试验将DETA/NO诱导氧化损伤模型研究体系应用于驴这一特色物种,建立DETA/NO诱导的DMECs氧化损伤模型,明确DETA/NO对DMECs的损伤规律,以期确定DETA/NO的适宜处理时间与浓度,为深入阐明驴乳腺的氧化应激机制以及通过营养调控措施提高其抗氧化能力和产奶性能奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试剂配制

饥饿培养基的配制:在100 mL DMEM(百迪生物科技公司)中添加2 mL青霉素-链霉素溶液(Gibco,美国)、0.5 mL胰岛素-转铁蛋白-硒溶液(Gibco,美国),加入终浓度为10 ng/mL的表皮生长因子(Sigma,美国)、终浓度为2.5 μg/mL的两性霉素B(Sigma,美国)和终浓度为1 μg/mL氢化可的松(Sigma,美国)。
完全培养基的配制:在100 mL饥饿培养基中添加10 mL胎牛血清(上海逍鹏生物科技有限公司)。
DETA/NO工作液的配制:取0.1 g DETA/NO(Abcom,英国)溶于6.128 mL高压过滤超纯水中配成100 mmol/L的DETA/NO贮备液,使用饥饿培养基按照试验设计要求稀释成不同浓度DETA/NO工作液。

1.2 DMECs的分离与培养

本试验已获得内蒙古农业大学实验动物福利与伦理委员会的许可(NND2021050)。选用内蒙古草原御驴科技牧业有限公司饲养的5岁泌乳期母驴,采集乳腺组织。DMECs的分离培养及传代参照孟凡珠等[11]的方法。乳腺组织用含0.6%青霉素-链霉素溶液的杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)(Gibco,美国)漂洗3次,75%乙醇浸泡30 s,再用含0.2%青霉素-链霉素溶液的DPBS漂洗3次;取腺泡丰富的部位剪碎,加入等体积1 mg/mL的Ⅳ型胶原酶(Sigma,美国)于37 ℃消化1 h;80目细胞滤网过滤,滤液222×g离心3 min,重悬清洗沉淀;完全培养基重悬DMECs后接种至25 cm2透气培养瓶,37 ℃、5% CO2培养箱(Forma-311,Thermo,美国)恒温培养。当细胞汇合度达到80%~90%时传代,使用0.25%胰蛋白酶(Gibco,美国)消化贴壁的DMECs,收集细胞后离心,重悬,接种至培养瓶连续传代2次,得到F2代DMECs进行后续试验。

1.3 试验设计

试验1:采用单因子完全随机试验设计,将传代纯化后的F2代DMECs随机分为7个组,每组6个重复,贴壁细胞汇合度达70%时加入饥饿培养基培养6 h,之后按照组别换成0、200、400、600、800、1 000、1 200 μmol/L的DETA/NO工作液进行处理,处理时间分别为2、4、6、8 h,其中0 μmol/L为对照组,另设不含细胞的工作液为空白组,通过测定细胞增殖率筛选适宜的DETA/NO处理时间。
试验2:DETA/NO处理时间根据试验1的结果确定,进一步研究不同DETA/NO处理浓度对细胞抗氧化指标和炎症因子的影响,筛选出适宜的DETA/NO处理浓度,并测定对照组(0 μmol/L)和DETA/NO损伤组(筛选出的适宜处理浓度:1 000 μmol/L)抗氧化和炎症因子相关基因的表达情况,验证DETA/NO诱导的DMECs氧化损伤模型建立是否成功。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 细胞增殖率

使用CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)测定细胞增殖率。将96孔板中的DMECs按照试验1中的设计处理相应时间,每孔加入20 μL的CCK试剂培养3 h,测定450 nm下的吸光度(OD)值,利用如下公式计算细胞增殖率:
细胞增殖率(%)=[(试验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100。

1.4.2 氧化应激和炎症相关指标的检测

收集不同浓度DETA/NO处理后的DMECs及细胞培养液。将细胞裂解后采用二硫代二硝基苯甲酸法检测细胞内谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)活性。细胞培养液中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量采用硫代巴比妥酸法检测,白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、ROS和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性采用羟胺法检测,iNOS和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性采用比色法检测,总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)采用ABTS法检测。GPx、MDA、SOD、iNOS和T-AOC检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所,其余试剂盒购自北京华英生物技术研究所。

1.4.3 抗氧化和炎症相关基因表达的检测

使用TRIzol法提取对照组和适宜DETA/NO处理浓度组DMECs的总RNA,反转录为cDNA(Labcycler,SensoQuest,德国)后,使用TB Green染料,在LightCycler 480型实时荧光定量PCR仪(Roche,美国)上进行实时荧光定量PCR,所用引物序列见表1。以磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和β-肌动蛋白(β-actin)作为双内参基因,利用2-△△Ct法计算目的基因GPx1、CAT、IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB p50、NF-κB p65、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptors γ,PPARγ)的mRNA相对表达量。
表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因名称
Gene names		 引物序列
Primer sequences (5'—3')		 产物长度
Product length/bp
磷酸甘油醛脱氢酶
GAPDH		 F:GATGCCCCAATGTTTGTGA
R:AAGCAGGGATGATGTTCTGG		 250
β-肌动蛋白
β-actin		 F: ACTGGGACGACATGGAGAAGA
R: GCGTACAGGGACAGCACAG		 199
谷胱甘肽过氧化物酶1
GPx1		 F:CAGTTCGGGCATCAGGAGAAC
R:CACCTCGCACTTCTCAAAGAG		 114
过氧化氢酶
CAT		 F:TCAACAGTGCCAACGAGGACAAC
R:AGTTCTTGACCGCTTTCTTCTGGATG		 150
白细胞介素-1β
IL-1β		 F:AGCGGCAATGAGAATGACCTGTTC
R:GTTGTAGAGGTGGTGGGAGAATTGAAG		 132
白细胞介素-6
IL-6		 F:AGCGGCAATGAGAATGACCTGTTC
R:GTTGTAGAGGTGGTGGGAGAATTGAAG		 98
肿瘤坏死因子-α
TNF-α		 F:AGCCTCTTCTCCTTCCTCCTTGTC
R:CATTCGGTAACTGCTCTTCCCTCTG		 100
核因子-κB p50
NF-κB p50		 F:GGCAGAAGGCGGAGGAGACC
R:CATGAGTCGCACCACGCTGAG		 109
核因子-κB p65
NF-κB p65		 F:CTGCATCCACAGCTTCCAGAACC
R:CATAGCCGCACCGCATTCAGG		 156
过氧化物酶体增殖物激活受体γ
PPARγ		 F:CCACTGACCAAAGCGAAGG
R:CCCTGAAAGATGCGGATGG		 173

1.5 数据统计分析

采用SAS 9.2软件对细胞增殖率、氧化应激和炎症相关指标数据进行单因素方差分析,并采用Duncan氏法进行组间多重比较;对抗氧化和炎症相关基因表达数据进行t检验。P>0.05为差异不显著,P<0.05为差异显著。试验数据采用平均值和均值标准误(SEM)表示。

2 结果与分析

2.1 不同浓度DETA/NO处理不同时间对DMECs增殖率的影响

由表2可知,4个不同DETA/NO处理时间(2、4、6、8 h)下细胞增殖率均随DETA/NO浓度的增加而不断降低。DETA/NO处理2 h时,各DETA/NO处理组细胞增殖率显著低于对照组(0 μmol/L组)(P<0.05),600和800 μmol/L组显著低于200和400 μmol/L组(P<0.05),1 000和1 200 μmol/L组显著低于600和800 μmol/L组(P<0.05),各组细胞增殖率均在70%以上。DETA/NO处理4 h时,与对照组相比,200、400和600 μmol/L组的细胞增殖率显著降低(P<0.05);800、1 000和1 200 μmol/L组的细胞增殖率显著低于其他各组(P<0.05),其中1 200 μmol/L组的细胞增殖率为69.42%。DETA/NO处理6 h时,800和1 000 μmol/L组的细胞增殖率分别为69.48%和66.61%,显著低于0、200、400、600 μmol/L组(P<0.05);1 200 μmol/L组为58.60%,显著低于其他各组(P<0.05)。DETA/NO处理8 h时,与对照组相比,各DETA/NO处理组的细胞增殖率均显著降低(P<0.05);800 μmol/L组的细胞增殖率为64.46%,显著低于200、400 μmol/L组(P<0.05),与600和1 000 μmol/L组差异不显著(P>0.05);1 200 μmol/L组的细胞增殖率为52.92%,显著低于除1 000 μmol/L组外的其他各组(P<0.05)。DETA/NO作为应激源时,细胞增殖率降至60%~70%是判断细胞损伤模型建立成功的依据,增殖率过低(0~60%)时细胞活力太低,可能造成不可逆损伤,增殖率过高(70%~100%)时细胞活力太高,损伤程度低[12]。本试验中,DETA/NO处理DMECs 6 h时细胞增殖率在60%~70%,因此选择6 h作为适宜的DETA/NO处理时间进行后续试验研究。
表2 不同浓度DETA/NO处理不同时间对DMECs增殖率的影响

Table 2 Effects of DETA/NO treatment at different concentrations and time on proliferation rate of DMECs %

处理时间
Treatment time/h		 DETA/NO浓度DETA/NO concentrations/(μmol/L) SEM P值
P-value
0 200 400 600 800 1 000 1 200
2 100.00a 89.67b 88.54b 82.87c 80.48c 74.72d 70.75d 1.747 <0.001
4 100.00a 88.00b 86.77b 83.91b 73.48c 71.11c 69.42c 1.682 <0.001
6 100.00a 84.28b 79.67c 74.57d 69.48e 66.61e 58.60f 1.164 <0.001
8 100.00a 81.43b 76.13bc 70.14cd 64.46de 59.18ef 52.92f 2.284 <0.001

同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 不同浓度DETA/NO处理6 h对DMECs氧化应激指标的影响

由表3可知,随着DETA/NO浓度的增加,抗氧化酶活性总体呈逐渐降低的趋势。对于CAT活性,600~1 200 μmol/L组均显著低于对照组(P<0.05),1 200 μmol/L组显著低于800 μmol/L组(P<0.05),1 000和1 200 μmol/L组间差异不显著(P>0.05)。与对照组相比,各DETA/NO处理组的GPx、SOD活性和T-AOC均显著降低(P<0.05),其中GPx活性在各DETA/NO处理组间无显著差异(P>0.05);SOD活性和T-AOC以600~1 200 μmol/L组较低,显著低于400 μmol/L组(P<0.05);SOD活性在800~1 200 μmol/L组间无显著差异(P>0.05);T-AOC在600~1 000 μmol/L组间差异显著(P<0.05),1 000和1 200 μmol/L组间差异不显著(P>0.05)。ROS和MDA含量的结果与上述抗氧化酶活性的变化趋势相反,与对照组相比,各DETA/NO处理组的ROS含量均显著升高(P<0.05),其中800~1 200 μmol/L组间ROS含量无显著差异(P>0.05);与对照组相比,1 000和1 200 μmol/L组的MDA含量显著升高(P<0.05),其他DETA/NO处理组无显著变化(P>0.05)。
表3 不同浓度DETA/NO处理6 h对DMECs氧化应激指标的影响

Table 3 Effects of DETA/NO treatment at different concentrations for 6 h on oxidative stress indicators in DMECs

项目
Items		 DETA/NO浓度DETA/NO concentrations/(μmol/L) SEM P值
P-value
0 200 400 600 800 1 000 1 200
过氧化氢酶
CAT/(U/mL)		 8.01a 7.46ab 7.41ab 7.05b 6.89b 6.59bc 5.94c 0.270 <0.001
谷胱甘肽过氧化物酶
GPx/(U/mg prot)		 116.70a 81.22b 75.39b 74.03b 73.88b 73.22b 70.65b 0.577 <0.001
超氧化物歧化酶
SOD/(U/mL)		 7.62a 6.95b 6.50c 6.06d 5.73de 5.49de 5.47e 0.110 <0.001
总抗氧化能力
T-AOC/(mmol/L)		 0.98a 0.87b 0.83c 0.48d 0.40e 0.35f 0.32f 0.013 <0.001
活性氧
ROS/(荧光强度/mL)		 21.29e 23.72d 26.16c 27.92b 29.06a 29.51a 29.43a 0.368 <0.001
丙二醛
MDA/(nmol/mL)		 1.36cd 1.24d 1.27d 1.41cd 1.46bc 1.62ab 1.66a 0.056 <0.001

2.3 不同浓度DETA/NO处理6 h对DMECs炎症相关指标的影响

由表4可知,与对照组相比,各DETA/NO处理组的IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α含量均显著升高(P<0.05),且随DETA/NO浓度的增加总体呈逐渐升高的趋势,200、400和600 μmol/L组间依次显著增加(P<0.05,600 μmol/L组中IL-2含量除外);800、1 000和1 200 μmol/L组的上述各指标含量和iNOS活性均较高,显著高于200、400和600 μmol/L组(P<0.05,800和1 000 μmol/L组的IL-6含量除外),且800和1 000 μmol/L组的IL-1β、IL-2、IL-6含量差异不显著(P>0.05);iNOS活性在800、1 000和1 200 μmol/L组间依次显著增加(P<0.05);对于1 200 μmol/L组,IL-1β、TNF-α含量与iNOS活性显著高于其他各组(P<0.05),IL-2和IL-6含量与1 000 μmol/L组无显著差异(P>0.05)。随着DETA/NO浓度的增加,IL-4和IL-10含量呈现逐渐降低的趋势;800、1 000和1 200 μmol/L组的IL-4和IL-10含量较低,显著低于对照组(P<0.05),IL-4含量在800、1 000和1 200 μmol/L组间差异不显著(P>0.05),但IL-10含量在这3组间依次显著降低(P<0.05)。
表4 不同浓度DETA/NO处理6 h对DMECs炎症相关指标的影响

Table 4 Effects of DETA/NO treatment at different concentrations for 6 h on inflammation-related indicators in DMECs

项目
Items		 DETA/NO浓度DETA/NO concentrations/(μmol/L) SEM P值
P-value
0 200 400 600 800 1 000 1 200
白细胞介素-1β
IL-1β/(pg/mL)		 5.07f 6.22e 8.21d 8.58c 9.29b 9.28b 10.40a 0.114 <0.001
白细胞介素-2
IL-2/(pg/mL)		 21.93e 27.76d 35.62c 37.13c 40.18b 42.15ab 44.59a 0.683 <0.001
白细胞介素-4
IL-4/(pg/mL)		 6.39a 6.02ab 5.77abc 5.56bc 5.35cd 5.18cd 4.79d 0.205 <0.001
白细胞介素-6
IL-6/(pg/mL)		 14.00e 20.05d 24.28c 26.43b 26.75b 28.00ab 29.32a 0.711 <0.001
白细胞介素-10
IL-10/(pg/mL)		 11.18a 10.04b 10.02b 9.37c 9.16c 8.17d 7.37e 0.145 <0.001
肿瘤坏死因子-α
TNF-α/(pg/mL)		 8.03g 9.43f 11.24e 12.19d 12.97c 13.90b 16.25a 0.200 <0.001
诱导型一氧化氮合酶
iNOS/(U/mL)		 1.57e 1.58e 1.59de 1.63d 1.68c 1.76b 1.94a 0.016 <0.001

2.4 DETA/NO对DMECs抗氧化和炎症相关基因表达的影响

DETA/NO浓度在800~1 200 μmol/L时,DMECs中IL-1β、IL-6、ROS等炎症因子的含量和iNOS活性均较高,GPx和CAT活性则被显著抑制,但考虑到800 μmol/L组在处理6 h时细胞增殖率为69.48%,可能存在炎症损伤程度不稳定的风险,1 200 μmol/L组在处理6 h时细胞增殖率过低(58.60%),因此本研究选定1 000 μmol/L为适宜的DETA/NO处理浓度,对该浓度处理下的DMECs中抗氧化和炎症相关基因表达进行分析。
由表5可知,与对照组相比,1 000 μmol/L组GPx1、CAT和PPARγ的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05),IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB p50和NF-κB p65的mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)。
表5 DETA/NO对DMECs抗氧化及炎症相关基因表达的影响

Table 5 Effects of DETA/NO on expression of antioxidant- and inflammation-related genes in DMECs

项目
Items		 DETA/NO浓度
DETA/NO concentrations/(μmol/L)		 SEM P值
P-value
0 1 000
谷胱甘肽过氧化物酶1 GPx1 1.00a 0.79b 0.037 0.002
过氧化氢酶CAT 1.00a 0.89b 0.017 0.001
白细胞介素-1β IL-1β 1.00b 4.89a 0.480 <0.001
白细胞介素-6 IL-6 1.00b 4.48a 0.286 <0.001
肿瘤坏死因子-α TNF-α 1.00b 6.00a 0.264 <0.001
核因子-κB p50 NF-κB p50 1.00b 1.44a 0.064 <0.001
核因子-κB p65 NF-κB p65 1.00b 1.34a 0.102 0.036
过氧化物酶体增殖物激活受体γ PPARγ 1.00a 0.34b 0.060 <0.001

3 讨论

DETA/NO是一种外源性NO供体,NO是常用的诱导损伤试剂,以其氧化毒性触发细胞氧化损伤,主要通过内源性代谢调控和外源性供体诱导,内源性代谢调控通过使用脂多糖(LPS)等诱导剂,激活iNOS,细胞持续合成NO,降低细胞抗氧化能力[13];外源性供体诱导是通过外源增加细胞培养环境中NO的浓度,模拟体内高浓度的NO病理环境,引发氧化损伤[14]。细胞增殖率可以直接体现细胞活力,反映细胞损伤程度,如前所述,60%~70%的细胞增殖率是判别细胞损伤模型构建成功的依据之一[12]。本试验根据细胞增殖率结果,同时考虑到DETA/NO处理时间不宜过长、浓度不宜过高,将建立DETA/NO诱导DMECs氧化损伤模型的适宜处理时间确定为6 h。赵艳丽等[15]以DETA/NO为应激源,处理BMECs 6 h,细胞增殖率降至70%左右,与本试验中1 000 μmol/L组处理6 h时细胞增殖率在66.61%相近。建立细胞氧化损伤模型不仅需考虑细胞增殖率,还要关注抗氧化酶活性、炎症因子含量及相关基因mRNA的表达情况,以判断其抗氧化水平与抗炎症反应是否发生了显著改变。本试验结果表明,800~1 200 μmol/L的DETA/NO处理DMECs 6 h后,细胞中抗氧化酶活性均显著下降,iNOS活性和炎症因子含量均显著上升,说明该浓度的DETA/NO对DMECs产生了明显的氧化损伤。由于1 000 μmol/L组CAT等抗氧化酶活性相比800 μmol/L组更低,IL-1β等炎症因子含量更高,而1 200 μmol/L组细胞增殖率过低。基于此,本研究仅对1 000 μmol/L组的抗氧化和炎症相关基因表达结果进行了验证,结果发现,相比对照组,1 000 μmol/L组GPx1和CAT的mRNA相对表达量与其对应酶活性、IL-1β和IL-6、TNF-α的mRNA相对表达量与其对应蛋白浓度均呈现相似的变化规律。因此,根据细胞增殖率、抗氧化和炎症相关指标综合评价得出,1 000 μmol/L的DETA/NO作用DMECs 6 h可作为建立NO诱导DMECs氧化损伤模型的适宜处理浓度与处理时间。赵艳丽等[15]研究发现,1 000 μmol/L的DETA/NO处理BMECs 6 h后,GPx等抗氧化酶活性及其基因表达均显著降低。郭咏梅等[9]研究发现,1 000 μmol/L的DETA/NO处理BMECs 6 h后,IL-1β、TNF-α等炎症因子含量和基因表达均显著升高。上述研究结果与本试验结果相一致,进一步表明本试验建立的DETA/NO诱导DMECs氧化损伤模型的可靠性。然而,郑亚光等[10]以200 μmol/L的DETA/NO处理牛外周血单个核细胞4 h作为建模条件,发现SOD等抗氧化酶活性显著降低,IL-1β、TNF-α等炎症因子含量显著升高。由此可见,尽管乳腺上皮细胞来源的物种不同,但高浓度DETA/NO对乳腺上皮细胞的影响存在共性,而不同细胞类型可能对DETA/NO的耐受程度不同,导致建立细胞氧化损伤模型的浓度与时间不尽相同。
关于过量DETA/NO诱导DMECs损伤导致抗氧化能力与抗炎症反应降低的机制,在驴的研究领域尚未见报道。NF-κB信号通路参与细胞免疫和炎症反应,是由p50和p65亚基构成的异源二聚体,静息状态下以非活性形式存在于细胞质中,当细胞受到外界刺激时,该二聚体激活移位入细胞核内,其中p50亚基负责识别和结合DNA上的序列,p65亚基是NF-κB二聚体中的主要转录激活单元[16]。PPARγ作为调控抗氧化和抗炎的关键转录因子,其活性降低意味着细胞自身的保护机制被削弱,无法有效遏制NF-κB驱动的炎症与氧化应激,最终导致细胞内氧化-抗氧化平衡被破坏,使损伤加剧[17]。在对BMECs的研究中发现,NF-κB信号通路的激活会促进iNOS产生NO,NO通过正反馈维持NF-κB信号通路的活性,促进IL-1β等炎症因子的转录和表达[6,18]。在大鼠关节炎模型上的研究发现,炎症因子会在机体中进一步活化NF-κB信号通路,对抗性地抑制PPARγ等抗氧化、抗炎相关通路的激活[17]。本试验中,1 000 μmol/L组iNOS活性和NF-κB p50、NF-κB p65的mRNA相对表达量上调,而PPARγ的mRNA相对表达量下调,提示过量DETA/NO可能通过激活NF-κB信号通路并抑制PPARγ信号通路,加剧了DMECs的炎症与氧化应激水平,引起DMECs的氧化损伤。研究发现,抑制iNOS活性可减少NO的累积,从而减轻人乳腺上皮细胞的炎症反应,减少ROS生成,而激活iNOS活性则会上调NF-κB的蛋白表达[19],这与本试验中氧化损伤DMECs中NF-κB p50和NF-κB p65的mRNA相对表达量提高的结果一致。此外,NO及其衍生物过氧亚硝酸盐是强力的氧化剂,同时能够引起DNA损伤,可能诱导细胞凋亡,导致细胞损伤[20]。因此,针对过量NO诱导DMECs引起氧化损伤的机制还需要进一步研究探讨。

4 结论

1 000 μmol/L的DETA/NO处理细胞6 h可成功构建DMECs的氧化损伤模型,引起细胞氧化应激,使ROS含量升高,GPx等抗氧化酶活性及其mRNA相对表达量、PPARγ的mRNA相对表达量下降,IL-1β等炎症因子含量及其mRNA相对表达量、NF-κB p50和NF-κB p65的mRNA相对表达量升高。

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